透射电镜生物制样技术

透射电镜生物样本制备流程及注意事项透射电镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）是一种使用电子束而不是光束进行成像的显微镜。

它可以提供高分辨率的图像，因此被广泛应用于生物样本的观察和研究。

然而，由于其特殊的工作原理和生物样本的复杂性，透射电镜生物样本的制备过程需要注意一些关键的步骤和细节。

下面将逐步介绍透射电镜生物样本制备流程及注意事项。

一、样品固定1.选择合适的固定剂：固定剂的选择应根据所研究的样本类型和要观察的细胞结构而定。

常用的固定剂包括戊二醛（glutaraldehyde）、乙酰化亚胺（acrolein）、纤维蛋白素（formaldehyde）等。

2.采取合适的固定时间和固定温度：固定时间和温度应根据固定剂的要求和样本的特性进行优化。

通常情况下，固定时间为数小时至数天，温度在4℃至25℃之间。

3.注意透射电镜样品的固定深度：样品应保持较小的厚度以便透射电子束的穿透。

二、样品剖解1.剖解细胞膜：通常采用超声波振荡或冷冻断裂等方法来剖解细胞膜。

超声波振荡可用于含有细胞膜的细胞或组织，而冷冻断裂则适用于脆弱细胞和膜脂体系。

2.剖解细胞核：利用离心裂解法可以将细胞核分离出来。

离心裂解可分为机械法和渗透法两种，机械法利用高速离心的作用将细胞核分离，而渗透法则是通过渗透剂将细胞核溶胀并破碎。

三、样品固化1.脱水：样品在固定后需要进行脱水处理，以便在后续的步骤中更好地渗透和浸透。

常用的脱水剂有乙醇、丙酮和乙醚等，脱水过程往往需要进行多次重复。

2.浸透：在脱水后，样品需要在树脂中进行浸透，使其固化为坚硬的样品。

通常采用环氧树脂或比较稳定的丙烯酸树脂来进行浸透。

这一步骤通常需要较长时间，如数小时甚至数天。

3.树脂填充：浸透后的样品需要在模具中进行树脂填充，并在适当的温度下进行固化。

树脂填充的过程需要注意排除气泡和避免过度填充。

四、样品切片1.选择合适的切割工具和方法：样品通常使用切片机和切片刀进行切割。

透射电镜生物样品制作过程透射电镜生物样品制作过程大致经过取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤。

一. 取材取材时要注意的要点是：快、小、冷、净、准、避免机械损伤。

取材方法：将固定液滴在冰台上的卡片上，在麻醉后的动物身上快速用剪刀剪取一块组织，用预冷的过的缓冲液将剪下的组织洗净，迅速放到卡片上的固定液中，用刀片切去被镊子夹到和剪刀剪过的组织，后按实验的目的将组织切成0.5~1mm2的立方或横截面为1mm2的长方体。

用牙签将切好的组织块转移到装有固定液的小瓶中，贴好标签并置于4℃的冰箱中。

二．固定以下操作尽可能在4℃的环境下，使用的溶液也要保存在4℃的冰箱中。

1、戊二醛固定：用镊子轻轻的将组织块从固定液中取出，放在卡片上的固定液中，利用双面刀片把组织块切成小块状，放进盛有1~1.5ml的0.1%的戊二醛的固定液的细管中，将吸管放进真空箱中，将大气压抽到760托后取出，使组织块在戊二醛溶液中固定1小时。

2、漂洗：经戊二醛固定的组织块要用1~1.5ml的0.1%PBS缓冲溶液漂洗，漂洗的次数为5次，在漂洗到第四次时可以将组织留在PBS漂洗液中过夜，放入4℃的冰箱中。

