大孔吸附树脂纯化花椒叶总黄酮的研究

２０１２年第７期　总第３７卷　中国调味品　ＣＨＩＮＡ　ＣｏＮＤＩＭＥＮＴ　试验研究　

大孔吸附树脂纯化花椒叶总黄酮的研究　

杨立琛，李荣　’　姜子涛　

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津３００１３４）　

摘要：通过比较八种大孔吸附树脂的吸附和解吸性能，发现大孔吸附树脂Ｄ１０１对花椒叶黄酮的纯化效　

果最佳。采用动态法对样品液吸附的流速、ｐＨ条件、解吸液乙醇浓度和解吸液流速进行了研究。同时　

采用高效液相色谱法进行分析表征了分离纯化的效果。实验结果表明，大孔吸附树脂Ｄ１０１对花椒叶　

总黄酮的最佳吸附解吸条件为：样品液ｐＨ为４、吸附流速为２　ＢＶ／ｈ、解吸液６Ｏ　乙醇，解吸流速　

２　ＢＶ／ｈ。经纯化后花椒叶黄酮纯度由２３．２　提高到了５６．４％。　

关键词：花椒叶；黄酮；大孔吸附树脂；纯化　

中图分类号：ＴＳ２０２．１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００Ｏ一９９７３（２０１２）Ｏ７一ｏ０３Ｏ—Ｏ６　

Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　Ｒｅｓｉｎ　ｏｆ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　

ｆｒＯｍ　Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍ　Ｌｅａｖｅｓ　

ＹＡＮＧ　Ｌｉ—ｃｈｅｎ，ＬＩ　Ｒｏｎｇ　，ＪＩＡＮＧ　Ｚｉ—ｔａｏ　

（Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　

Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｏｍｍｅｒｃｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３００１３４，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｍａａｒｏｐｏｒｏｕｓ　ｒｅｓｉｎｓ　ｔｏ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍ　

ｌｅａｖｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｅｉｇｈｔ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　ｒｅｓｉｎ　

Ｄ１０１　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅ　ｆｌｏｗ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｐＨ，ｔｈｅ　ｅ—　

ｌｕｔｉｏｎ　ａｇｅｎｔ（ｅｔｈａｎｏ１）ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｗａｓｈｉｎｇ　ｆｌｏｗ　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｂｏｔｈ　ｄｙｎａｍｉｃ　ａｄ—　

ｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ　ｗａｓ　ｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｂｙ　ＨＰＬＣ．Ａｓ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｓｈｏｗｓ　

ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｄ１０１　ｒｅｓｉｎ　ｆｏｒ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗ：ｓａｍｐｌｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｓ　ｐＨ　ｖａｌｕｅ　ｉｓ　４，ａｄ—　

ｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｆｌｏｗ　ｉｓ　２　ＢＶ／ｈ，ｅｌｕｔｉｏｎ　ａｇｅｎｔ（ｅｔｈａｎｏ１）ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　６０　，ａｎｄ　ｗａｓｈｉｎｇ　ｆｌｏｗ　２　ＢＶ／ｈ．　

Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｓｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍ　ｌｅａｖｅｓ　ｗａｓ　ｉｎ—　

ｃｒｅａｓｅｄ　ｆｒｏｍ　２３．２　ｔｏ　５６．４　．　

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍ　ｌｅａｖｅｓ；ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ　ｒｅｓｉｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　

