细菌悬液两种计数方法的比较

实验十一稀释平板计数法实验目的学习稀释平板菌落计数的基本原理和方法。

实验内容用稀释平板菌落计数法对菌悬液进行计数。

实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。

统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。

但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。

因此平板菌落计数的结果往往偏低。

为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。

实验器材酿酒酵母菌悬液马铃薯培养基1m1吸管，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。

实验步骤1．无菌器材的准备(1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。

(2) 无菌移液管的准备：取1m1移液管，在后部管口处用铁丝塞入棉花少许（长约1~1.5cm ），以防将菌液吸出，同时也可避免将外面的微生物吹入。

棉花要塞得松紧适宜吹时能通气但不使棉花滑下为准。

然后将移液管尖端放在4~5cm宽的长纸条一端呈45º角折叠纸条包住尖端，用左手捏住管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前滚动，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条折叠打结后干热灭菌。

(3) 无菌水：取6支试管，分别装入4.5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。

2．样品稀释液的制备(1) 编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。

另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

微生物生长的测定方法作者：刘华来源：《神州·下旬刊》2013年第02期摘要：微生物生长情况可以通过测定单位时间里微生物数量或生物量（biomass）的变化来评价。

通过微生物生长的测定可以客观地评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响，或评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制（或杀死）作用的效果，或客观地反映微生物生长的规律。

因此微生物生长的测量在理论上和实践上有着重要的意义。

关键词：微生物测定方法计数法生理指标法微生物生长的测定有计数、重量和生理指标等方法。

1、计数法此法通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。

计数法又分为直接计数和间接计数两类。

⑴直接计数这类方法是利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

此法的缺点不能区分死菌与活菌。

计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积l mm2和高0.1mm的计数室，在1mm2的面积里又被刻划成25个（或16个）中格，每个中格进—步划分成16个（或25个）小格，但计数室都是由400个小格组成。

将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计算4-5个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品所含的细菌数。

每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数×400×l000×稀释倍数⑵间接计数法此法又称活菌计数法，其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。

将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.2ml 故人无菌平皿，再倒人适量的已熔化并冷至45℃左右的培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放人适宜温度的培养箱或温室培养，长出菌落后，计数，按下面公式计算出原菌液的含菌数：每毫升原菌液活菌数=同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×稀释倍数×5此法可因操作不熟练造成污染，或因培养基温度过高损伤细胞等原因造成结果不稳定。

