PCR基因扩增仪培训课件
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pcr培训ppt课件
实验操作人员应接受专业培训，熟悉安全操作规程，避免在实验过程 中受伤或感染。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
PCR实验室的生物安全培训课件
PCR实验室生物安全定义
定义
PCR实验室的生物安全是指通过采取一系列措施，确保实验室操作过程中产生 的微生物、化学和物理危害被有效控制，以保障实验室工作人员、环境和公众 的安全。
目的
确保实验室工作人员在操作过程中遵循正确的生物安全规程，防止病原微生物 的传播和扩散，降低对环境和公众健康的潜在风险。
紧急联络方式
实验人员应掌握实验室紧急联络方式，以 便在发生紧急情况时及时报告并寻求帮助
。
紧急处置流程
实验人员应熟悉紧急处置流程，如发生意 外暴露或化学品泄漏时，应立即采取相应 的紧急措施，如冲洗、上报等。
个人应急物资
实验人员可根据需要配备个人应急物资， 如急救包、灭火器等，以便在紧急情况下 进行自救和互救。
高压蒸汽灭菌器
实验室应配备高压蒸汽灭菌器，用于 对实验材料和器具进行灭菌处理，以 消除潜在的生物危害。
警示标识
实验室应设置明显的警示标识，告知 实验人员注意生物安全事项，并按照 规定进行操作。
应急处理措施
应急预案
实验室应制定应急预案，包括意外暴露、 化学品泄漏、火灾、地震等突发事件的应
对措施，并定期进行演练。
PCR实验室生物安全防护措施
个人防护装备
防护服
实验人员需穿着符合要求的防 护服，包括实验服、隔离衣、 围裙、鞋套等，确保全身覆盖
，防止污染。
护目镜和面罩
实验人员在操作过程中需佩戴 护目镜或面罩，防止飞溅物、 气溶胶等对眼睛和面部造成污 染。
手套
实验人员需佩戴合适的手套， 如一次性乳胶手套或丁腈手套 ，以防止直接接触污染物。
生安全至关重要。
国内外生物安全现状与法规
国内法规
我国政府高度重视生物安全问题，制定了一系列相关法规和标准，如《病原微生物实验室 生物安全管理条例》、《实验室生物安全通用要求》等，规范和加强了PCR实验室的生物 安全管理。
pcr ppt课件教程
引物二聚体
总结词
引物二聚体是指引物之间形成的二聚体，影响PCR扩增效率。
详细描述
引物二聚体的形成可能由于引物设计不当、引物浓度过高、退火温度过低等原因 导致。为解决这一问题，可以优化引物设计，降低引物浓度，适当提高退火温度 等措施。
05
PCR 实验设计
选择合适的引物
引物长度
根据基因序列选择合适的引物长度， 通常为18-30bp。
设置PCR 仪温度循环
设置变性温度
将PCR仪温度设置为95℃，进 行变性处理，使DNA双链解开
成单链。
设置退火温度
根据引物特异性，设置适当的 退火温度，使引物与单链DNA 结合。
设置延伸温度
设置适当的延伸温度，使DNA 聚合酶从引物起始合成DNA链 。
设置循环数
根据实验目的和DNA片段大小 ，设置适当的循环数，确保目
PCR PPT课件教程
目录
• PCR 简介 • PCR 原理 • PCR 实验步骤 • PCR 常见问题与解决方案 • PCR 实验设计 • PCR 数据分析
01
PCR 简介
PCR 定义
• 聚合酶链式反应（PCR）：一种在生物体外复制特定DNA的分子生物学技术，通过DNA聚合酶的作用，以一对寡核苷酸引 物定向导引下完成特定DNA的片段扩增。
在PCR中，DNA的复制是通过特定的引物和聚合酶，在特定的温度和循环次数下完 成的。
引物与模板DNA结合后，聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链。
聚合酶与引物
聚合酶是生物体内负责DNA复 制的酶，具有耐高温的特性。
在PCR中，常用的聚合酶有Taq 酶和Tfl酶等。
引物是人工合成的短片段DNA ，能够与目标DNA特异性结合 ，为聚合酶提供起始点。
PCR详细讲解PPT课件
2021/3/7
CHENLI
26
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
29
引物设计的基本原则
3、引物长度一般为18-30个碱基之间。
引物长度与反应的特异性和解链温度成
正相关。
过短：扩增特异性下降 过长：引物自身形成二级结构，以及引物二 聚体。
2021/3/7
CHENLI
30
引物设计的基本原则
4、G+C含量一般为40%-60%
引物的碱基组成也会对引物的解链温度 产生影响。
2021/3/7
CHENLI
68
退火温度与时间取决于引物的 碱基组成、长度和浓度。退火温度 可以通过计算推断，通常采用温度 梯度PCR的方法进行摸索。
PC1-P20 退火温度摸索
