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有关物质方法学验证
物质方法学验证是一种科学研究方法，用于验证和证明物质的性质、组成和结构。
它涉及到一系列实验和观察，以从实验数据中得出结论。
常见的物质方法学验证包括：
1. 光谱分析：通过观察物质在特定波长范围内的吸收、发射或散射光，来确定物质的组成和性质。
常见的光谱分析技术包括质谱、紫外-可见吸收光谱、红外光谱、核磁共振等。
2. 热分析：通过对物质在加热或冷却过程中的温度变化进行监测和分析，来推断物质的热性质和相变行为。
常见的热分析技术包括热重分析、差示扫描量热法等。
3. 表征与测试：通过测量物质的物理性质，如密度、硬度、粘度等来判断其组成和性质。
常见的表征和测试技术包括X射线衍射、电子显微镜、拉伸试验等。
4. 化学反应：通过观察和分析物质在化学反应中的变化，来研究其化学性质和反应机理。
常见的化学反应验证方法包括观察颜色变化、气体生成、沉淀生成等。
5. 数学建模和计算机模拟：通过建立数学模型或使用计算机模拟软件，来预测和验证物质的性质和行为。
这种方法可以理解和解释物质的复杂性质，提前预测
实验结果。
在进行物质方法学验证时，科学家通常会结合多个方法和技术，以增强结果的可靠性和准确性。
有关物质方法学验证定量限-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述是研究文章的起点，它提供了读者对整篇文章的总体了解。
在本篇文章中，我们将探讨有关物质方法学验证定量限的内容。
物质方法学验证是一种用于确定化学或生物分析中方法的可行性和准确性的过程。
而定量限则是用来衡量分析方法的灵敏度和可靠性的指标。
在现代科学研究中，准确地确定和验证化学或生物分析方法的可行性是至关重要的。
只有在方法被验证为可行和可靠后，我们才能确信分析结果的准确性。
随着技术的不断发展和进步，科学家们提出了各种物质方法学验证的方法和指标。
这些方法和指标旨在提供科学家们所需的信息，以评估所使用的分析方法的准确性和可靠性。
其中，定量限是一种常用的物质方法学验证指标，用于衡量分析方法能够检测到的最低浓度。
定量限的确定对于科学研究的准确性和可靠性至关重要。
一个好的定量限能够确保分析结果在特定浓度范围内是可靠和准确的。
文章的后续部分将深入探讨物质方法学验证和定量限的相关内容，介绍不同的验证方法和指标，以及其在科学研究和实际应用中的重要性。
通过对这些内容的分析和讨论，读者将能够更深入地理解物质方法学验证和定量限的意义和应用。
总而言之，本篇文章将探讨有关物质方法学验证和定量限的内容，通过介绍不同的验证方法和指标，希望能够给读者提供对这一领域的深入理解，并传达其在科学研究和实际应用中的重要性。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以按照以下思路进行撰写：文章结构部分主要介绍整篇文章的组织架构及各个章节的内容概要。
它的作用是向读者提供一个清晰的导航，让读者能够更好地理解文章的框架和内容安排。
在本文中，文章结构部分可以包括以下内容：本文共分为引言、正文和结论三大部分。
引言部分旨在介绍文章的背景和意义，概述物质方法学验证定量限的重要性和研究现状。
同时，引言部分还会指出文章的目的和意义，为读者建立对文章内容的预期。
正文部分是本文的重点，主要分为物质方法学验证和定量限两个章节。
有关物质分析方法学验证的项目及可接受标准药审中心黄晓龙药品中的有关物质泛指在药品的生产与储存过程中产生的工艺杂质或降解产物。
本文结合国外一些大型药品研发企业在此方面的要求，提出了在对有关物质检查方法进行验证时的可接受标准，供国内的药品研发单位在进行研究时参考。
1．准确度该指标主要是通过回收率来反映。
验证时一般要求根据有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3％的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。
该项目的可接受标准为：各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。
2．线性线性一般通过线性回归方程的形式来表示。
在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。