三种细菌计数方法的比较细菌计数是微生物学中一项重要的实验技术，用于确定细菌菌群的数量。

在微生物学研究、医学和食品工业等领域中，细菌计数方法的准确性和可行性非常关键。

目前，常用的三种细菌计数方法包括直接计数法、密度计数法和滴定计数法。

本文将对这三种方法进行比较，包括原理、优缺点和适用范围。

直接计数法是通过显微镜观察，直接计算视野中的细菌数量来进行计数的方法。

该方法简单快捷，不需要进行培养过程。

其中，常用的直接计数方法有暗视野法、荧光显微镜法和流式细胞术。

这些方法可以直接观察到不同形态和大小的细菌，并且可以获得准确的结果。

此外，直接计数法还可以用于测定活菌和死菌的比例，对于评估细菌的生物活性非常有用。

然而，直接计数法对设备要求较高，需要专业的显微镜和技术操作，而且适用于底浓度的细菌样本。

与直接计数法相比，密度计数法是细菌计数中常用的一种方法。

该方法通过将细菌样本适当稀释至能观察到单个菌落形成的数量范围，并在琼脂培养基上培养并计数菌落的数量来确定细菌的数量。

密度计数法的优点是适用于各种样品类型，并且可以进行定量计数。

此外，该方法还可以通过调整稀释倍数来适应不同细菌的菌落形成能力。

但是，密度计数法需要进行培养过程，时间较长，并且无法区分活菌和死菌。

滴定计数法是通过逐渐稀释细菌悬液，将其滴定到琼脂培养基上，然后通过滴定液的颜色变化或者生长的细菌落的数量来确定细菌的数量。

与密度计数法类似，滴定计数法也需要进行培养过程。

但是，滴定计数法具有简单、快捷、经济的特点。

同时，滴定计数法可以通过改变滴定液浓度来适应不同样本中细菌的菌落形成能力，并且可以计算出细菌的最概然数。

然而，滴定计数法对于有颜色的样本适用性较差，因为颜色会干扰滴定液的颜色变化。

此外，滴定计数法无法区分活菌和死菌。

综上所述，三种细菌计数方法各自有其优点和局限性。

直接计数法可以获得准确的结果，适用于底浓度的细菌样本，但要求设备和技术较为专业。

密度计数法能够进行定量计数，适用于各种样品类型，但需要进行培养过程。

测定细菌数量的方法细菌是一种微生物，它们广泛存在于自然界中的各种环境中，包括土壤、水体、空气以及人和动物的体内。

测定细菌数量在许多领域中都具有重要的应用，例如医学诊断、食品安全、环境监测等。

本文将介绍几种常见的测定细菌数量的方法。

1.直接计数法直接计数法是最基本的测定细菌数量的方法之一、该方法利用显微镜观察细菌悬液中的细菌数量，并通过数学方法计算出相应的浓度。

直接计数法需要专业的显微镜和显微镜计数室，比较繁琐且耗时，但是结果较为准确。

2.厌氧培养法厌氧条件下的细菌繁殖速度较慢，通常需要较长时间才能形成可见的菌落。

利用厌氧培养法可以通过观察培养基上细菌形成的菌落数量来测定细菌数量。

该方法适用于对厌氧条件下的细菌进行测定。

3.过滤法过滤法是利用特定的滤膜或滤片来筛选细菌，并将细菌附着在滤膜上。

通过将滤膜放置在含有营养成分的培养基上，细菌可以在培养基上生长。

最后，可以通过观察滤膜上的菌落数量来测定细菌数量。

过滤法适用于水样、空气样以及其他液体样品。

4.光密度法光密度法是利用细菌悬液的浑浊程度来测定细菌数量的一种方法。

当细菌繁殖增多时，细菌悬液的浑浊度也会增加。

可以使用光密度计来测量细菌悬液的浑浊度，然后通过校正曲线来计算细菌数量。

5.蛋白质测定法细菌在生长过程中会合成蛋白质。

通过检测培养液中的蛋白质含量，可以间接测定细菌数量。

该方法适用于较大规模的细菌培养，可以通过常规的蛋白质测定方法来进行测定。

6.PCR方法PCR（聚合酶链反应）是一种利用DNA复制技术来测定细菌数量的方法。

通过选择特异性的引物和荧光探针，可以选择性扩增目标细菌的DNA 并进行测定。

PCR方法具有高度的灵敏性和特异性，适用于检测特定种类的细菌。

综上所述，测定细菌数量的方法有很多种，选择合适的方法取决于实际应用的要求、样品特性以及实验条件等因素。

不同的方法各有优缺点，研究人员需要根据具体情况选择适当的方法来进行细菌数量的测定。

人教(2019)生物选择性必修三(学案+练习)微生物的选择培养和计数1．微生物的选择培养(1)选择培养基：将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

(2)稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释后，将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面，进行培养。

①系列稀释操作系列稀释：移液管需要经过灭菌。

操作时，试管口和移液管应离火焰1～2 cm 。

操作过程如下：②涂布平板操作 序号图示 操作 1取0.1 mL 菌液，滴加到培养基表面2将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中 3将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，冷却8～10 s 4用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。

涂布时可转动培养皿，使菌液涂布均匀 ③培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入℃的恒温培养箱中培养1～2 d 。

2．微生物的数量测定(1)稀释涂布平板法①计数原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计数标准：为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。