45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M
CHENLI
8
低温退火
2021/3/7
CHENLI
9
中温延伸
2021/3/7
CHENLI
10
2021/3/7
CHENLI
11
2021/3/7
CHENLI
12
2021/3/7
CHENLI
13
• 理论：2n递增（n为循环次数）， 如果扩增30循环，目标DNA可增加 230也就是109倍。
PCR技术培训讲座PPT课件
第10页/共46页
短柄圆环探针荧光PCR原理
分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷 酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区： 一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎 干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中 可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般 连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶 氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论， 中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光 基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。
第14页/共46页
试剂盒组成
1、痰DNA提取液 2、PCR反应液
结核引物1和2、结核探针、 TaqE、缓冲液 （10mmol/L Tris-HCl） 、dNTP、内参照 模板、内参照引物1和2、内参照探针、石蜡 油 3、PCR增强剂：MgCl2 4、强阳性对照：结核杆菌阳性质粒（或卡介苗） 5、弱阳性对照：结核杆菌阳性质粒（或卡介苗） 6、阴性对照：超纯水
2 、 活 性 对 比 ： 待 测 Ta q 酶 与 对 照 Ta q 酶 做 对 比 实 验 ， 测 定 室 内 质 控 品 B 、 G 系 列 ， B 系 列样品全部为阴性，荧光强度在，50以下；G系列样品应能测出1fg/ul DNA，待测酶 与对照酶测定100fg/ul DNA的相对荧光强度均值相比波动不超过±15％。
第20页/共46页
荧光PCR试剂盒检测结果
第21页/共46页
第22页/共46页
第23页/共46页
3种方法检测痰标本结果
组别 肺结核
涂片
+ + -
短柄圆环探针荧光PCR原理
分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35个核苷 酸。在结构上，分子信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区： 一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特异结合；（2）、茎 干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中 可发生可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般 连接在5ˊ端；淬灭基团一般连接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶 氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster理论， 中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光 基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。
第14页/共46页
试剂盒组成
1、痰DNA提取液 2、PCR反应液
结核引物1和2、结核探针、 TaqE、缓冲液 （10mmol/L Tris-HCl） 、dNTP、内参照 模板、内参照引物1和2、内参照探针、石蜡 油 3、PCR增强剂：MgCl2 4、强阳性对照：结核杆菌阳性质粒（或卡介苗） 5、弱阳性对照：结核杆菌阳性质粒（或卡介苗） 6、阴性对照：超纯水
2 、 活 性 对 比 ： 待 测 Ta q 酶 与 对 照 Ta q 酶 做 对 比 实 验 ， 测 定 室 内 质 控 品 B 、 G 系 列 ， B 系 列样品全部为阴性，荧光强度在，50以下；G系列样品应能测出1fg/ul DNA，待测酶 与对照酶测定100fg/ul DNA的相对荧光强度均值相比波动不超过±15％。
