农业微生物生物技术

农业微生物生物技术

一．背景

农业包括种植业、养殖业、水产业及农产品加工等各个领域，不仅为人类生存、发展提供食物、能源而且还为工业发展提供原材料等。

可持续农业是指控制农业病虫害破坏程度、提高作物生命力、保持生物多样性、改良农业环境以及采用新式农具等方面的内容，与生态农业密切相关，其中农业微生物在可持续农业中将发挥愈来愈重要的作用。

有些微生物对农业生产有益，如根瘤菌（固氮作用），苏云金芽孢杆菌（微生物杀虫剂——它的主要活性成分是一种或数种杀虫晶体蛋白(ICPs)，又称δ-内毒素，对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等昆虫，以及动植物线虫、蜱螨等节肢动物都有特异性的毒杀活性）等；而有些有害，但二者之间较难区分。例如：茭白，它是一种粮食，被茭白黑粉菌感染后发生黑粉病，植株变短，不能抽穗结实，对以收获为目的的栽培来说是有害的，但这种病变的粗短茭白茎很鲜嫩，可以作为蔬菜食用，因为茭白黑粉菌可分泌一种生长素，刺激茭白细胞膨大。引发水稻恶苗病的赤霉菌感染水稻以后，水稻秧苗又细又长，然后枯萎死去，严重影响水稻的产量，但该病原真菌可产生植物激素赤霉素（具有促进细胞分裂和细胞伸长，促进花芽分化，促进果实与胚生长，促进种子萌发的生理作用），目前采用发酵法生产赤霉素。

固定发酵:保藏菌种—斜面试管活化—液体摇瓶扩大培养—固体发酵生产。

液体发酵:保藏菌种—活化—液体发酵

二．附生微生物

根据微生物生长的部位不同，可分为

（一）根际微生物

土壤组成很复杂，对于微生物来讲属于营养贫乏的环境，其中有机质的含量在0.8～2.0%，大多数的碳以腐殖酸形式存在，微生物难以利用。

植物根际包括跟表面及其周围2mm范围内的区域，在这个区域内，由于根在土壤中生长代谢，向周围释放部分有机质包括氨基酸、单糖、有机酸、根分泌的糖类、酶，根部脱落的细胞或死亡的细胞及根产生的二氧化碳及乙烯等物质。据估计，植物光合作用固定的碳有20%分布在根部，因此根际的环境有利于微生物各种群间的平衡。

根际微生物之间发生复杂的相互关系，，且与植物本身有密切的联系，可刺激植物的非特异性防御反应，从而提高植物抵抗其他病原微生物的能力，还可向植物提供营养元素等物质。

根际微生物类群包括细菌（含放线菌）、真菌（含酵母菌）及原生动物等，多种微生物以微生物生物膜的形式存在于根际，比如根瘤菌属。

（二）叶际微生物

叶际微生物并不仅限于生活在植物叶片上的微生物，还包括生活在幼芽、花等植物地上部分的微生物。因为叶片上细菌数目占有绝对优势，所以多数研究是从此进行的。

叶际微生物群体包括不同种类的细菌、丝状真菌、酵母菌、微藻，有时也发现有原生动物与线虫等。

1.叶际微生物对植物的影响

（1）叶际微生物可改变植物表面的性质

植物表面温度与湿度变化大，且为微生物生长提供的营养极其有限，则叶际微生物可以产生一些具有表面活性剂功能的化合物来增加叶面表皮层的亲水性，使细菌易于向营养丰富的地方游动。

假单胞菌具有产生表面活性剂与丁香霉素的能力，大多数叶际细菌可产生吲哚乙酸，影响植物的生长发育。

叶际的甲基杆菌属可产生细胞分裂素，刺激植物细胞分裂伸长，并可刺激细胞壁释放出甲醇供细菌利用。已发现在大豆叶部应用甲基杆菌属可提高大豆的产量。

（2）叶际微生物的细胞密度变化对叶际微环境的影响

细菌在植物叶面以聚集体形式存在，这样有利于细菌在叶际微环境抵抗不良的环境条件，其中的细菌还可产生细胞外多糖，不仅有利于维持聚集体结构，而且可保护细菌免受干旱与活性氧自由基的影响。

