专题78 PCR技术的基本操作和应用

PCR扩增反应的操作第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。

PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。

在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。

反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。

因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。

1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。

故PCR 中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。

对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。

简述PCR的基本步骤有哪些内容和步骤引言PCR（聚合酶链式反应）是一种在生物学实验中被广泛应用的技术，它能够在体外扩增特定的DNA片段。

PCR的基本步骤涉及到DNA的分离、引物设计、扩增、检测等多个环节。

本文将简述PCR的基本步骤和内容。

PCR的基本步骤PCR主要包含三个基本步骤：变性、退火和延伸。

下面将详细介绍每个步骤的内容和操作。

变性（Denaturation）变性是PCR的第一个步骤，它的目的是将双链DNA分离成两条单链DNA。

这个过程通常通过加热反应体系到较高的温度（通常是95°C）来实现。

在这个高温下，氢键断裂，双链DNA解偶，形成两条单链DNA。

退火（Annealing）退火是PCR的第二个步骤，它涉及引物的结合和弱的碱性条件。

在这个步骤中，温度被降低到适合引物与目标DNA序列结合的温度。

引物是两小片DNA序列，它们分别位于待扩增区域的目标DNA序列的两端。

通过结合到目标序列上，引物提供木核酸链的起始点。

延伸（Extension）延伸是PCR的第三个步骤，它在合适的温度和时间下进行。

在这个过程中，聚合酶（如Taq聚合酶）通过加入互补的核苷酸，将引物与单链DNA扩增为双链DNA。

聚合酶从引物的3’端开始合成新的DNA链，并到达引物的5’端。

一个完整的PCR循环完成后，会产生两条与目标DNA序列相同的DNA片段。

PCR的循环PCR的基本步骤在一个循环中完成一次，但为了扩增特定的DNA片段，需要进行多个PCR循环。

这些循环由PCR仪自动完成。

一般情况下，PCR的循环次数在20-40次之间。

PCR的应用PCR技术被广泛应用于多个领域，包括基因分型、基因突变检测、遗传学研究等。

通过PCR技术，可以在短时间内快速扩增目标DNA片段，为后续实验打下基础。

结论PCR是一种重要而有效的DNA扩增技术。

通过其基本步骤的反复循环，可以在体外快速扩增特定的DNA片段。

在实际应用中，我们可以利用PCR技术来进行遗传学研究、医学诊断以及其他领域的实验。

一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。

2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。

二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。

这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA 片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。

它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。

细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。

参与复制的有多种因素。

PCR 是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

三、实验试剂与器材模板DNA、2.5mmol/L dNTPTaq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2OPCR仪、移液枪、PCR板四、实验步骤1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA 2μL引物1 1μL引物2 1μLdNTP 1.5μLMgCl2 2μL10×buffer 2μLddH2O 10μLTaq酶0.5μL2、设置PCR反应程序。

pcr技术原理实验步骤和应用过程引言聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是在分子生物学领域中广泛应用的一种技术。

它能够通过无限次地扩增目标DNA片段，从而获得大量的目标DNA。

PCR技术不仅在遗传病的筛查、基因克隆和DNA测序等方面具有重要应用，还广泛应用于法医学、农业科学和生物技术等领域。

PCR技术原理PCR技术是通过连续进行三个核酸酶切循环，将目标DNA片段扩增至大量数量。

具体步骤如下：1. 反应准备将待扩增的DNA样本和引物（用于导向扩增的寡核苷酸链）添加到一个反应管中，并混合均匀。

2. Denaturation（变性）将反应管加热至95°C，使DNA双链解开成两条单链。

3. Annealing（退火）将反应管从95°C的高温状态快速冷却至50-60°C，并使引物与DNA单链结合。

4. Extension（延伸）将反应管温度提高至72°C，此时Taq DNA聚合酶开始引导DNA合成，从引物的末端开始延伸，并合成一条新的DNA链。

5. 延伸循环重复第2-4步骤，使得DNA的复制呈指数增长，产生大量扩增的DNA。

PCR技术应用过程PCR技术在科学研究和实际应用中有着广泛的应用，以下是几个典型的应用过程：1. 分子诊断PCR技术可以检测疾病相关基因的突变，用于遗传性疾病的早期诊断。