第20页/共46页
荧光PCR试剂盒检测结果
第21页/共46页
第22页/共46页
第23页/共46页
3种方法检测痰标本结果
组别 肺结核
涂片
+ + -
实验三PCR扩增制备目的基因PPT课件
生物信息学分析
利用生物信息学软件对PCR产 物进行序列比对、基因注释、
结构预测等分析。
结果解读与讨论
目的基因扩增成功与否
杂带和引物二聚体的处理
根据电泳结果判断目的基因是否成功扩增 ，如果没有扩增出目的基因或扩增效果不 佳，需要检查实验条件和引物设计。
如果电泳结果显示有杂带或引物二聚体， 需要优化PCR条件或重新设计引物，以确保 获得更纯净的目的基因产物。
10×PCR Buffer
04 提供PCR反应所需的离子环境
。
DNA模板
05 含有目的基因的DNA片段。
去Hale Waihona Puke 子水稀释PCR反应体系。06
设计引物
01
02
03
04
引物设计原则
选择合适的引物，确保引物与 目的基因的特异性结合，避免
非特异性扩增。
引物长度
通常为15-30个碱基。
引物序列
根据目的基因序列，利用引物 设计软件进行设计。
pcr 技术的应用领域
01
02
03
遗传疾病的诊断
通过PCR技术可以检测出 人类基因突变，从而对遗 传疾病进行诊断。
病原微生物检测
PCR技术可以快速、准确 地检测出细菌、病毒等病 原体，为疾病预防和控制 提供有力支持。
基因克隆和表达
通过PCR技术可以克隆出 目的基因，并在体外进行 表达和纯化，为基因工程 研究和应用提供基础。
05
pcr 扩增实验结果分析
结果分析方法
琼脂糖凝胶电泳
通过观察电泳结果，判断PCR 产物的大小是否与预期一致， 并判断是否有杂带或引物二聚
体。
测序验证
将PCR产物进行测序，与预期 的基因序列进行比对，验证 PCR产物的准确性。
利用生物信息学软件对PCR产 物进行序列比对、基因注释、
结构预测等分析。
结果解读与讨论
目的基因扩增成功与否
杂带和引物二聚体的处理
根据电泳结果判断目的基因是否成功扩增 ，如果没有扩增出目的基因或扩增效果不 佳，需要检查实验条件和引物设计。
如果电泳结果显示有杂带或引物二聚体， 需要优化PCR条件或重新设计引物，以确保 获得更纯净的目的基因产物。
10×PCR Buffer
04 提供PCR反应所需的离子环境
。
DNA模板
05 含有目的基因的DNA片段。
去Hale Waihona Puke 子水稀释PCR反应体系。06
设计引物
01
02
03
04
引物设计原则
选择合适的引物，确保引物与 目的基因的特异性结合，避免
非特异性扩增。
引物长度
通常为15-30个碱基。
引物序列
根据目的基因序列，利用引物 设计软件进行设计。
pcr 技术的应用领域
01
02
03
遗传疾病的诊断
通过PCR技术可以检测出 人类基因突变，从而对遗 传疾病进行诊断。
病原微生物检测
PCR技术可以快速、准确 地检测出细菌、病毒等病 原体，为疾病预防和控制 提供有力支持。
基因克隆和表达
通过PCR技术可以克隆出 目的基因，并在体外进行 表达和纯化，为基因工程 研究和应用提供基础。
05
pcr 扩增实验结果分析
结果分析方法
琼脂糖凝胶电泳
通过观察电泳结果，判断PCR 产物的大小是否与预期一致， 并判断是否有杂带或引物二聚
体。
测序验证
将PCR产物进行测序，与预期 的基因序列进行比对，验证 PCR产物的准确性。
《基因扩增技术》 PPT课件
采用探究法与演示法进行讲授，激发学生兴趣，使 抽象的理论形象化，突破重点与难点。
探究法揭示PCR反应本质，激发学生对PCR反应的兴趣
salts (ions) Template DNA dNTPs
DNA Polymer
ase
Primers
演示法使抽象的PCR反应 过程形象化
过程
变性
引物退火
1st cycle
四、说教学过程
2.新 课 讲 解
3）PCR临床应用
本部分内容临床实用性强，通过设置职业情景，充分 调动医学检验专业学生的学习热情，极大的激发学生的主 观能动性。
2nd cycle
3rd cycle
DNA 复制
四、说教学过程
2.新 课 讲 解
2）PCR操作过程
本部分内容琐碎，步骤多，为临床实践的基础，采 用原理分析结合演示法进行讲授，让实验过程更加形象、 立体，使复杂问题简单化。
以PCR检验细菌为例，采用演示法结合步骤原理分析 使复杂的实验过程“看得见”。
教学难度大
学生情 况分析
心理状态
部分学生自制 力较差，独立 学习能力弱。
学生特点
课堂纪律好，学 习积极性高，学
习氛围好
二、说学情
本节内容抽象，知识点多，结合对学情的分 析，在本节教学中我会注意将抽象内容变直观 ，多与学生互动，并将知识点进行归纳总结， 使学生在兴趣中“学会、会用”。
三、说教法与学法