花椒叶为芸香科花椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍ）　

的叶，《日华子本草》中记载，其性味辛，热，具有温中散　

寒，燥湿健脾，杀虫解毒的功能，主要分布于四川Ｉ、山　

西、陕西、甘肃、河北、山东等地，花椒叶营养丰富，是我　

国传统的调味香料和蔬菜［　，。］　

花椒属植物中富含黄酮，　目前已从花椒果皮中分　离出１Ｏ余种黄酮类成分［３］，但花椒叶黄酮的研究应用　

相对较少，范菁华等采用超声波辅助法提取了花椒叶　

中黄酮类化合物并利用Ｄ４０２Ｏ树脂对其纯化，得到纯　

度为１６．９２　的花椒叶黄酮　］。现在已有的纯化黄　

酮的方法很多，如铅盐沉淀法、柱层析法、萃取法等，而　

大孔树脂吸附法是近些年发展起来的新方法，与其他　

收稿日期：２０１２一Ｏ１一Ｏ９　＊通讯作者　

基金项目：天津市高校科技发展基金项目资助（２０１１０６０８）　作者简介：杨立琛（１９８９一），女，硕士研究生，研究方向为食品添加剂。　

一３Ｏ

一　２０１２年第７期　总第３７卷　中国调味品　ＣＨＩＮＡ　Ｃ０ＮＤＩＭＥＮＴ　试验研究　

方法相比，具有吸附速率快、吸附性能好、洗脱剂毒性　

小、生产周期短、树脂再生方便等优点，已在环保、医药　

领域得到了广泛的应用　］。文章将探讨利用大孔吸　

附树脂对花椒叶中黄酮类化合物进行纯化，从而为花　

椒叶的综合利用提供理论依据。　

１　材料与仪器　

１．１　实验材料　

花椒叶采自山西运城，洗净后烘干备用；ＡＢ一８、　

Ｄ１０１、Ｄ４０２０、ＮＫＡ－９、ＡＤＳ－７、ＡＤ　１７、ＡＤ　２１和　８　

八种大孔吸附树脂　南开大学化工厂；甲醇（色谱纯）　

天津市科密欧化学试剂有限公司；水（娃哈哈饮用纯　

净水）　杭州娃哈哈集团有限公司出品；其余试剂均为　

分析纯。　

１．２　主要仪器　

Ｕ－３９ｏｏ紫外可见分光光度计　日本Ｈｉｔａｃｈｉ　

Ｈｉｇｈ—Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＫＱ　２２００Ｂ型超声波　

清洗机昆山市超声仪器有限公司；ＨＺＳ－Ｈ水浴振荡　

器哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；ＭＡＳ－１微　

波萃取仪上海新仪微波化学科技有限公司；ＲＥ　５２—　

８６Ａ型旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；ＬＧＪ－１０冷　

冻干燥机北京松源华兴科技发展有限公司；高效液相　

色谱仪Ａｇｉｌｅｎｔ　１１００　Ｓｅｒｉｅｓ；色谱柱：Ｚｏｒｂａｘ　ＳＢ－Ｃ１８　

（２５０×４．６　ｍｍ，５　ｍ）。　

２　实验方法　

２．１　花椒叶黄酮储备液的制备　

称取２０．０　ｇ花椒叶粉末，以６Ｏ　乙醇溶液为溶　

剂，放人特制的微波玻璃反应器中，在功率５００　Ｗ条　

件下，按１：３０的料液比在７Ｏ℃下用微波萃取仪萃取　

４　ｍｉｎ，提取液过滤，滤液经石油醚萃取３次，去掉石油　

醚层，再于真空旋转蒸发仪中减压旋转蒸发，至花椒叶　

粗提液中无乙醇，冷冻干燥，得到花椒叶粗黄酮的干燥　

粉末。称取花椒叶粗黄酮干粉末０．５　ｇ，用５　ｍＬ无水　

乙醇溶解，并用蒸馏水定容至２５０　ｍＬ容量瓶中，即得　

花椒叶粗黄酮储备液（浓度为２．０　ｍｇ／ｍＬ），为样品液　

备用。　

２．２大孔吸附树脂的筛选　

２．２．１树脂预处理　。］　将大孔吸附树脂于９５　乙醇中浸泡２４　ｈ，用蒸馏　

水洗至无乙醇，然后用５　ＨＣ１溶液浸泡３　ｈ，用蒸馏　

水洗至流出液ｐＨ值为中性，之后用５　ＮａＯＨ溶液　

浸泡３　ｈ，用蒸馏水洗至流出液ｐＨ值为中性，最后用　

蒸馏水浸泡备用。　

２．２．２树脂的静态吸附与解吸　

准确称取经预处理的八种大孔树脂各１．０　ｇ于　

５Ｏ　ｍＬ具塞三角瓶中，加入经稀释后的样品液（浓度为　

１．０　ｍｇ／ｍＬ）２０　ｍＬ，室温下于水浴振荡器中振荡２４　ｈ　

（频率为１３０　ｒ／ｍｉｎ），使之充分吸附，分别扫描经八种　