通过提取患者的DNA样本，通过PCR扩增技术可以检测出目标基因的突变，从而帮助医生确定诊断并制定合适的治疗方案。

2. 基因克隆PCR技术可以用于基因克隆。

通过设计合适的引物和使用PCR反应，可以在短时间内扩增出目标基因的DNA片段。

这些扩增的DNA片段可以被插入到表达载体中，进而在大量体外表达中使用。

3. 物种鉴定PCR技术在物种鉴定中也有应用。

通过选择一些特定的基因序列作为分子标记，我们可以通过扩增和测序这些序列来确定物种的身份。

这对于动植物的保护和种群遗传学研究非常重要。

PCR技术原理及应用摘要：PCR特异性依赖两端的引物,经高温变性低温复性中温延伸循环倍增,底物为四种脱氧核苷酸，需要耐高温DNA聚合酶。

主要应用在生物学和基因工程实验室、疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新的医药与工农业制品等领域。

PCR技术全称为聚合酶链式反应（Polymerase-Chain-Reaction）是上世纪80年代发展起来的新技术,发展至今已相当成熟，被广泛应用于分子生物学和基因工程实验室、疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新的医药与工农业制品等领域。

基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性主要依赖于和靶序列两端互补的寡核苷酸引物，它由变性—-复性——延伸三个基本反应步骤构成。

首先,根据靶序列DNA片段两端的核苷酸序列，合成两个不同的寡聚核苷酸引物，它们分别与DNA的两条链互补配对。

将适量的寡聚核苷酸引物与四种脱氧核糖核苷三磷酸（dDNA)、DNA聚合酶以及含有靶序列片段的DNA分子混合，经过高温变性使DNA双链解开、低温复性使底物与模板附着和中温延伸合成新的DNA片段这三个阶段的一次循环，DNA的量即可增加一倍，而循环n次，则DNA的量增加2n倍,如（图1）图1 。

聚合酶链式反应示意图【M】扩增反应（错误!～错误!）迅速地循环，产生了大量相同的片段,每一片段中均包含目的DNA片段（1)模板DNA的变性：模板DNA经过加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，完成下一轮扩增反应；（２）模板DNA与引物的复性：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至５５℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；（3）引物的延伸：DNA模板—引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列DNA序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理，从5’端到3’端延伸出一条新的与模板链互补的半保留复制连，重复循环变性-—复性——延伸三个过程就可获得更多的“半保留复制连”，以这些新链为模板就可进行下一次的PCR循环。

DNA的粗提取与鉴定【基础回顾】考点一、提取原理：(1)利用DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同进行分离。

在2 mol/L的该溶液中DNA溶解而蛋白质析出，在0.14 mol/L溶液中蛋白质溶解而DNA析出。

(2)DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质分子溶于酒精。

考点二、鉴定原理：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色。

考点三、实验步骤：提取血细胞核物质(蒸馏水涨破)→溶解(2 mol/L的NaCl)→过滤(除杂质)→析出(滴蒸馏水，降NaCl浓度至0.14 mol/L)→过滤→再溶解(2mol/L的NaCl)→过滤→进一步提纯(体积分数为95%_的冷却酒精)→鉴定。

【技能方法】1．DNA与蛋白质在NaCl溶液中溶解度比较2．DNA粗提取与鉴定中不同试剂的用途及原理比较3．DNA粗提取实验材料和方法的选择(1)不同生物的组织中DNA含量不同在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。

