沙门菌属和志贺菌属检验

肠杆菌科的鉴定1、标本要求：1.1 尽量用药前采集标本。

1.2 痰液：病人清晨咳痰于无菌、防漏小塑料盒内，切勿唾液送检。

1.3 尿液：病人留取12h尿液，送检。

1.4 粪便：病人留取粪便5 10g，送检。

1.5 脑脊液及其它无菌体液：用无菌瓶直接送检。

血标本不要冷冻。

1.6 不可接受的标本：干的拭子、蜡盒、未消毒容器、留取24h后的尿或痰、破裂的瓶子、标本泄漏、标本无标签。

2、仪器35℃孵箱、普通光学显微镜3、试剂羊血平皿、麦康凯平皿、硝酸盐培养管、葡萄糖蛋白胨水、葡萄糖酸盐培养管、苯丙氨酸脱氨培养管、氨基酸脱羧培养管、拘橼酸盐培养管、尿素培养管、糖醇发酵管、湖南长沙天地人肠杆菌鉴定板。

4、试验方法及原理：4.1 硝酸盐还原试验：方法：将待检菌接种硝酸盐培养基中，孵育过夜，加入等量A、B液1～3滴，观察结果。

结果：红色为“+”，即还原硝酸盐。

注意点：（1）．培养基不应含亚硝酸盐，以避免假阳性。

（2）．某些肠杆菌还原硝酸盐的能力很强，还原硝酸盐为亚硝酸盐后，进一步将亚硝酸盐分解为氨、氮、氧化氮，造成假阴性。

所以，观察结果时，如无红色出现，应加少量锌粉，仍无色，说明亚硝酸盐进一步分解，硝酸盐反应为阳性。

若加锌粉后出现红色，说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而待检菌无还原硝酸盐的能力，即硝酸盐还原试验阴性。

4.2 甲基红试验方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育过夜，加甲基红试剂1～2滴，观察结果。

结果：红色为阳性，桔黄色为阴性。

4.3 尿素培养基方法：将待检菌穿刺接种于尿素培养基中，孵育过夜，观察结果。

结果：培养基变红为尿素阳性，不变色为阴性。

4.4 拘橼酸盐试验(Simmons法)方法：将待检菌接种于拘橼酸盐培养基中，孵育过夜，观察结果。

结果：有细菌生长培养基变蓝色为阳性，无颜色改变为阴性。

4.5 氨基酸脱羧试验方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养基和对照管中，封石腊油，35℃培养过夜，观察结果。

结果：培养基变紫色为阳性，黄色为阴性。

以呈现2+凝集现象的血清最高稀释倍数作为该血清的凝集效价。

一般认为，伤寒沙门菌O抗体凝集价在1：80以上，H抗体在1：160以上，甲、乙、丙型副伤寒沙门菌凝集价在1：80以上才有诊断意义。

注意事项
1．加入诊断菌液时，由对照管开始往前，每管各加O．5ml。

2. 结果观察时不要振荡试管，先观察，必要时再轻摇试管使凝块从管底升起，最后按液体的清浊，凝块的大小进行记录，对照管(不凝集)与试验管同时对着光线往暗处看液体透明度和凝集块。

3.“H”凝集呈絮状，以疏松之大团铺于管底，轻摇试管即能荡起，而且极易散开。

4．“O”凝集呈颗粒状，以坚实凝片沉于管底，轻摇试管不易荡起，且不易散开。

文件页码：1/21．概述沙门菌属是一类分布广泛、血清型较多、抗原复杂的肠道病原菌，分为6个亚属、2200种以上的血清型。

伤寒沙门菌属亚属I，多价O抗血清D群，是临床上最为重要的沙门菌。

2. 标本类型粪便、血液等标本。

3. 鉴定3.1 形态与染色革兰阴性杆菌，菌体细长。

有周鞭毛。

3.2 培养特性在麦康凯琼脂平板上35℃培养18～24小时，形成无色、透明的菌落。

SS 琼脂平板上呈无色、透明菌落，但大部分菌落中央呈黑色（产H2S）。

3.3 生化反应氧化酶试验阴性，发酵葡萄糖，不发酵乳糖，三糖铁琼脂（TSI）为K/A，动力、赖氨酸脱羧酶和硝酸盐还原试验阳性，大多数菌株H2S试验阳性，IMViC-+--或-+-+。

3.4 鉴别要点3.4.1 本菌属特征选择SS平板上无色透明、半透明或中心黑色的菌落，TSI为K/A，H2S阳性或阴性，动力试验阳性，，IMViC-+--或-+-+，氧化酶、脲酶试验阴性。

符合上述特征者，可通过血清凝集试验作出诊断。

3.4.2 与志贺菌属的鉴别少数伤寒沙门菌在TSI上H2S阴性，动力不明显，易与志贺菌属相混淆，可用血清凝集试验相鉴别。

3.5 操作步骤3.5.1 观察菌落特征，挑取可疑菌落，做TSI试验。

参见《三糖铁试验标准操作规程》。

3.5.2 血清学鉴定参见《沙门菌血清学检测标准操作规程》。

3.5.3 鉴定从SS琼脂平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。

4. 药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》。

5. 质量控制参见《质量管理程序》。

6. 检验结果解释与分析沙门菌属的鉴定应依赖于传统或商品化系统生化反应和血清学两种方法。

若生化反应符合沙门菌，但A-F多价血清不凝集，首先考虑是否存在表面抗原（Vi抗原），因为Vi抗原能阻断O抗原与相应抗体发生凝集，加热可将其破坏。

应将细菌制成菌悬液，放入沸水中加热15-30分钟，冷却后再次做凝集试验。

若去除Vi抗原后仍不凝集，此时应考虑是否为A-F以外菌群，应送专业实验室进行鉴定。

《医学微生物学》三大常规的微生物学检查从临床标本中分离细菌的目的是为疾病的病原学做诊断，或查找与疾病相关的微生物，以及对抗生素的敏感性，这对于临床诊断、治疗、预后和进行流行病学调查是很有价值的。