如丁香假单胞菌在干旱与活性氧刺激下，可提高海藻酸合成量，以减轻不利因素对细胞的影响，同时细菌聚集体中高密度的多糖还可向叶际微生物提供营养，这些细菌聚集体通过产生细菌信号物质N-酰化高丝氨酸内酯来调控不同种类细菌的代谢活动，共同适应其生活环境。

（3）病原细菌通过改变叶际微环境而表现出致病性

致病性丁香假单胞菌的致病能力与叶际细菌群体数量有关

2.叶际微生物在生物技术中的应用

（1）苹果火疫病防治菌剂

由解淀粉欧文菌引发的，对苹果和梨的危害最大。在致病菌定殖于花之前，由非致病菌荧光假单胞菌菌株A506或成团泛菌定殖于植物花部位，就可抑制致病性解淀粉欧文菌对花的定殖与危害。

（2）新型病害生防制剂——Harpin的开发

Harpin是一类能激活、诱导植物保卫反应和产生系统抗性的新型蛋白，最早发现于梨火疫病菌的侵染过程。这类蛋白具有作用机制独特、防病和促进植物生长效果显著和环境友好的优点，将其用于绿色农药。

（3）叶瘿的应用

藤黄红球菌是一种可在叶际存活的放线菌。自然条件下，主要以附生形式生活在植物表面，通过破坏叶片表层细胞进入植物内部，在植物有伤口时通过伤口进入。它可干扰植物激素平衡形成叶瘿，但是它的维持需要藤黄红球菌菌体的存在，所以将其应用于植物种质的资源保存与快速繁殖（红球菌受到诱导合成细胞分裂素有关）。

（4）冰核细菌（INA细菌）的应用

冰核细菌是广泛附生于植物表面，在-5℃条件下具有冰核作用（促进过冷却水结冰—冰核活性）的细菌。

①作为报告基因的应用

克隆的冰核基因可在非冰核生物体中表达,通过测定冰核活性检测冰核基因的表达,并可根据冰核活性的大小来确定冰核基因表达的强弱。

用冰核基因做报告基因有以下优点：

Ⅰ冰核的形成是一个物理过程，不需要酶化学反应，扩大了冰核基因做报告基因的应用范围;

Ⅱ活性检测所需的设备为低温乙二醇槽，费用低，检测方便快捷，且效率高，一般只需3min；

Ⅲ其检测灵敏度同荧光素酶相当；

Ⅳ在6个数量级的范围内，冰核数量与冰核基因产物的剂量间成对数线性关系，因此可用冰核活性强弱来定性定量测量检测基因的表达量。

②在防霜方面的应用

从自然界植物体上的多种微生物中筛选对INA细菌有拮抗作用、营养竞争能力强、抑杀或寄生性强的微生物菌株，对其进行人工生产繁殖后，再喷洒在植物体上，以其控制或杀灭INA细菌，达到防御霜冻的目的。

通过转座子Tn5诱变重组后筛选获得的菌株，其插入位点在冰核基因中间，使冰核基因的线性连续性受到破坏，丧失冰核活性，而其他基因的连续性和完整性均未受到影响。因此，突变菌株的营养特性和定殖能力等生物学性状并未发生改变，从而对原野生冰核细菌产生更强的营养竞争和位点竞争作用，可大大减少植物上冰核细菌的数量，降低发生霜冻害的温度，达到减轻和控制霜冻害的目的。

③防御冻害方面的应用（防冻剂）

许多植物能够耐受细胞间结冰，但一旦细胞内结冰就发生冻害。如一些高山植物能产生冰核，使胞间水在冰点附近发生结冰，把胞内水吸到细胞间以防止胞内结冰。把细菌冰核基因导入植物，它有效表达后会产生生物冰核，可大大提高胞间水结冰的温度，增强抗寒力。

④构建促冻杀虫基因工程菌

降低越冬害虫数是有效控制虫害的可行方法。构建促冻杀虫基因工程菌Enc18liceh和Enc2022ice可显著提高害虫的过冷却点，并可在害虫肠道有效定殖，其低温冻杀效果明显。 ⑤病原微生物检测方面的应用