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面 开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ……
四、说教学过程
2.新 课 讲 解
1）PCR基本原理
2）PCR操作过程 3）PCR临床应用
探究法揭示PCR反应本质，激发学生对PCR反应的兴趣
salts (ions) Template DNA dNTPs
DNA Polymer
ase
Primers
演示法使抽象的PCR反应 过程形象化
过程
变性
引物退火
1st cycle
四、说教学过程
2.新 课 讲 解
3）PCR临床应用
本部分内容临床实用性强，通过设置职业情景，充分 调动医学检验专业学生的学习热情，极大的激发学生的主 观能动性。
2nd cycle
3rd cycle
DNA 复制
四、说教学过程
2.新 课 讲 解
2）PCR操作过程
本部分内容琐碎，步骤多，为临床实践的基础，采 用原理分析结合演示法进行讲授，让实验过程更加形象、 立体，使复杂问题简单化。
以PCR检验细菌为例，采用演示法结合步骤原理分析 使复杂的实验过程“看得见”。
教学难度大
学生情 况分析
心理状态
部分学生自制 力较差，独立 学习能力弱。
学生特点
课堂纪律好，学 习积极性高，学
习氛围好
二、说学情
本节内容抽象，知识点多，结合对学情的分 析，在本节教学中我会注意将抽象内容变直观 ，多与学生互动，并将知识点进行归纳总结， 使学生在兴趣中“学会、会用”。
三、说教法与学法
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面 开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ……
四、说教学过程
2.新 课 讲 解
1）PCR基本原理
2）PCR操作过程 3）PCR临床应用
PCR核酸扩增仪2解析课件
8
9
30次循环后靶序列扩增的数量 ---（10亿）
10
二、PCR核酸扩增仪工作原理与控温方式
❖ 在PCR反应中需以变性、退火、延伸三种温度为一 个循环，因此，设计PCR基因扩增仪就要能精确控 制温度，这对PCR反应十分关键。
❖ Taq DNA聚合酶的应用大大提高了PCR的效率，无 需在PCR反应过程中反复加入新鲜酶。Taq DNA聚 合酶酶促反应最适温度为70～75℃。
PCR仪温度控制，有：
水浴锅控温
压缩机控温
半导体控温
离心式空气加热控温 12
水浴锅控温
❖ 以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系。 ❖ 样品与水直接无缝接触，控温准确，温度均
一性好，无边缘效应。 ❖ 体积大，自动化程度不高，需人为干预，更
换水浴锅时控温不稳定。
13
压缩机控温
❖ 由压缩机自动控温，金属导热，控温较水浴锅方便， 一台机器便可完成整个PCR流程。但 压缩机故障率 高，边缘效应及温度overshooting现象严重。
❖ overshooting：升温过程中，由于一些加热元件， 比如半导体、金属块本身会积蓄能量，虽然温度探 头探测温度到达了设定温度，但这些积蓄的能量仍 然会传给PCR体系，造成实际的温度高于设定的温 度的现象。
14
半导体控温
❖ 由半导体自动控温，金属导热，控温方便， 体积小，相对稳定性好。
❖ 缺点：仍有边缘效应，温度均一性尚有欠缺， 各孔扩增效率可能不一致，也存在温度 overshooting现象。
1
第一节 PCR基因扩增仪工作原理
一、PCR技术的历史发展及原理 ❖ 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一
种体外DNA扩增技术。在它发明以前，对于检测对象浓 度非常低的标本，人们没有办法用常规方法测定。 1971年，Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述 了PCR方法。 1985年，美国PE-Cetus公司的Kary Mullis等人发明PCR技术。它推动了现代医学由细胞水 平向分子水平、基因水平发展，是DNA测序的基础，它 成为现代分子生物学发展过程中的一座里程碑。
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30次循环后靶序列扩增的数量 ---（10亿）
10
二、PCR核酸扩增仪工作原理与控温方式
❖ 在PCR反应中需以变性、退火、延伸三种温度为一 个循环，因此，设计PCR基因扩增仪就要能精确控 制温度，这对PCR反应十分关键。
❖ Taq DNA聚合酶的应用大大提高了PCR的效率，无 需在PCR反应过程中反复加入新鲜酶。Taq DNA聚 合酶酶促反应最适温度为70～75℃。