③计数方法：通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平板。

在同一稀释度下，至少应对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。

④统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计结果一般用菌落数表示。

(2)显微镜直接计数法①计数原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。

②优点：是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。

③缺点：统计的结果一般是死菌数和活菌数的总和。

3．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1．利用稀释涂布平板法和平板划线法均可实现细菌的分离和计数。

(×) 2．培养分解尿素的细菌，培养基的pH会增大。

CFUCFU (Colony-Forming Units)经培养所得菌簇形成单位的英文缩写。

cfu:colonyformineunit,菌落形成单位，将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。

意思就是每毫升菌液中含有多少单细胞！传统上就叫“个”。

但是，我们知道，一个菌落并不一定是一个细菌所生成，也可能是由一簇细菌（一个细菌团）所生成，这时候再叫“个”就不太准确啦，准确的叫法就是“菌落形成单位”，英文缩写“CFU”。

就像“公斤”和“千克”，只是叫法不同，数量上没有变化。

cfu代表“colony forming units”。

cfu/mL指的是每毫升样品中含有的细菌群落总数一显微镜直接计数法（一）目的要求1．明确血细胞计数板计数的原理。

2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

（二）基本原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。

后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。

除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。

显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。

但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。

目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。

本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。

另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。

细菌总数的测定方法
测定细菌总数的方法通常包括以下几种：
1. 显微镜计数法：将待测样品制成适当浓度的悬浮液，然后使用显微镜观察计数。

这种方法常用于观察对显微镜可见的大型细菌。

2. 平板计数法：将待测样品制成适当稀释度的悬浮液，然后在固体培养基上均匀涂布。

经过适当时间后，可数出单个菌落的数量，并根据稀释倍数计算出细菌总数。

3. 涂布计数法：将待测样品制成适当稀释度的悬浮液，通过草屑涂布或涂布棒均匀涂布在固体培养基上。

经过适当时间后，可数出涂布上细菌的总数。

4. 易液化琼脂凝胶计数法：将待测样品制成适当稀释度的悬浮液，与液化琼脂凝胶混合，然后倒入琼脂凝胶平板上固化。

经过适当时间后，可数出液化琼脂凝胶上细菌的总数。

5. 流式细胞仪计数法：将待测样品进行适当稀释后，通过流式细胞仪对样品中的细菌进行单个细胞的计数和分析。

这种方法快速、准确，适用于大批量的细菌计数。

需要注意的是，不同的方法适用于不同类型的细菌和样品，选择合适的方法对准
确测定细菌总数十分重要。

此外，测定细菌总数时需要注意消毒、防止交叉感染等实验操作安全。

初始污染菌计数方法适用性试验方案——供试品释出物的抑菌试验一、试验目的：评估初始污染菌计数方法在供试品释出物的抑菌试验中的适用性。

二、试验原理：初始污染菌计数方法是一种衡量样品中存在的细菌数量的方法。

该方法基于无菌培养基培养出来的菌落数量来评估污染程度。

在该试验中，我们将采用PCDA方法（Plate Count agar Dilution Assay）来测定细菌数量。

三、试验步骤：1.准备培养基：制备PCDA培养基，根据制备指南针对待测菌株适当调整培养基中的成分和浓度。