第二天早晨再进行第五次漂洗。

3、四氧化锇固定：向漂洗过的组织中加入0.5ml的0.1%四氧化锇固定液，固定时间为2个小时。

由于四氧化锇具有毒性，因此操作在通风橱里进行。

4、漂洗四氧化锇：用0.1%PBS缓冲溶液漂洗剩余的四氧化锇，然后再漂洗两次，其时间间隔为10min。

三．脱水为了保证包埋介质完全渗入组织内部，必须事先将组织内的水分驱除干净，即用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水，常用的脱水剂是乙醇和丙酮。

1、酒精脱水:用浓度梯度依次为30%、50%、70%、90%的酒精，依次浸泡组织，其浸泡的时间一般为10min。

当在70%梯度的酒精时，样品可以放置过夜。

2、丙酮脱水：用浓度梯度为90%、100%的丙酮浸泡组织，在纯丙酮中浸泡三次。

透射电镜制样步骤以及注意事项透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM）是目前最常用的高分辨率电子显微镜，可以用于观察物质的微观结构。

制备TEM样品的过程非常重要，下面将详细介绍TEM制样的步骤以及需要注意的事项。

制备TEM样品的步骤一般包括样品的选择、固定与固化、切片、薄化、网格制备和贴膜等。

第一步是样品的选择，样品应具有研究价值且适合观察。

例如，生物样品可以是细胞、组织或器官的薄片，金属样品可以是扁平的块状、粉末或薄膜等。

第二步是固定与固化。

对于生物样品，常用的固定方法包括浸泡法、灌注法和切片冷冻法；对于无机样品，可以使用固定剂将样品固定在固定剂中。

第三步是切片。

将固定好的样品切割成薄片，一般要求薄片的厚度在100 nm以下，通常使用超薄切片机来进行切割。

第四步是薄化。

将切割好的样品进行薄化处理，使其达到TEM观察所需的薄度。

常见的薄化方法有机械薄化、电化学薄化和离子薄化等。

第五步是网格制备。

将薄化好的样品放置在铜网格上，网格的选取应该根据所研究样品的性质和需要进行选择。

最后一步是贴膜。

将组织切片或带有样品的网格进行贴膜，以保护样品并提高图像的对比度。

在以上步骤中，需要注意的事项有：1.样品在制备过程中要避免受到污染或氧化，尽量在纯净无尘的环境中进行操作。

2.固定剂的选择要合理，不同的样品可能需要使用不同的固定剂，应根据需要进行选择。

3.切片时要注意刀片的尖锐度和切割角度，以免对样品造成损伤或变形。

4.薄化过程中要控制好加工参数，以保证样品的均匀薄化。

5.制作网格时应选择合适的网格尺寸和类型，以适应观察需求。

6.贴膜时要使薄膜均匀平整，并避免出现气泡或杂质。

总之，TEM制样是一项复杂而关键的过程，要保证样品的质量和可观察性，需要仔细选择方法、控制操作参数、注意样品的保护与处理。

合理的样品制备能够获得高质量的TEM图像，并提供准确的实验数据和结论。

透射电镜生物制样透射电镜（Transmission Electron Microscope, TEM）是一种强大的工具，用于研究和观察生物制样，特别是在纳米级别下的细胞和组织结构。