以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。
可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。
3．精密度1）重复性配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。
2）中间精密度配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于20%。
4．专属性可接受的标准为：空白对照应无干扰，该杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于2.0。
5．检测限杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。
6．定量限杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。
另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。
注射用XX 有关物质及含量测定方法学验证方案样品：自制XX 供试品：批号：市售品：进口XX 批号：国产XX 批号：对照品：XX 对照品：自制，批号：xxxxxx ，XX 含量：51.27% 水分：1.34%A 对照品：来源：批号：B 对照品：来源：批号：C 对照品：来源：批号：1、方法验证注射用XX 是以XX 为原料通过复溶并重新冻干获得，制品期间未加入任何辅料，同时注射用XX 有关物质及含量测定方法与原料测定方法完全一致，因此注射用XX 有关物质及含量测定方法学验证可与XX 原料方法学一致，此次方法学验证使用的样品用原料（批号：xxxxxx ）代替。
2、检测方法含量测定照高效液相色谱法（中国药典2015 年版四部通则0512）测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水相-甲醇-乙腈（800：160：16）为流动相；柱温：30 C ;检测波长为260nm。
取对照品溶液作为系统适用性试验溶液，量取20』注入液相色谱仪，各杂质峰之间及主成分峰与相邻杂质峰之间的分离度应符合规定，理论板数按XX 峰计算应不低于3000。
测定法取本品适量，精密称定，加水溶解制成每1ml 中约含XX 0.2mg 的溶液，作为供试品溶液。
精密量取供试品溶液20讪，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取XX对照品适量，同法测定。
按外标法以峰面积计算，按无水物计算，含XX阳离子应为50.0%〜54.0%。
有关物质照高效液相色谱法（中国药典201 5年版四部通则0512）测定。
取本品，精密称定，加水溶解并稀释制成每1ml 中约含XX 0.5mg 的溶液，作为供试品溶液；另分别取A、B、XX、C对照品适量，精密称定，加水溶解并定量制成每1ml中约含A 2.5 jg、B 2.5 jg、XX5.0⑷、C 5.0 j的混合溶液，作为对照品溶液。
取对照品溶液20 J，注入液相色谱仪，出峰顺序依次为A、B、XX、C,调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%〜30%;再精密量取对照品溶液和供试品溶液各20讪,分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的 6 倍。
有关物质检测方法首先要建有关物质的一套方法。
主要包括酸，碱，氧化，光，热，破坏，看你的原料或片子在上述条件下的降解物质能否与主峰有一定的分离度，如果分离度均在2.0以上，说明该色谱条件可以由于该原料和制剂的有关物质测定，然后是原料中间体及粗品跟主峰的分离研究，片辅料的干扰，如果均不干扰的话。
做该物质的检测线及有关物质检查精密度实验，然后可以根据你制定的原料和制剂的有关物质限度，配置你的供试品溶液和自身对照品溶液，如果你的原料有关物质的限度是1%，则在你的供试品溶液浓度一定（列如0.2mg/ml），你的自身对照品溶液的浓度就是你的供试品在稀释100倍（即2μg/ml），相同条件下进样，所得的供试品杂质总面积与自身对照溶液的峰面积的商乘上你的样品有关物质限度即是你的样品所含的有关物质测定结果。