PCR仪温度控制，有：
水浴锅控温
压缩机控温
半导体控温
离心式空气加热控温 12
水浴锅控温
❖ 以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系。 ❖ 样品与水直接无缝接触，控温准确，温度均
一性好，无边缘效应。 ❖ 体积大，自动化程度不高，需人为干预，更
换水浴锅时控温不稳定。
13
压缩机控温
❖ 由压缩机自动控温，金属导热，控温较水浴锅方便， 一台机器便可完成整个PCR流程。但 压缩机故障率 高，边缘效应及温度overshooting现象严重。
❖ overshooting：升温过程中，由于一些加热元件， 比如半导体、金属块本身会积蓄能量，虽然温度探 头探测温度到达了设定温度，但这些积蓄的能量仍 然会传给PCR体系，造成实际的温度高于设定的温 度的现象。
14
半导体控温
❖ 由半导体自动控温，金属导热，控温方便， 体积小，相对稳定性好。
❖ 缺点：仍有边缘效应，温度均一性尚有欠缺， 各孔扩增效率可能不一致，也存在温度 overshooting现象。
1
第一节 PCR基因扩增仪工作原理
一、PCR技术的历史发展及原理 ❖ 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一
种体外DNA扩增技术。在它发明以前，对于检测对象浓 度非常低的标本，人们没有办法用常规方法测定。 1971年，Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述 了PCR方法。 1985年，美国PE-Cetus公司的Kary Mullis等人发明PCR技术。它推动了现代医学由细胞水 平向分子水平、基因水平发展，是DNA测序的基础，它 成为现代分子生物学发展过程中的一座里程碑。
某公司PCR系列产品操作培训教材(PPT 57张)
匹基、达安等都是使用直接煮沸法提取的DNA， 可直接使用
使用过柱法试剂盒，比如QIAGENE提取的DNA， 也可以使用
PCR试剂配制
HPV13荧光 1人份量 10人份量 PCR MIX（μl） 17.5 175 Taq 酶（μl） 0.5 5 DNA 模板（μl） 2/人份 2/人份
HPV12+2 1人份量 10人份量
应注意防止爆盖： 金属浴可压重物（冰盒、冰袋等） 水浴应采用螺旋管盖的离心管 确保离心管质量合格
针对男性样本或女性疣体样本（棉拭子样本），先用细胞保存液/ 生理盐水洗脱，收集沉淀，而后与上述操作一致
优点：简单、快捷、方便。 缺点：HPV DNA纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等PCR抑制剂。
DNA质量要求
仪器检测通道选择
HPV13荧光 13种高危型 报告荧光 FAM 淬灭荧光 None
HPV12+2 12种高危型 HPV16
报告荧光 FAM HEX/JOE
淬灭荧光 None None
HPV18
β-globin
ROX/Red 610
Cy5
None
None
STD系列产品
v CT/NG/UU联合检测试剂 盒
扩增曲线
四个阶段
基线 v v v
阈值
Ct值
【DNA】0
基线：扩增曲线的水平部分 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的 默认前15个循环信号作为荧光本底信号
线性图谱
对数图谱
基线 v v v
阈值
Ct值
【DNA】0
默认阈值=基线（背景）信号标准偏差 ×10 缺省设置：3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值 （进入指数期的最初阶段）
使用过柱法试剂盒，比如QIAGENE提取的DNA， 也可以使用
PCR试剂配制
HPV13荧光 1人份量 10人份量 PCR MIX（μl） 17.5 175 Taq 酶（μl） 0.5 5 DNA 模板（μl） 2/人份 2/人份
HPV12+2 1人份量 10人份量
应注意防止爆盖： 金属浴可压重物（冰盒、冰袋等） 水浴应采用螺旋管盖的离心管 确保离心管质量合格
针对男性样本或女性疣体样本（棉拭子样本），先用细胞保存液/ 生理盐水洗脱，收集沉淀，而后与上述操作一致
优点：简单、快捷、方便。 缺点：HPV DNA纯度较差，含有血红素、蛋白、脂类等PCR抑制剂。
DNA质量要求
仪器检测通道选择
HPV13荧光 13种高危型 报告荧光 FAM 淬灭荧光 None
HPV12+2 12种高危型 HPV16
报告荧光 FAM HEX/JOE
淬灭荧光 None None
HPV18
β-globin
ROX/Red 610
Cy5
None
None
STD系列产品
v CT/NG/UU联合检测试剂 盒
扩增曲线
四个阶段