2.制备细菌悬液：采用细菌培养物或者菌落进行培养，转移到无菌的生理盐水中悬浮液中，均匀搅拌，稀释为一定的浓度。

3.固定试验板：使用已消毒无菌的平板，倒入适量的培养基，等待其凝固。

4.接种菌液：将待测供试品释出物样品取一定体积，在特定条件下和细菌悬液混合，根据需求数量在试验板上均匀涂抹或滴播。

同时设置对照组，不加入供试品释出物，只使用生理盐水或无菌培养基进行涂抹或滴播。

5.培养条件：将试验板置于一定的温度及湿度条件下培养一段时间，通常为24-48小时，根据实际需要在与菌株生长相关培养条件下进行培养。

6.统计菌落数量：根据实验结束后，试验板上形成的菌落数量进行统计，采用比较软件或者手计法进行计数。

7.数据分析：比较供试品释出物样品组和对照组的菌落数量，评估供试品释出物的抑菌效果。

8.重复试验：至少重复3次试验，以确保结果的准确性和可靠性。

四、风险评估与控制：1.使用无菌操作技术和器械，以防止试验过程中的细菌污染。

2.试验区域应保持清洁，避免其他细菌的污染。

3.注意操作培养基和细菌悬液的消耗期限和保存条件。

五、数据处理：比较供试品释出物样品组与对照组的菌落数量，使用适当的统计方法进行数据分析，评估供试品释出物的抑菌效果。

六、结果及讨论：通过对供试品释出物样品组与对照组的菌落数量进行比较，以及对多次试验结果的统计分析，评估初始污染菌计数方法在供试品释出物的抑菌试验中的适用性。

测菌体浓度的方法
测菌体浓度的常用方法主要有以下几种：
1. 直接计数法：这是一种非常简单的检测方法，利用计数板或计数仪直接得出细菌数目。

首先制备细菌悬液，取一定体积的样品细菌悬液置于细菌计数板的计数池内，用显微镜观察计数。

根据计数室刻度内的细菌数，计算样品中的含菌数。

特点为所需设备简单，测定结果较准确，可迅速得到结果，而且在计数的同时能观察到所研究微生物的形态特征。

不能区分是否为细菌，不能区分活细菌和死细菌。

2. 电子计数器计数法：也属于直接计数法，其工作原理类似于血细胞分析仪，测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细菌，当一个细菌通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。

因此，要求菌悬液中不含任何碎片。

3. 活菌计数法：常用的有平板菌落计数法（cfu法），其原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。

如需更多关于“测菌体浓度”的详情，建议查阅生物技术专业相关书籍或文献资料，也可咨询该领域专业人士获取帮助。

高中生物复习-例析菌落等微生物数目统计计数方法的几个常见问题1、从方法上分析菌落数目例 1 ：若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用直接计数;若要测定其活菌数量，可选用法进行计数。

例2 ：Ⅱl号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是。

(参考答案:血细胞计数板稀释涂布平板法稀释涂布平板法)显微镜直接计数法是利用显微镜、血细胞计数板等工具对纯培养悬浮液直接计数来检测样本中的细胞数目。

该方法能直观、快速地检测出单细胞状态下的微生物或丝状微生物所产生的孢子的数目，但是不能区分死细胞和活细胞，不适合细胞密度低的样品。

稀释涂布平板法常常需要先将样品进行一系列的稀释，然后吸取适量稀释样品涂布在平板上，在稀释度适宜的情况下一个菌落是由一个活细胞繁殖形成的，从而通过统计平板上的菌落数来推算活菌数。

该方法能灵敏地检测出样品中的活菌数，但实验过程手续繁、耗时长、影响因素较多。

显微镜直接计数法由于不能区分死菌和活菌，因此计数结果往往比实际活菌数偏高。

为避免把死菌计数在内，可用台盼蓝染色:被染成蓝色的为死菌，反之为活菌。

稀释涂布平板法测定活菌数目的时候，由于相邻两个或多个细胞连在一起，可能形成一个菌落，因此测定值比实际值小。

2、从对照原则上分析菌落数目例3：若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了现象。

若将30(即36-6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法(填“正确”或“不正确”)。

(参考答案∶污染不正确)设置不接种的空白培养基作为空白对照组，证明培养基制备过程中没有被杂菌污染，增强实验的说服力，保证实验结果的准确性。

若该培养基上出现了菌落则说明实验过程出现污染现象，应舍弃数据，查找原因，重做实验。

若为了证明选择培养基有选择作用，对照组往往是完全培养基。