分子荧光的原理及其应用

Molecular fluorescence spectroscopy概述分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy)又称

为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度

与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光

谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析．光致发光（Photoluminescence）:荧光和

磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时

的发光现象.荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低

振动能级回到基态所发出的辐射。磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基

态所发出的辐射。荧光分析法的特点

★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3

个数量级；★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸收的分子不一定发射荧光或磷光；★试样用量少和方法简便★能提供比;光多的物理参数★应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。

荧光光谱法基本原理分子的激发与失活1.分子的多重态单重态一个所有电子自旋都配

对的分子的电子状态。大多数有

机物分子的基态是单重态。当基

态一对电子中的一个被激发到较

高能级，其自旋方向不会立刻改

变，分子仍处于单重态。三重态有两个电子的自旋不配

对而平行的状态。激发三重态能

量较激发单重态低。1. 激发在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-15秒. 激发

2 去活化过程

激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射

或无辐射跃迁的方式回到基态

☆振动驰豫(Vibrational relaxation)

☆荧光发射(Fluorescence)

☆内部转换(Inter-nal Conversion)

☆体系间跨越跃迁去活化过程

1.激发2.去活化过程荧光强度及影响荧光的因素

荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度

192018年11月总第301期ISSN1672-1438CN11-4994/T

作者简介：安钢力，医学硕士，实验师。聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技

术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一

种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、

易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天

或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医

学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它

的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性

分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增

反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。

人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方

法进行了许多探索研究，直到1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出了一种新的定量试验技术—荧

光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitative PCR, RT-

qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异

性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用

与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模

板的初始浓度，实现了PCR从定性到定量质的跨越，

具有里程碑意义。目前，此项技术已应用于干细胞研

究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检测和传染病研

究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生

物科技等多领域研究中[1]。本文对实时荧光定量PCR

的原理、分类和应用进行阐述。

1 实时荧光定量PCR技术的原理

real-time quantitative PCR技术是指在PCR反应体

系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实

时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行

定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比

较重要。(1)荧光域值(threshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值

荧光有机分子的发光原理是基于分子的电子能级结构和激发态的自发辐射。当荧光有机分子吸收光能时，其电子从基态（低能级）跃迁到激发态（高能级），形成激发态分子。随后，激发态分子通过非辐射性过程（如振动松弛、内部转换等）逐渐回到基态。在这个过程中，一部分激发态分子会通过自发辐射的方式释放出多余的能量，产生发光现象。

具体而言，荧光有机分子的发光原理可以描述如下：

1. 吸收激发：当荧光有机分子处于基态时，它的电子位于最低能级。当分子吸收与分子能级之间的能量差相匹配的光子时，其中一个电子会被激发到一个较高的能级上。

2. 激发态分子：吸收光能后，荧光有机分子中的电子进入激发态，处于一个较高的能级。这个激发态可能是单重态或三重态，取决于电子的自旋状态。

3. 非辐射性过程：激发态分子在短时间内会经历一系列非辐射性过程，如振动松弛和内部转换。这些过程使得分子的能量逐渐下降，并且电子返回到基态的低能级。

4. 自发辐射：在非辐射性过程中，一部分激发态分子通过自发辐射的方式释放出余下的能量。这个过程中，电子从激发态跃迁回到基态，同时释放出光子。这些光子的能量与分子吸收时吸收的光子能量相等或略小，形成可见光的发光现象。

需要注意的是，荧光有机分子的发光强度和寿命与分子的结构、环境和外界因素（如温度、溶剂等）密切相关。通过调控分子结构和环境条件，可以实现对荧光有机分子发光性质的调控和优化，从而在生物成像、光电器件等领域有广泛应用。

1 1 荧光定义

某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。

2 荧光分类

由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。

3 光致荧光机理

某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。

分子受激发过程

在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。

在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态，用Si表示，由此可推出，S0即为基态的单重态，S1为第一跃迁能级激发态的单重态，S2为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用Ti来表示，T1即为第一激发态中的三重态，T2即为第二激发态中的三重态，以此类推。