基线 v v v
阈值
Ct值
【DNA】0
基线：扩增曲线的水平部分 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的 默认前15个循环信号作为荧光本底信号
线性图谱
对数图谱
基线 v v v
阈值
Ct值
【DNA】0
默认阈值=基线（背景）信号标准偏差 ×10 缺省设置：3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值 （进入指数期的最初阶段）
PCR基因扩增仪课件
第一节 PCR基因扩增仪的工作原理
由压缩机自动控温，金属导热，控温较水浴锅方 便，一台机器便可完成整个PCR流程。 压缩机故障率高，边缘效应及温度overshooting 现象严重。 升温过程中，由于一些加热元件，比如半导体、 金属块本身会积蓄能量，虽然温度探头探测温度 到达了设定温度，但半导体、金属块上积蓄的能 量仍然会传给PCR体系，造成实际的温度高于设 定的温度，即overshooting。
第四节 PCR扩增仪的应用
一、感染性疾病的分子诊断和研究 二、遗传性疾病的分子诊断和研究 三、恶性肿瘤的分子诊断和研究 四、PCR扩增仪在移植配型上的应用 五、PCR扩增仪在法医学上的应用 六、PCR扩增仪在分子生物学其他领域的应用
第一节 PCR基因扩增仪的工作原理
以不同温度的水浴锅串联成一个控温 体系。 样品与水直接无缝接触，控温准确， 温度均一性好，无边缘效应。 体积大，自动化程度不高，需人为干 预，更换水浴锅时控温不稳定。
第二节 PCR扩增仪的分类与结构
SmartCyclerⅡ荧光定量PCR仪
第三节 PCR扩增仪的性能指标、 操作规程及常见故障的排除
一、PCR扩增仪的性能指标 （一）温度控制 温度的准确性 温度的均一性 升降温的速度 不同模式下的相同温度特性
第三节 PCR扩增仪的性能指标、 操作规程及常见故障的排除
第二节 PCR扩增仪的分类与结构
Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪
Light CycleTM荧光定量PCR仪
第二节 PCR扩增仪的分类与结构
Light CycleTM荧光定量PCR仪结构示意图
第二节 PCR扩增仪的分类与结构
各孔独立控温的定量PCR仪 不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块， 各孔独立控温，适合多指标快速检测。 SmartCyclerⅡ的软件允许一台仪器同时操 作六个样品模块，既满足高速批量要求，又 能灵活运用，还可实现任意梯度反应。 SmartCyclerⅡ上样不如传统方法方便，而 且需要独特的扁平反应管，使用成本较高。
实验五PCR扩增PPT课件
仪器误差
PCR仪器的性能和稳定性对扩增结果至关 重要，应选择性能稳定、精度高的仪器， 并定期进行维护和校准。
06
pcr 扩增实验展望与未来 发展
pcr 技术的发展趋势
自动化与智能化
随着技术的进步，PCR仪器的自 动化和智能化程度将进一步提高，
减少人工操作，提高实验效率。
高通量与快速检测
未来PCR技术将向高通量和快速检 测方向发展，能够同时检测多个基 因或样本，缩短检测时间。
05
pcr 扩增实验注意事项与 误差分析
实验注意事项
实验前准备
确保实验室环境清洁、无污染，实验 器材灭菌处理，实验试剂储存得当， 避免过期或污染。
操作规范
严格遵守实验操作规程，避免交叉污 染和意外事故。
样本处理
确保样本质量，避免样本降解或污染， 按照实验要求进行样本处理。
实验后处理
及时清理实验废弃物，对实验器材进 行清洗和消毒，保持实验室整洁。
将DNA模板进行必要的处理和纯化，以去 除杂质和不必要的片段。
根据反应体系要求，将DNA模板、引物、 dNTPs、Taq酶等试剂加入PCR管中。
PCR扩增程序设置
PCR扩增执行
根据目标DNA片段的特性和扩增要求，设 置PCR仪的扩增程序（包括变性、退火、延 伸等温度设置和循环次数）。
将配置好的PCR反应混合液放入PCR仪中， 按照设定的程序进行扩增。
pcr 技术的原理
PCR技术的基本原理是利用DNA双链复制的原理，在DNA聚 合酶的作用下，以一对寡核苷酸引物为模板，在适宜的温度 和环境下，进行DNA片段的扩增。
pcr 技术的发展历程
pcr 技术的起源
PCR技术最早由美国科学家凯利·穆 利斯在1983年发明，最初被称为“ 穆利斯放大法”。
PCR仪器的性能和稳定性对扩增结果至关 重要，应选择性能稳定、精度高的仪器， 并定期进行维护和校准。
06
pcr 扩增实验展望与未来 发展
pcr 技术的发展趋势
自动化与智能化
随着技术的进步，PCR仪器的自 动化和智能化程度将进一步提高，
减少人工操作，提高实验效率。
高通量与快速检测