但是现在有个问题即测定波长选择时很多人多容易犯的懒惰错误，看下文：有关物质检查，包括对产品中残留合成原料、中间体、副产物及可能的降解产物的检查，是控制药品质量的重要指标，目的是检查药品中所含的上述杂质是否符合安全性的要求,同时也是药品稳定性评价中需重点考察的项目。
有关物质检查常用的方法之一是HPLC主成分自身对照法（紫外检测器），即将HPLC色谱图中杂质峰面积与主成分自身对照液峰面积进行比较，以确定杂质限度是否合格。
采用此方法时确定的检测波长是否合理直接影响到方法的可行性，因此检测波长的选择是方法学研究的重要内容。
在审评中发现一些申报单位在采用HPLC主成分自身对照法检查有关物质时直接或间接地以主成分的最大吸收波长作为检测波长，由于有关物质检查的对象是杂质，若将主药的最大吸收波长确定为检测波长，则杂质在此波长下的吸收可能偏低，某些杂质甚至无吸收，这样会造成对杂质含量的低估甚至漏检，从而不能反映产品的真实质量，影响了对品种质量可控性及稳定性的评价。
在有关物质检测波长确定方面，申报资料中比较常见的做法有：1．直接将主药的最大吸收波长选作检测波长。
头孢呋辛酯分散片
实验题目：有关物质方法学---专属性试验
实验目的：摸索有关物质专属性方法
方法来源：自行摸索
破坏试验：
照高效液相色谱法(附录ⅤD)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.2mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇(62:38)为流动相；检测波长为278nm。
具体操作：
0.2 mol磷酸二氢氨----23.0g磷酸二氢氨溶解于1000毫升水中。
流动相：以0.2mol/L磷酸二氢铵溶液-甲醇(620:380)为流动相
柱温30度，流速1.0ml/min。
150mm柱子出峰时间大约15分钟。
酸破坏：取约300毫克头孢呋辛酯分散片细粉置于100毫升烧杯中，加入20毫升甲醇溶解，在加入1和2毫升毫升0.5摩尔每升的盐酸，反应1小时，加入0.5摩尔每升的氢氧化钠1和2毫升中和，终止反应，转移到100毫升量瓶中用流动相稀释到刻度。
进样20微升。
碱破坏：取约300毫克头孢呋辛酯分散片细粉置于100毫升烧杯中，加入20毫升甲醇溶解，在加入0.5和1和2毫升0.1摩尔每升的氢氧化钠，反应1小时，加入0.1摩尔每升的盐酸0.5 和1和2毫升中和，终止反应，转移到100毫升量瓶中用流动相稀释到刻度。
进样20微升。
氧化破坏：取约300毫克头孢呋辛酯分散片细粉置于100毫升烧杯中，加入20毫升甲醇溶解，在加入8和10毫升10%过氧化氢反应1小时，转移到100毫升量瓶中用流动相稀释到刻度。
进样20微升。
含量和有关物质方法学验证方案一、引言在化学领域，即便我们知道一些物质的化学式和分子结构，我们仍然需要确切地知道其含量，因为不同含量的同一种物质在性质上可能会有很大的差异。
因此，快速、准确地确定物质的含量对于化学研究以及工业生产具有重要意义。
本文将介绍一种常用的含量测定方法：滴定法，并给出详细的验证方案。
二、滴定法原理滴定法是一种准确测定溶液中其中一种物质含量的方法。
其基本原理是通过向待测液体中加入一种已知浓度溶液的滴定液，当已知浓度溶液与待测液体反应完全时，通过滴定液与待测液体的反应量来确定待测物质的含量。
三、滴定法验证方案1.实验目的本实验旨在验证滴定法测定溶液中其中一种物质含量的方法的准确性和可靠性。
2.实验材料及设备滴定管、滴定架、比色皿、移液器、烧杯、乙醇溶液、酸性钾高氯酸溶液、甲基橙指示剂。
3.实验步骤(1)准备滴定液：称取一定质量的酸性钾高氯酸溶液，稀释至适宜的体积。
(2)准备待测液：取一定体积的待测液，如乙醇溶液。
(3)加入指示剂：向待测液中加入少量的甲基橙指示剂，使待测液呈橙色。
(4)滴定测定：将滴定液从滴定管中滴入待测液中，同时轻轻搅拌。
当待测液的颜色由橙色转变为淡黄色时停止滴定。
(5)计算含量：根据滴定液的体积和浓度，计算出待测液中物质的含量。
4.实验验证(1)准确性验证：通过多次重复实验，计算出待测液中物质的平均含量，并计算其标准偏差。
如果平均含量接近理论值，并且标准偏差较小，则说明滴定法测定物质含量的准确性较高。
(2)精密度验证：通过多次重复实验，计算出待测液中物质含量的相对标准偏差。
如果相对标准偏差较小，则说明滴定法测定物质含量的精密度较高。
(3)选择适当指示剂：在实验中，如果选择的指示剂与待测液中物质反应后出现显著颜色变化，则说明该指示剂适用于该滴定反应。
(4)确定滴定液的浓度：滴定液的浓度需要根据滴定反应的化学方程式和已知反应物质的浓度进行计算。
