生化答案

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生化
一、蛋白质一级结构研究的内容
二、蛋白质分离纯化的方法
三、蛋白质以一级结构的确定方法
四、信号肽学说
五、乳糖操纵子结构机制
六、基因表达调控的基本要求及意义
七、细胞信息转导(肾上腺素、胰高血糖素为例)
一、蛋白质一级结构研究的内容
蛋白质一级结构:指多肽中从N-端到C-端的氨基酸序列,包括二硫键的位置在每种蛋白质中氨基酸按照一定的数目和组成进行排列,并进一步折叠成特定的空间结构前者我们称为蛋白质的一级结构,也叫初级结构或基本结构。

蛋白质一级结构是理解蛋白质结构、作用机制以及与其同源蛋白质生理功能的必要基础。

蛋白质的一级结构包括:
(1)组成蛋白质的多肽链的数目;
(2)多肽链的氨基酸顺序;
(3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置
二,蛋白质分离纯化方法
答(一)透析及超滤法
1、透析:利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。

2、超滤法:应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜,达到浓缩蛋
白质溶液的目的。

(二)丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀
1、使用丙酮沉淀时,必须在0-4℃低温下进行,丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。

蛋白质被丙酮沉淀后,应立即分离。

除了丙酮以外,还可以用乙醇沉淀。

2、盐析是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液,是蛋白质表面电荷被中和以及水化膜破坏,导致蛋白质沉淀。

3、免疫沉淀法:将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。

利用特异抗体识别相应的抗原蛋白,并形成抗原抗体复合物的性质,可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。

(三)电泳
蛋白质在高于或低于期PI的溶液中为带点颗粒,在电场中能向正极或负极移动。

这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳。

根据支撑物不同,可分为薄膜电泳,凝胶电泳等。

(四)层析
原理:待分离蛋白质溶液(流动相)经过一个固态物质(固定相)时,根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小,电荷多少及亲和力等,使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配,并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质目的。

常用的有离子交换层析,凝胶过滤又称分子筛层析。

(五)超速离心
超速离心既可以用来分离纯化蛋白质也可以用来测定蛋白质的分子量。

三、蛋白质一级结构测定的步骤
测定原则:将大化小,逐段分析,并对照两套以上肽段的分析结果,排出肽段的前后位置,最后确定全顺序。

步骤:
A. 分离提纯待分析的蛋白质样品
B. 拆分蛋白质分子中的多肽链:若肽链间非共价键连接,可使蛋白质变性,用高浓度变性剂处理;若肽链间通过—S—S—连接,需拆开—S—S—,并将出现的—SH保护(防止氧化连结),保护剂用烷基化试剂,如碘乙酸等。

a、鉴定N-末端或C-末端残基
b、确定蛋白质分子的肽链数
c、测定各亚基的分子量
d、测定肽链的氨基酸组成
C.酶解肽链及片段分离
例如:胰蛋白酶 Lys,Arg(C)
胰凝乳蛋白酶 Phe,Trp,Tyr(C)
金黄色葡萄球菌V8蛋白酶 Asp,Glu(C)
天冬氨酸-N-蛋白酶 Asp,Glu(N)
胃蛋白酶 Phe,Trp,Tyr(N)
赖氨酸内切蛋白酶C Lys(C)
D. 测定片段氨基酸序列:①确定肽链中的氨基酸组分②帮助发现分离时肽段的丢失③为选择裂解手段提供依据。

方法:1、异硫氰酸苯脂降解法2、DNS—Cl—Edman法
E.拼接肽链的一级结构:1、N端基肽段的确定2、C端基肽段的确定3、重迭肽的建立
F.确定二硫键的位置
1.用胃蛋白酶水解原来的含-S-S-的蛋白质(链内、链间)成较小的肽段。