未来PCR技术将向高通量和快速检 测方向发展，能够同时检测多个基 因或样本，缩短检测时间。
05
pcr 扩增实验注意事项与 误差分析
实验注意事项
实验前准备
确保实验室环境清洁、无污染，实验 器材灭菌处理，实验试剂储存得当， 避免过期或污染。
操作规范
严格遵守实验操作规程，避免交叉污 染和意外事故。
样本处理
确保样本质量，避免样本降解或污染， 按照实验要求进行样本处理。
实验后处理
及时清理实验废弃物，对实验器材进 行清洗和消毒，保持实验室整洁。
将DNA模板进行必要的处理和纯化，以去 除杂质和不必要的片段。
根据反应体系要求，将DNA模板、引物、 dNTPs、Taq酶等试剂加入PCR管中。
PCR扩增程序设置
PCR扩增执行
根据目标DNA片段的特性和扩增要求，设 置PCR仪的扩增程序（包括变性、退火、延 伸等温度设置和循环次数）。
将配置好的PCR反应混合液放入PCR仪中， 按照设定的程序进行扩增。
pcr 技术的原理
PCR技术的基本原理是利用DNA双链复制的原理，在DNA聚 合酶的作用下，以一对寡核苷酸引物为模板，在适宜的温度 和环境下，进行DNA片段的扩增。
pcr 技术的发展历程
pcr 技术的起源
PCR技术最早由美国科学家凯利·穆 利斯在1983年发明，最初被称为“ 穆利斯放大法”。
分子生物学实验课件 5PCR基因扩增
2020/11/13
作者:蒋华云
PCR Cycle 2
Two single strands of correct length
End cycle 2
2020/11/13
作者:蒋华云
End cycle 3
2020/11/13
作者:蒋华云
End cycle 4
2020/11/13
作者:蒋华云
Following n cycles of PCR there will be No(1+Y)n copies
作者:蒋华云
反应缓冲液
一般含100mmol/L Tris·Cl （20℃下pH8.3-8.8）, 500mmol/L KCl 和0. 1％的明胶，有时候还有适当浓度的Mg2+
Tris·Cl是一种双极性离子缓冲液，主要靠其调节pH，使Taq DNA 聚合酶的作用环境维持偏碱性
KCl有利于引物的退火，但浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活 性
5’
Taq
3’
3’
Taq 5’
Taq synthesises DNA in the 5’ to 3’ direction
2012-3-202020/11/13
课件作者:作蒋者华云:蒋华云
PCR Cycle 1
Extension 72 ℃
Taq copies DNA strand dNTPs
5’ Taq
2020/11/13
作者:蒋华云
Double stranded DNA template
5’
3’
3’
5’
Region to be amplified
2020/11/13
作者:蒋华云
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第一节 PCR基因扩增仪的 工作原理
PCR基因扩增仪的工作关键 DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得 加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂 贵，制约了PCR技术的应用和发展。 从PCR反应基本原理可以看出，PCR基因扩增仪工 作关键是温度控制。
第二节 PCR扩增仪的分类与 结构
荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术 在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针 荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加 通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过 程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析
第二节 PCR扩增仪的分类 与结构
金属板式实时定量PCR仪 可作为普通PCR仪使用 可带梯度功能 可容纳的样本量大，无需特殊耗材 温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条 件难以做到与样品完全一致
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第二节 PCR当扩之增处，仪请联的系分本人类或与网站删除。 结构