在实验中应当使用已知浓度的标准物质进行验证滴定液的浓度。
图1枸橼酸托法替布的化学结构枸橼酸托法替布又名枸橼酸托法替尼，即（3R,4R ）-4-甲基-3-（甲基-7H -吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氨基）-茁-氧代-1-哌啶丙腈枸橼酸盐（C 16H 20N 6O ·C 6H 8O 7），其化学结构如图1所示。
类风湿性关节炎（RA ）是一种由关节滑膜慢性炎症、抗瓜氨酸肽抗体和类风湿因子的异常表达介导的慢性系统免疫性疾病，其临床症状主要为滑膜增生、血管翳的形成、软骨损失和关节破坏等，如不及时给予规范治疗，病情可逐渐加重，最后导致畸形、关节强直和功能丧失，是临床常见的主要致残性疾病之一。
我国类风湿性关节炎患病人数近500万；该病致残率高，给社会和患者均造成沉重的负担。
目前，针对类风湿性关节炎的治疗有很多种，主要包括非甾体抗炎药、糖皮质激素类药物、慢作用抗风湿药、生物药物及小分子激酶（JAK ）抑制剂。
JAK 属于胞内酪氨酸激酶家族，能够从细胞因子、干扰素和多种激素受体向细胞核传递信号，从而合成多种生物活性物质，影响细胞的代谢和功能，因此，激酶功能障碍则会导致造血功能障碍和免疫功能低下。
在类风湿性关节炎患者的治疗过程中，选用JAK 抑制剂可以迅速有效地抑制炎症细胞因子的过度表达，从而达到治疗目的[1]。
枸橼酸托法替布是第一个被批准用于人类自身免疫性疾病的小分子非受体型酪氨酸蛋白激酶抑制剂。
枸橼酸托法替布片于2012年在美国首先批准上市，目前已在日本、俄罗斯、澳大利亚、加拿大等全球50多个国家和地区获得上市批准。
2017年，欧洲药品管理局（EMA ）也批准该药用于类风湿性关节炎的治疗，并对近5000名患者进行随访，其长期安全性和有效性数据得到了进一步证实。
枸橼酸托法替布的临床疗效显著，且可与甲氨蝶呤或其他非生物改善病情抗风湿药（DMARD ）联合使用，不良反应轻微、安全性高、服用方便，深受医生和患者的青睐[2-3]，是近年世界范围内销售量增长较快的药物之一。
有关物质方法学研究●主要内容1、有关物质检查方法建立的研发思路2、有关物质方法的建立和方法学验证2.1、原料药和制剂的相关理化性质2.2、有关物质分析方法的选择2.3、有关物质分析方法的验证2.4、有关物质杂质的定量方法3、有关物质杂质的分析4、有关物质杂质限度的制订有关物质检查方法建立的研发思路●研发思路：有关物质检测方法的建立重点是测定方法的先进性、准确性、可行性。
●⑴首先有关物质的方法选择，对于仿制药有EP、BP、USP等质量标准的药品，首选以上的色谱条件进行筛选，尤其关注的离子对试剂的使用。
●⑵选用不同色谱条件进行对比研究，如果方法一是等度测定的，方法二最好选用梯度色谱条件，比较两种方法测定结果的杂质个数及杂质含量等。
确证有关物质测定方法的准确性。
●⑶对所筛选的方法进行系统的方法学研究，比较不同检测方法的优劣，选择较好的色谱条件作为本品有关物质检查的测定方法。
●⑷对于仿制药同时要将自制样品与市售原研样品进行全面的质量比较，分析其杂质的种类和含量，确保自制样品与市售原研样品的杂质在同一水平。
●原料药和制剂的相关理化性质●在建立有关物质检查方法前，需首先了解原料药和制剂的相关理化性质。
●⑴对于原料药，了解原料药的基本性质和结构特点。
了解原料药合成工艺过程中的起始原料、副产物、副产物产生的杂质、中间产物或可能产生的降解产物等。
结合相关已知的杂质来确定有关物质检测的条件。
●⑵对于制剂，可能影响药物有关物质的重要因素有辅料、剂型、存储条件等，主要了解辅料对有关物质检测的干扰情况，不同剂型在不同存贮条件下可能产生的杂质等。
对于复方制剂，同时要考虑到复方中原料的相互作用可能产生的杂质等。
●有关物质分析方法的选择●有机杂质的检测方法包括化学法、光谱法、色谱法等，因药物结构及降解产物的不同采用不同的检测方法。
通过合适的分析技术将不同结构的杂质进行分离、检测，从而达到对杂质的有效控制。
目前普遍采用的杂质检测方法主要有：●⑴高效液相色谱法（HPLC）目前采用的分析方法主要以高效液相色谱法为主，为常用的分析方法。
选择不同的色谱柱对杂质进行有效的分离。
●⑵薄层色谱法(TLC) 是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，但准确性较低。
●⑶气相色谱法(GC) 气相色谱法主要是用于能气化的物质的检测和分离。