2.所得肽段混合物用对角线电泳技术进行分离含-S-S-的肽段。

3.将滤纸暴露在过甲酸蒸气中,供-S-S-断裂,被氧化成含两个半胱氨磺酸的肽段。

4.将滤纸旋转90°,进行第二向电泳,由于含半胱氨磺酸的成对肽段比原来含—S—S—的肽段小,且负电荷增加,都偏离对角线。

5.将每对含半胱氨磺酸的肽段分别取下,测序,与多肽链的氨基酸顺序比较,推断—S—S 在肽链间或肽链内位置。

四、信号肽学说
信号学(signal hypothesis)又称信号肽学说,是有关蛋白通过特殊的疏水氨基酸区域越膜分泌的学说,此疏水氨基酸区域在ER中被切除和降解。

“信号学说”是用来解释细胞内的蛋白质如何各得其所、各就各位的。

其基本内容是:各种蛋白质在细胞中的最终定位由多肽链本身所具有的特定氨基酸序列决定。

这些特殊的氨基酸序列起着一种信号向导的作用,因此被称为信号序列。

在某种意义上,一个蛋白质分子上的信号序列相当于它特有的“分子邮政编码”。

如果一个蛋白质缺乏任何一种信号序列,则会留在其“默认”的位置——细胞液,如参与糖酵解和磷酸戊糖途径的酶。

注意有两类指导蛋白质分捡的信号,需要将它们区分开来:一类称为信号肽,其本质是一段在一级结构上连续的氨基酸序列,通常有15~60个氨基酸残基,它们有的在N端,有的在C端,有的在多肽链的内部。

还有的蛋白质不止一种信号序列。

这类信号肽序列通常在蛋白质分拣完成以后被信号肽酶切除。

引导蛋白质从细胞液进入内质网、高尔基体、胞外、细胞核、线粒体、叶绿体和过氧化物酶体的分拣信号属于信号肽序列;另一类为信号斑。

存在于已折叠的蛋白质中,是蛋白质在完成折叠以后,在其表面形成的由来自不同区域的氨基酸序列组合在一起的三维分拣信号。

例如,引导蛋白质定向运输到溶酶体的就是信号斑,它是溶酶体酸性水解酶被高尔基体选择性糖基化的标识。

六、基因表达调控的基本要求及意义
意义:(一)以适应环境,维持生长和增殖:生物体所处的内、外环境实在不断变化的。

通过一定的程序调控基因的表达,可以使生物体表达出合适的蛋白质分子,以便更好地适应环境,维持其生长和繁殖。

(二)一维持细胞分化与个体发育:在多细胞个体生长、发育的不同阶段,或在同一生长发育阶段,不同组织器官内蛋白质分子分布、种类和含量存在很大差异,这些差异是调节细胞表型的关键。

基本要求:
七、转导(肾上腺素、胰高血糖素为例)
胰高血糖素等细胞外信息分子与相应受体结合后将信号传入靶细胞内,由于内信号转导需要不同的类型的转导分子,胰高血糖素属于类固醇激素,所以需要调节蛋白即G蛋白通过分子间的相互作用被激活或激活下游分子,此时G蛋白使下游的AC活化并作用于ATP上使其产生活化第二信使cAMP,使第二信使的靶分子蛋白激酶A由无活性的转为有活性的蛋白激酶A,蛋白激酶A通过磷酸化作用与效应蛋白,使ATP转化为ADP在糖原合酶,磷酸化酶作用下,糖原分解,使血糖增高。

五、乳糖操纵子结构机制
大肠杆菌中控制β半乳糖苷酶诱导合成的操纵子。

包括调控元件P(启动子)和O(操纵基因),以及结构基因lacZ(编码半乳糖苷酶)、lacY(编码通透酶)和lacA(编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶)。

它们的产物可催化乳糖的分解,产生葡萄糖和半乳糖。

它们具有顺式作用调节元件和与之对应的反式作用调节因子。

此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因Ⅰ。

Ⅰ基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子受阻遏而处于转录失活状态。

在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白CAP结合位点,由P 序列、O序列和CAP结合位点共同构成LAC操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。