利用透射电镜，科学家可以深入研究生物体内部的微观结构和化学组成，为我们深化理解生命的基本单位提供了巨大帮助。

在生物制样的过程中，首先需要对样品进行固定，以保持其原始的形态和结构。

常用的固定剂包括冷冻与化学固定剂。

冷冻固定将样品迅速冷冻至极低温，以保留细胞的天然形态和水合状态。

化学固定则通过化学反应交联细胞中的分子结构，稳定样品并防止其后续的变化。

固定后，样品需要进行剖面制备。

通常采用超薄切片技术，将样品切割成约70至100纳米厚的薄片。

这一步骤需要高超净实验室环境和专业的技术操作，以确保样品的质量和薄片的均匀性。

之后，透射电镜的操作步骤就开始了。

样品薄片被放置在透明的铜网上，并通过仔细的步骤逐渐加膜、压制，最终制备成为透射电镜样品。

为了提高样品的对比度，在样品制备过程中，常常需要对其进行染色。

例如，使用重金属盐（如铇酸）对样品进行染色，使得不同细胞组分在电镜下有更明显的特征。

在样品制备完毕后，样品会被放置在透射电镜的样品室中。

电子束经过样品，透射到另一端的检测器上。

通过检测电子束的强度和散射情况，透射电镜可以产生高分辨率和详细的图像。

这些图像经过处理和分析，可以揭示出生物样品中微观结构的细节。

利用透射电镜生物制样，可以提供许多重要的信息。

例如，可以观察到细胞的亚细胞结构，如线粒体、内质网和高尔基体等细胞器的详细形态。

还可以研究细胞和组织中的超微结构、蛋白质聚集和聚体、核糖体和核纤维等。

透射电镜也能够帮助科学家研究细胞和组织中的病理变化和与疾病相关的结构异常。

例如，可以观察到病毒的形态和复制过程，深入了解病毒感染的机理。

同时，也可以通过透射电镜观察神经元的超微结构，帮助我们理解神经系统疾病的发病机制。

总之，透射电镜生物制样为生命科学领域提供了研究细胞和组织的有力工具。

透射电镜样品制备方法透射电镜的样品制备方法，需要经过取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。

一．取材的基本要求组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部的各种酶作用，出现细胞器自溶现象。

因此，为了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。

（1）动作迅速，组织从活体取下后应在最短的时间内（1分钟内）投入2.5%戊二醛固定液。

（2）所取组织的体积要小，一般不超过1mm*1mm，取样形状为牙签状。

也可将组织修成1mm*1mm*2-5mm大小长条形。

因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。

（3）机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。

推荐使用手术刀或双面刀片。

（4）操作最好在低温（0℃—4℃）下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。

（5）取材部位要准确。

切片窗小于1mm*1mm，如取样带有太多的多余组织，可能造成你需要的部分刚好被修掉。

二．取材方法（按照自己的样品类型检索）1.动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5 ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官。

用手术刀切割取一小块组织，放在干净的硬质板上（例如培养皿底部），滴一滴冷却的固定液。

用新的、无油污的锋利双面刀片将材料切成大约1 mm宽，3~5 mm长的小块并从中选出受损伤较小的小条（牵拉损伤将直接破坏组织，切取时刀片下压，不要来回拉锯），用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的1.5 ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（0~4℃）4小时或以上。

*固定结束后，将固定液用磷酸盐缓冲液稀释三倍，样品于该溶液中在4℃冰箱保存。

送样前请用磷酸盐缓冲液于4度冰箱浸泡清洗15 min，共3次，做好标记送至电镜室。

送样请使用2 ml离心管，用记号笔在离心管管壁上写好编号，用透明胶带缠绕。

后续管子会接触丙酮和乙醇，一定要用透明胶带缠绕，以防记号被洗掉。

常规透射电镜生物样品制备技术
一、取材：组织块约1mm3，悬浮细胞离心后体积约1 mm3
二、固定：
2.5%戊二醛，4冰箱固定1.5小时或更长时间
用0.1M磷酸缓冲液漂洗20min3次
2%锇酸固定液固定1.5h
用0.1M磷酸缓冲液漂洗5min2次
三、脱水：
30%乙醇5min
50%乙醇5min
70%乙醇10min，可4冰箱过夜。

以上操作在冰盒里进行
80%乙醇15min
95%乙醇15min
100%乙醇（无水硫酸钠处理）20min2次
100%丙酮（无水硫酸钠处理）15min2次
四、渗透：
纯丙酮+包埋液( 1 : 2 )室温1-1.5h
纯包埋液室温过夜
五、包埋：
用812包埋剂将样品包埋在包埋槽
37烘箱内过夜
45烘箱内12h
60烘箱内48h
六、超薄切片机切片70nm
七、2%醋酸铀-柠檬酸铅双染色
八、透射电镜观察，拍片。