一般用于有机残留溶剂的检测和分离。
也可用于一些能挥发的杂质的检测。
●⑷毛细管电泳法（CE）毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分的淌度和（或）分配行为的差异而实现各组分分离的一种分析方法。
其应用比较广泛，但该方法测定精密度不高，专属性不稳定，且CE仪器价格较高。
●由于各种分析方法均具有一定的局限性，因此在进行杂质分析时，应注意不同原理的分析方法间的相互补充与验证，如HPLC与TLC及HPLC与CE的互相补充，反相HPLC 系统与正相HPLC系统的相互补充，HPLC不同检测器检测结果的相互补充等。
●有关物质分析方法的验证●①检测波长的选择●有关物质检测波长是结合主成分与杂质的最大吸收波长进行选择。
●测定方法：分别称取待测供试品、对照品、空白辅料、市售对照样品适量，用流动相溶解并稀释到一定浓度，配制成对照品溶液、供试品溶液以及空白辅料溶液，分别于采用HPLC法测定，采用DAD检测器进行，确定待测物质中各杂质的最大吸收波长、主峰的最大吸收波长以及空白辅料的干扰情况等，有杂质对照品的同时进行扫描，或HPLC 进行测定。
必要时可将供试品溶液适当破坏后测定各降解产物的最大吸收波长。
●判断结果：根据测定结果确定有关物质测定的检测波长。
●有关物质分析方法的验证●②专属性试验●专属性系指在其它成分可能共存的情况下，采用的方法能准确测定出被测杂质的特性●⑴对于原料药，可根据其合成工艺，采用各步反应的中间体（尤其是后几步反应的中间体）、立体异构体、粗品、重结晶母液等作为测试品进行系统适用性研究，考察产品中各杂质峰及主成分峰相互间的分离度是否符合要求，从而验证分析方法对工艺杂质的分离能力。
●⑵根据药物的化学结构特点、制剂的处方与工艺、储存条件等选用合适的酸、碱、光、热、湿、氧化反应等加速破坏性试验来验证分析方法的专属性。
●⑶强制降解试验在试验过程中，应注意破坏性试验要适度，应着重考察敏感条件。
如在一定条件下稳定，则无必要再提高条件的剧烈程度进行重复试验。
破坏试验的程度暂无统一要求，一般以强力破坏后主成分的含量仍占绝大部分为宜。
要达到这种破坏程度，需要在研究过程中进行摸索，先通过初步试验了解样品对光、热、湿、酸、碱、氧化条件的基本稳定情况，然后进一步调整破坏性试验条件（如光照强度、酸碱浓度、破坏的时间、温度等），以得到能充分反映降解产物与主成分分离的结果和图谱。
●有关物质分析方法的验证●③检测限与定量限●检测限系指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，是反映分析方法灵敏度的一个重要指标；最低检测限不得大于该杂质的报告限度，以保证检出需控制的杂质。
●测定方法：取待测物质对照品适量，加流动相配制成一点浓度的对照品溶液，按倍倍稀释法，以信噪比为3：1时相应的浓度或注入仪器的量确定检测限。
同时将信噪比为3：1的样品溶液进样6针，以峰面积计算相对标准偏差。
●判断结果：最小检测限浓度下样品峰面积的相对标准偏差应≤20%，以最小检测限来确定供试品溶液配制的浓度作为依据。
●定量限是指被测杂质能够被定量测定的最低量。
定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。
杂质定量试验，需考察方法的定量限，以保证含量很少的杂质能够被准确测出。
●测定方法：取待测物质对照品适量，加流动相配制成一点浓度的对照品溶液，按倍倍稀释法，以信噪比为10：1时相应的浓度或注入仪器的量确定检测限。
同时将信噪比为10：1的样品溶液进样6针，以峰面积计算相对标准偏差。
●判断结果：定量限浓度下样品峰面积的相对标准偏差应≤10%。
●有关物质分析方法的验证●④系统适应性系统适应性试验主要是考察主成分与杂质的分离情况以及主峰参数信息,如理论塔板数、拖尾因子、分离度等，均应符合测定要求。
●⑤精密度试验精密度试验包括：重复性试验、中间精密度试验等。
●⑥溶液稳定性试验考察样品在配制溶剂中的杂质与主峰的稳定性，取一定浓度的样品溶液，分别于不同时间取样测定杂质与主峰的峰面积，以相对标准偏差来表示不同时间测定结果的稳定性。
判断结果：结果RSD,%≤2.0%，在测定时间内的样品溶液稳定性良好。
●⑦耐用性试验耐用性试验是指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。