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第一节 PC当R之基处，因请联扩系本增人或网站删除。 仪的工作原理
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第二节 PC当R之扩处，增请联仪系本的人或网站删除。 分类与结构
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ABI 7500荧光定量PCR仪
MJ公司Chromo 4荧光定量PCR仪
Bio-rad公司 iCycler荧光定量 PCR仪
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第二节 PCR扩增仪的分 类与结构
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第一节 PCR基因扩增仪的 工作原理
二、PCR技术的原理 体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条 件下引物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs(脱氧 核糖核苷三磷酸)，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引 物，重复 “变性→退火→引物延伸”过程至25-40个循环， 呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。
–
PCR扩增仪的性能指标
• PCR扩增仪的操作规程
4. PCR扩增仪的应用
本文档所第提供一的信节息仅P当供C之参R处考基，之请用因联，系不扩能本作人为或科网学站依删据除，。请勿模仿。文档如有不 增仪的工作原理
一、PCR技术的聚合发酶展链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的
Khorana (1971)等分最最子大早生特提物点出学，核技是酸术能体，将外它微扩可量增看的的作D设N是A想生大：物幅“体增经外加D的。N特A因变殊此性D，，N无A与论复合是制适化，的石P引C中R物的的 杂交，用DNA聚合酶古延生伸物引、物历，史并人不物断的重残复骸该，过还程是便几可十合年成前t凶RN杀A案基中因凶。手”所遗留的 1985年，Kary M毛ull发is在、C皮e肤tus或公血司液工，作只期要间能，分发离明出了一P丁CR点。的MDuNlliAs要，合就成能D用NPAC引R物加 来进行测序工作，却以常放为大没，有进足行够比多对的。模这板也D是N“A而微烦量恼证。据”的威力之所在。 1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链 式反应”的想法。
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内容提要
1. PCR基因扩增仪的工作原理
• PCR技术的原理及发展
• PCR基因扩增仪的工作原理
2. PCR扩增仪的分类与结构
• 定性PCR扩增仪
• 实时荧光定量PCR扩增仪
3. PCR扩增仪的性能指标、操作规程
简单的说，PCR仪就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外 或试管内的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶进行专一 性的连锁复制。目前常用的技术，可以将一段基因复制为原 来的一百亿至一千亿倍。
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第一节
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1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ）， Mullis是第一发明人； 1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同 作者；
1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。
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第二节 PC当之R处扩，请增联系仪本人的或网站删除。 分类与结构
实时荧光定量PCR仪
金属板式实时定量PCR仪
离心式实时定量PCR仪
各孔独立控温的定量PCR仪
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