大孔树脂吸附后上清液在２００～５００　ｎｍ下的吸收曲　

线并按公式（１）计算各树脂对花椒叶粗黄酮的吸附率。　

取以上吸附有花椒叶粗黄酮的八种树脂各１．０　ｇ，　

分别加入６Ｏ　的乙醇２０　ｍＬ，室温下于水浴振荡器中　

振摇１２　ｈ（频率为１３０　ｒ／ｍｉｎ），分别扫描解吸液在２００　

～５ＯＯ　ｎｍ下的吸收曲线并按公式（２）计算解吸率。　

吸附率Ｅ＝　×１００　。　（１）　

解吸率Ｄ：＝＝　兰ｄ＿×ｌＯＯ％。　（２）　

其中Ａ。为样品液在３２８　ｎｍ的吸光度，Ａ　为吸　

附后上清液在３２８　ｎｍ的吸光度，Ａａ为解吸液在　

３２８　ｎｍ的吸光度。　

２．２．３静态吸附动力学曲线的测定　

取浓度为１．０　ｍｇ／ｍＬ的样品液４Ｏ　ｍＬ加入装有　

２．０　ｇ　Ｄ１０１大孔吸附树脂的具塞锥形瓶中，放入水浴　

振荡器中室温振荡，每隔１５　ｍｉｎ测定一次上清液的吸　

光度，以时间为横坐标，吸附量为纵坐标绘制Ｄ１０１大　

孔树脂对样品液的静态吸附动力学曲线。　

吸附量Ｑ（ｍｇ／ｇ）＝　。　（３）　

其中：Ａ。为样品液在３２８　ｎｍ的吸光度，Ａ　为吸　

附后上清液在３２８　ｎｍ的吸光度，Ｃｏ为样品液浓度　

（ｍｇ／ｍＬ），Ｖ为样品液体积（ｍＬ），Ｗ为树脂质量（ｇ）。　

２．３花椒叶黄酮的纯化一动态法　

２．３．１大孔树脂吸附流速的测定　

准确称取按２．２．１方法预处理的Ｄ１０１树脂　

６．０　ｇ，采用湿法装柱。将浓度为１．０　ｍｇ／ｍＬ的样品　

液分别以１．５，２，３　ＢＶ／ｈ不同流速加入到树脂柱中，　

间隔４　ｍＬ收集黄酮流出液，测定其吸光度，以泄漏点　

一３】

一　２０１２年第７期　总第３７卷　中国调味品　ＣＨＩＮＡ　ＣＯＮＤＩＭＥＮＴ　试验研究　

出现最迟为宜。泄漏点指该处黄酮流出液的吸光度为　

样品液吸光度的１／ｌｏ。　

２．３．２大孔树脂吸附的ｐＨ值测定　

将浓度为１．０　ｍｇ／ｍＬ的样品液以２　ＢＶ／ｈ的流速　

加入树脂柱中，间隔４　ｍＬ收集黄酮流出液，测定其吸　

光度，分别研究在ｐＨ为２，４，６，８时大孔树脂对样品　

液的吸附效果。　

２．３．３花椒叶黄酮洗脱液乙醇浓度的测定　

取浓度为１．０　ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ为４的样品液以　

２　ＢＶ／ｈ通过树脂柱，待吸附达到泄漏点后，用不同浓　

度的乙醇溶液洗脱，流速为１　ＢＶ／ｈ，收集不同浓度下　

的洗脱液，扫描其在２００￣５００　ｎｍ下的吸收曲线。　

２．３．４花椒叶黄酮洗脱流速的测定　

取浓度为１．０　ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ为４的样品液以　

２　ＢＶ／ｈ通过树脂柱，待吸附达到泄漏点后，用６Ｏ　９，６的　

乙醇溶液洗脱，每隔相同体积收集洗脱液，测定其吸光　

度，分别绘制在不同流速１，２，３　ＢＶ／ｈ下的洗脱曲线。　

２．４　ＨＰＬＣ检测纯化效果　

按２．３方法，在最佳动态条件下纯化花椒叶粗黄　

酮，将收集的洗脱液除去乙醇后，冷冻干燥得纯化后的　

花椒叶黄酮粉末。用３Ｏ　甲醇溶解纯化后的花椒叶　

黄酮并稀释至０．１　ｍｇ／ｍＬ，ＨＰＬＣ流动相为甲醇　

（Ａ）、水（Ｂ）和５　０Ａ乙酸水溶液（Ｃ），流速为　

ｏ．９　ｍＬ／ｍｉｎ，进样量为１Ｏ　Ｌ，梯度洗脱条件为０～　

８　ｍｉｎ：３０　～３４　Ａ；８～１０　ｍｉｎ：３４　～５Ｏ　Ａ；１Ｏ～　

２２　ｍｉｎ：５０　ｏＡ～７５％Ａ；２２～２５　ｍｉｎ：７５　ＯＡ～８Ｏ　０ＡＡ；２５　

～３Ｏ　ｍｉｎ：８０％～８Ｏ　Ａ；５　乙酸水溶液（Ｃ）一直保持　

１Ｏ　。检测波长为３２８　ｎｍ。　

２．５花椒叶黄酮纯度计算　

分别称取０．１　ｇ纯化前后的花椒叶黄酮粉末，用　

３Ｏ　乙醇溶解并定容至１００　ｍＬ，按谢宗波Ｅ。　的方法绘　

制标准芦丁曲线，并对纯化前后的花椒叶黄酮溶液进　

行显色反应，计算纯化前后花椒叶黄酮的纯度。　

３　结果与讨论　

３．１大孔吸附树脂的筛选