因此，对临床标本的处理和检测应掌握以下原则。

1．临床标本的正确采集和处理对于疾病的正确诊断关系很大。

病人标本一般应在应用抗菌药物前采集。

对血液、脑脊液或穿刺液等标本，应严格按照无菌技术进行采集；对鼻咽拭子、肛拭子、粪便等标本，虽无须严格无菌操作，但也应尽量避免杂菌混入。

2．采集容器上应贴好送检号及病人姓名的标签，连同检验单一起尽早送检验室。

若路途较远，应冷藏保存送检；对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等特殊标本，送检时应35℃～37℃保温。

3．人体很多部位与外界相通，存在有正常菌群，但不致病，故在涂片检查或分离培养时，应区别标本中是常居菌群的污染还是致病菌。

另外，对某些无菌的部位，如血液、骨髓、脑脊液等，如检查出细菌应视为致病菌，但必须要排除采样及操作中的污染。

4．根据标本来源和可能存在的病原菌，选定各种分离培养基和孵育环境。

如痰标本一般选用血平板，用于化脓性链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌等的分离。

【血液标本检查】正常人的血液是无菌的。

当细菌侵入血流并在其中生长繁殖，产生毒素等，可引起菌血症或败血症。

细菌学检验对其诊断和治疗具有极其重要的意义。

一、标本采集l．标本采集必须严格遵守无菌操作，即应去除皮肤上的细菌，又应注意空气中的细菌。

穿刺部位以碘酒、酒精棉球消毒，用干燥的灭菌注射器抽取血液，立即注入选定的液体培养基瓶内，充分混匀以防凝固。

2．采血一般应在治疗前，并在高热、寒战时作培养。

伤寒在发病一周内即菌血症期间采血；化脓性脑膜炎，鼠疫应在发热1～2d内采血；亚急性细菌性心内膜炎也宜于发热高峰采血或多次采血，且每隔1～2h采血一次，连续3～4次，可获较高的阳性率。

3．采血量应相当于培养液的1／10，通常是50ml培养液采血5ml，这样可使存在于血液中的补体、抗体、调理素、溶菌酶等抑制因子被稀释，使之减弱或失去抑制作用。

肠杆菌科及检验● 考点概述概念；命名与分类原则；共同特点；自然与人体内的分布；微生物学检查方法；临床意义。

埃希菌属、沙门菌属、志贺菌属、变形杆菌属、耶尔森菌属及其他肠杆菌科细菌。

生物学性状；微生物学检验；临床意义。

【内容讲解】一、概述（共性）肠杆菌科是由多个菌属组成，G-杆菌，生物学性状相似。

大多数肠道杆菌属于正常菌群。

当机体免疫力降低或侵入肠道外组织时成为条件致病菌而引起疾病。

部分为致病性细菌。

（一）分类肠杆菌科细菌的种类繁多。

主要根据细菌的形态、生化反应、抗原性质以及核酸相关性进行分类。

根据《伯杰系统细菌学手册》（1984年）将肠杆菌科的细菌分为20个属即埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、哈夫尼亚菌属、爱德华菌属、普罗威登斯菌属、变形杆菌属、摩根菌属、耶尔森菌属等。

（二）生物学特性1.形态与染色G-，杆菌，大小为（1.0～6.0）μm×（0.3～1.0）μm。

多数有周鞭毛（除志贺菌属、克雷伯菌属、鼠疫耶尔森菌和EIEC），无芽胞，少数菌属细菌可形成荚膜。

2.培养需氧或兼性厌氧；营养要求不高；普皿和麦康凯培养基：中等大小、表面光滑的菌落；液体培养基：混浊生长。

3.生化反应发酵葡萄糖产酸、或产酸产气；乳糖发酵试验：非致病菌 +，致病菌 -（除外变形杆菌）。

触酶阳性；氧化酶阴性；硝酸盐还原为亚硝酸盐。

4.抗原构造表面抗原（如Vi抗原、K抗原）：包绕在O抗原外的不耐热的多糖抗原，可阻断O抗原与相应抗体之间的反应，加热处理能破坏其阻断作用。

5.变异菌落S～R变异鞭毛H～O变异耐药性变异生化反应性质的改变6.抵抗力不强。

加热60℃，30分钟即被杀死。

不耐干燥，对一般化学消毒剂敏感。

对低温有耐受力，能耐胆盐。

7.肠杆菌科的初步分类（三）致病性1.致病性肠道杆菌：以肠内感染为主，腹泻为共显症状，引起急慢性肠道感染、食物中毒、旅游者腹泻及肠热症等。

2.条件致病菌：为医院感染主要病原菌，出现移位感染。