一般系统变化条件：分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化±5nm、流速相对值变化±20％以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。
可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于 2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内。
特殊样品如果色谱条件变化比较敏感的，可适当降低变化范围。
●耐用性试验部分还包括样品萃取（提取）稳健性：可理解为提取方法的重复性良好。
即提取方法的确定验证试验。
●有关物质杂质的定量方法●有关物质杂质的定量方法根据杂质与主成分的最大吸收波长及校正因子来确定。
若杂质与主峰的吸收波长基本一致，则一般采用自身对照法或峰面积归一化法；若杂质与主峰的吸收波长差异范围较小，校正因子在0.9～1.1之间，则可采用不加校正因子的主成分自身对照法；超出该范围，校正因子在0.2～5.0范围以内时，采用主成分自身对照法的定量方式，须用校正因子进行校正；若杂质与主峰的吸收波长相差较大，校正因子在0.2～5.0范围以外时，不能通过校正因子校正，则要采用外标法进行测定。
●①外标法（杂质对照品法）●外标法定量比较准确，采用外标法进行测定时，应进行相应的方法学研究。
● A 检测波长的选择检测波长的选择测定方法参照紫外-可见分光光度法（中国药典2010版二部附录ⅣA）进行测定，或采用HPLC法，DAD检测器进行测定。
同时考察辅料干扰等。
● B 标准曲线线性关系应在设计的测定范围内测定。
可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列被测物质浓度系列进行测定，至少制备5个浓度。
以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归。
●有关物质杂质的定量方法● C 精密度试验仪器精密度试验主要是考察测定方法在所用的试验仪器测定结果的偏差，精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。
●测定方法：取一定浓度的杂质对照品溶液，连续测定次数至少6次，以峰面积的测定结果计算相对标准偏差，考察仪器测定的。
●D重复性试验重复性系指在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度。
重复性测定可在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价，如制备3个不同浓度的试样，各测定3次，或100％的浓度水平，用至少测定6次的结果进行评价。
常用的测定方法时采用100%的浓度，测定6次，计算测定结果的相对标准偏差。
●测定方法:按含量测定的方法，分别平行称取6份样品，按外标法测定杂质的含量，以杂质含量测定结果计算相对标准偏差。
● E 中间精密度中间精密度系指在同一实验室，由于实验室内部条件改变，如时间、分析人员、仪器设备、测定结果的精密度。
验证设计方案中的变动因素一般为日期、分析人员、设备。
考察在不同因素变动的条件下，测定结果的标准偏差。
●有关物质杂质的定量方法●测定方法：按含量测定的方法，分别由不同的人员、时间、不同仪器按外标法测定样品杂质的含量，以杂质含量测定结果计算相对标准偏差。
● F 回收率试验回收率试验来验证测定方法的准确度。
试验设计需考虑在规定范围内，制备3个不同浓度的试样，各测定3次，即测定9次，报告已知加入量的回收率（％）或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。
并考察不同浓度下测定结果的相对标准偏差。
●测定方法：按含量测定的方法，按加样回收率测定方法，在已知杂质含量的样品中加入不同浓度的杂质对照品，按外标法分别测定不同浓度样品中的测的量，计算测的量比加入量的百分含量（即回收率），以不同浓度下的回收率计算相对标准偏差。
●G 杂质的检测限检测限系指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，是反映分析方法灵敏度的一个重要指标；最低检测限不得大于该杂质的报告限度，以保证检出需控制的杂质。
●测定方法：取待测物质对照品适量，加流动相配制成一点浓度的对照品溶液，按倍倍稀释法，以信噪比为3：1时相应的浓度或注入仪器的量确定检测限。