将冰核基因整合到对沙门菌具特异性的噬菌体中，然后改造后的噬菌体加到待测的食品或者水源样品中，经培养后检测冰核活性。这种方法可检测到107个杂菌中含有10个沙门氏菌或1mL水中含10个沙门菌，该方法具有检测快捷，灵敏的特点。

⑥食品工业的应用

将冰核活性基因inaE与由半乳糖诱导的启动子GAL1相连，转入酿酒酵母中应用于食品冷冻工业，可将冷冻温度由-13℃提高到-6℃

⑦我国也已掌握了利用冰核细菌制备人工降雪催化剂技术，已完成产品的中试，进入应用阶段。

三．植物内生菌

有些微生物可以生活在植物组织内部，这些微生物不引发植物产生明显的病症，对植物的生长发育

表现出有益的效应，包括细菌（含放线菌）、真菌等多种微生物。对内生微生物的分离研究需通过表面消毒程序消除附生微生物对内生微生物分离的影响。

（一）植物内生菌在生物技术研究中的应用

植物内生菌可增加植物抵抗病原菌感染的能力，因为其定居在植物组织内部，避免同根际、叶际微生物之间的竞争，还可防止原生动物对微生物细胞的捕食。

1.预先向棉花中接种植物内生菌可提高植株抗黄萎病的能力，并且可以检测到其在维管束运动；

2.作为基因工程表达菌株还可在植物组织中表达目的产物，从而达到植物基因工程的效果。

3.内生菌产生的代谢物可影响到植物细胞，而植物的次级代谢产物也可对微生物的代谢活动造成影响。如金黄色葡萄球菌的NorA为外排泵蛋白，可将黄连素（小檗nie碱）从细胞内排到细胞外，而黄连素是一种生物碱，推测小檗属植物还可能产生抑制NorA外排泵外排黄连素的物质，这样保持植物与微生物之间的平衡。通过定向筛选发现这种物质为治疗麻风病的传统药物晁模油（为两性弱酸）的次要组分。（二）根癌土壤杆菌在植物生物技术中的应用

获得转基因植物的关键是将克隆的遗传物质有效地导入植物细胞核中，并使其整合到植物染色体中，但植物细胞壁十分坚固，通常DNA不能通过。去除植物细胞壁后，外源基因可导入植物细胞，但由于植物细胞中不存在任何质粒DNA，所以外源基因难于在植物细胞中复制下去，这是植物基因工程的一个难题。而植物病原菌根癌土壤杆菌可将部分质粒DNA导入植物细胞，并将其插入到植物染色体组中，所以采用根癌土壤杆菌将目的基因转入植物可有效的解决植物基因工程中的关键技术难题，利用这种方法已获得具备抗除草剂、抗虫、抗病毒等特性的植物品种。

四．菌根

菌物与植物之间是一种互惠共存关系，在工业荒地、露天矿等地区的土壤含有强酸和有毒金属，把相应的菌根菌引进这种土壤，不但能协助植物幼苗吸收土壤中的养料，而且可保护幼苗免受土壤中有毒物质的危害。在新的荒山植树造林，如与菌根菌同时播种，可明显提高造林成活率。

根据菌物的菌丝体和与之共生的植物在根部所形成的特有形态结构，它们之间的营养交换关系以及菌根的类型，可分为以下几类：

（一）外生菌根

特征是菌根菌的菌丝在植物根部外围形成菌丝套，菌丝一般不进入植物细胞内部，只分布于植物细胞间隙，所以从植物获取的营养较少，对植物影响不大。包括：1菌套：根部外表面菌丝相互交错形成，可保护根尖免受机械损害（根尖附近有根端分泌物促进菌丝生长），其厚度与土壤湿度有关，在湿河滩地，菌套较薄，而生长在高山阳坡的菌套较厚，起到吸收和保存营养的功能。

2外延菌丝：多数菌套有外延菌丝伸出，呈放射状或交织成网状

3哈氏网:细胞间隙之间的菌丝体相互连接呈网状，这一现象由德国植物病理学家哈蒂发现，所以称为哈氏网。其具有生理活性，这些菌丝也会影响到根部皮层细胞的生命活动。

（二）内生菌根