(2)材料不同所采用的提取方法不同①植物组织：取材→研磨→过滤→沉淀。

②鸡血：制备鸡血细胞液→提取核DNA→溶解细胞核内DNA→析出并滤取DNA→DNA再溶解→提取较纯净的DNA。

4、实验中两次使用蒸馏水，第一次的目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA，第二次的目的是稀释NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。

【基础达标】1．向溶有DNA的2mol/L的氯化钠溶液中不断加入蒸馏水,在这个过程中DNA和杂质蛋白等溶解度变化情况分别是（）A.减小,减小B.增大,增大C.先减小后增大,增大D.减小,增大▼【答案】C【解析】加入蒸馏水后,DNA溶解度随着氯化钠溶液的浓度降低而减小,至0.14 mol/L 时达到最小,继续加入蒸馏水,DNA溶解度增大；蛋白质等杂质随着氯化钠溶液的浓度降低而增大。

故选C。

2．某同学用洋葱进行DNA 粗提取和鉴定实验,操作错误的是（）A.加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨B.用蛋白酶纯化过滤后的研磨液中的DNAC.加入酒精后用玻璃棒轻缓搅拌D.加二苯胺试剂摇匀后沸水浴加热▼【答案】A【解析】A项错误：加入洗涤剂后研磨动作要轻缓、柔和,否则会产生许多泡沫,不利于后续步骤的操作；B项正确：蛋白酶能够分解蛋白质,因此能起到纯化DNA的目的；C项正确：加入酒精后用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA 分子的断裂,导致DNA分子不能形成絮状沉淀；D项正确：加二苯胺试剂摇匀后沸水浴加热来鉴定DNA。

PCR扩增反应的基本操作及理论知识第一节移液器的使用一、移液器的工作原理移液器的工作原理是活塞通过弹簧的伸缩运动来实现吸液和放液。

在活塞推动下，排出部分空气，利用大气压吸入液体，再由活塞推动空气排出液体。

使用移液器时，配合弹簧的伸缩性特点来操作，可以很好地控制移液的速度和力度。

二、移液器的操作使用1.移液器规范操作步骤第一步设定移液体积从大体积调节至小体积时，为正常调节方法，逆时针旋转刻度即可，从小体积调节至大体积时，可先顺时针调至超过设定体积的刻度，再回调至设定体积，可保证最佳的精确度。

（见图1）第二步装配移液器吸头：将移液器端垂直插入吸头，向右微微转动（视具体移液器而定，e ppendorf可以左右微微转动），上紧即可；特别提示：用移液器反复撞击吸头来上紧的方法是非常不可取的，长期这样操作，会导致移液器中的零部件因强烈撞击而松散，甚至会导致调节刻度的旋钮卡住。

（见图 2）第三步吸液和放液吸液↓吸头尖端需浸入液面3 mm 以下↓慢吸慢放，控制好弹簧的伸缩速度↓放液时吸头尖端靠在容器内壁2.移液小技巧●预润湿吸液粘稠液体可以通过吸头预润湿的方式来达到精确移液，先吸入样液，打出，吸头内壁会吸附一层液体，使表面吸附达到饱和，然后再吸入样液，最后打出液体的体积会很精确。

●正向吸液与反向吸液正向吸液是指正常的吸液方式（见图 4），操作时吸液可将按钮按到第一档吸液，释放按钮。

放液时先按下第一档，打出大部分液体，再按下第二档，将余液排出。

反向吸液（见图5）是指吸液时将按钮直接按到第二档再释放，这样会多吸入一些液体，打出液体时只要按到第一档即可。

多吸入的液体可以补偿吸头内部的表面吸附，反向吸液一般与预润湿吸液方式结合使用，适用于粘稠液体和易挥发液体。

3.错误的操作方式错误：装配吸头时用移液器反复撞击吸头，以上紧正确：插入吸头，左右轻转旋转上紧吸头错误：吸头与移液器不匹配，影响气密性正确：选用与移液器匹配的，有质量保证的吸头错误：吸液时，移液器倾斜吸液正确：垂直吸液错误：吸头内含有未打出的液体时，移液器平置于桌面正确：将移液器垂直挂在移液器支架上错误：用大量程的移液器移取小体积的液体正确：移液体积需保证在移液器所提供的量程范围之内才符合不准确度和不精确度的要求错误：吸取具有强挥发性的液体正确：如果一定要移取强挥发性的液体，应该在移液结束后立刻拆开移液器，让蒸汽挥发，同时，建议使用外置活塞式移液器。

PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。

以下是PCR 的基本操作流程：
准备反应体系：
在无菌条件下，准备PCR反应管，其中包含待扩增的DNA模板、引物（前向引物和反向引物）、核酸酶短片段、缓冲液、酶（聚合酶）和DNA聚合酶反应所需的核苷酸。

Denaturation（变性）：
将PCR反应管置于热源中，提高温度至约94-98摄氏度。

高温会使DNA双链解开，将DNA模板分离成两个单链。

Annealing（退火）：
将PCR反应管从高温降温至适合引物与DNA结合的温度（通常在50-65摄氏度之间）。

引物与DNA模板上的互补序列结合形成稳定的引物-模板复合物。

Extension（延伸）：
将PCR反应管温度升高至DNA聚合酶的最适温度（通常在68-72摄氏度之间）。

DNA聚合酶会利用引物-模板复合物的末端作为起始点，向3'方向合成新的DNA链。

在延伸过程中，核酸酶短片段会降解旧的DNA链，以便DNA聚合酶能够在其上进行合成。

循环反应：
Denaturation、Annealing和Extension构成了一轮PCR循环。

PCR循环会在一段时间内重复进行多次，通常进行20-40个循环。

每一轮PCR循环都会使DNA模板扩增成两倍。

结果分析：
PCR反应结束后，可使用凝胶电泳等方法对扩增产物进行分析。

凝胶电泳可以根据扩增产物的大小和数量，确定PCR反应的效果和扩增DNA片段的特性。

PCR基本操作包括哪些步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。

它在基因工程、药物研发、疾病诊断等领域具有广泛的应用。

PCR基本操作包括以下几个步骤：1. DNA样本处理与提取PCR反应所需的DNA样本可以从细胞或组织中提取获得。

常用的提取方法包括酚-氯仿法、盐析法、商用DNA提取试剂盒等。

提取的DNA需要进行定量和质量检测，确保PCR反应的可重复性和准确性。

2. 反应体系准备PCR反应体系主要由DNA模板、引物、缩合酶、反应缓冲液和可调节的离子浓度组成。

根据实验需要，可以添加特定的辅助试剂、核苷酸等。

反应体系的设计和优化对PCR反应的灵敏度和特异性有重要影响。

3. PCR反应程序设置PCR反应需要按照一定的温度和时间控制，以使DNA片段在不同温度区间中完成变性、退火和延伸等步骤。

一般情况下，PCR反应的程序包括初始变性、循环反应和最终延伸等阶段。

4. PCR反应条件优化PCR反应的条件优化对于提高扩增效率、特异性和产物纯度至关重要。

优化参数包括反应体系组分、引物浓度、反应温度、扩增周期数等。

通过优化反应条件，可以解决一些常见问题，如非特异性扩增、抑制性物质的影响等。

5. PCR产物分析与检测PCR产物可通过凝胶电泳、定量PCR、测序等方法进行分析和检测。

凝胶电泳是常用的PCR产物分析方法，可以确定目标DNA片段的大小和纯度。

定量PCR则可以精确测量DNA模板的初始量或PCR产物的多少。

通过以上几个步骤，PCR技术可以在较短的时间内扩增目标DNA片段，从而满足各种科研和应用需求。

PCR反应的成功需要仔细的实验操作和条件优化，以保证结果的准确性和可靠性。