经典——教你如何选择流式抗体

流式抗体培训目录1.流式细胞术的概念与目的2.流式细胞术与其他免疫学实验技术的异同3.流式样本的制备4.流式细胞仪检测原理与数据含义5.流式抗体的选择6.流式实验常见问题不同种类细胞表达的表面标志不一样不同种类细胞形态不一样不同种类细胞内容物不一样流式细胞术是根据不同单个细胞形态、表面标志物、内容物的差异，利用流式细胞仪检测细胞固有的或特异性标记的信号从而实现细胞分析与细胞分选的目的的一种方法荧光标记的方法及原理蛋白质核酸脂质其它…荧光团修饰的抗体遗传表达荧光蛋白抗体可变区对抗原的高亲和力融合表达或者同一启动子控制表达DiO, DiI, PKH等脂质染料细胞的膜系统与脂质染料的高度疏水相互作用荧光素标记的Annexin VAnnexin V与磷脂酰丝氨酸之间的高亲和力CFSE等一系列增殖细胞示踪染料LysoTrack溶酶体特异性染料DAPI、PI、7-AAD等凋亡染料TUNEL中荧光团修饰的EdUTP多环染料与DNA小沟的亲和力TdT针对DNA缺口的亲和力酯酶水解后发光吗啉基决定特异性酯酶水解后与蛋白质结合而被困于胞内目录1.流式细胞术的概念与目的2.流式细胞术与其他免疫学实验技术的异同3.流式样本的制备4.流式细胞仪检测原理与数据含义5.流式抗体的选择6.流式实验常见问题流式抗体抗体荧光基团与常规抗体的区别CD4 Monoclonal AntibodyAnti-Human CD4 Monoclonal Antibody (APC Conjugated) Purified Anti-Human CD4 Monoclonal AntibodyLE/AF Purified Anti-Human CD4 Monoclonal Antibody对照组同型对照组实验组单细胞悬液偶联有荧光基团的抗体细胞或组织匀浆组织固定后切片单细胞悬液细胞或组织平均水平无法反应组织内的异质性定量方便可反映单细胞水平信息可反映细胞之间的空间位置信息只反应单个切面信息细胞固定后会有变化活细胞水平多参数（已有28色报道）高通量（每秒数万细胞）可半定量比较流式细胞术与WB 、IHC 实验的区别目录1.流式细胞术的概念与目的2.流式细胞术与其他免疫学实验技术的异同3.流式样本的制备4.流式细胞仪检测原理与数据含义5.流式抗体的选择6.流式实验常见问题流式样品的制备：不同组织的处理血液：自然状态下已经是单细胞，剔除红细胞即可淋巴器官:（脾脏、淋巴、骨髓、胸腺）含结缔组织较少，研磨即可（脾脏和骨髓需要剔除红细胞）非淋巴器官:（肿瘤组织、脑、肝脏等）一般需要胶原酶处理得到单细胞悬液培养的贴壁生物细胞：避免胰酶消化筛网过滤，除去细胞团缓冲液中加入DNA酶可减少细胞成团尽量使用新鲜细胞，染色后固定，最好在4h内检测流式样品的制备：一般流程流式检测注意事项：染色液中加入BSA，封闭容器和细胞表面抗体的浓度比总量更重要细胞量大的实验需要对抗体进行滴定染色条件：室温vs 4°C流式样品的制备：肿瘤浸润免疫细胞的流式检测肿瘤组织分离--> 剪成小块--> 胶原酶+DNA 酶--> 洗涤+染色-->上机检测/tissuedissociation/• I 型: 各种酶成份均衡，推荐用于上皮组织，肝，肺，脂肪和肾上腺组织样本，可用于获取淋巴细胞•II 型:较高的梭菌肽酶A 含量，通常用于分解心脏，骨，肌肉，甲状腺和软骨瘤组织•III 型:低蛋白水解酶活性，普遍用于乳腺组织•IV 型: 多种蛋白酶成分，能消化多种组织。

1.我该定制单抗还是多抗？首先应该考虑的就是定制的抗体是应用于什么实验，需要的量是多少？对于科研用户来说1. 抗体常常应用于WesternBlotting、IP等实验中，对于抗体的特异性有一定的要求，但并不是特别的强调2. 往往在研究很多新的蛋白时，并不确定新蛋白是否很重要，是否会是将来很长一段时间的研究重点，所以抗体用量也不大所以针对科研用户，在定制新的蛋白的抗体时，我们强烈建议首先制备多抗用于实验，当得到了理想的实验结果并需要长期的使用该抗体时再考虑制备单抗。

当然，如果您对该抗体的特异性要求特别高（多抗的特异性已无法满足实验要求，比如应用于流式细胞术等）时，还是应该定制单抗对于工业用户来说1. 抗体往往应用于检测定量实验或者功能性实验，对于抗体的特异性要求非常之高2. 目标蛋白基本上都是已知的确定有相当商业开发价值的，而且产品一旦形成，用量会非常大所以针对工业用户，基本上可以直接定制单抗2.我该选多肽还是蛋白作为抗原呢？需要根据抗体应用于什么实验，以及您所能获得的材料来决定1. 实验过程中蛋白处于天然状态，这时使用的抗体识别的一般是蛋白的构象表位和线性表位；这样的实验主要有CO-IP、FACS、Neutralizing/Blocking以及Elisa法检测天然蛋白等2. 实验过程中蛋白处于变性或半变性状态，这时大部分的构象表位已被破坏，抗体识别的一般都是线性表位；这样的实验主要有：Western、IHC/ICC/IF等以多肽作为抗原制备的抗体，识别的是线性表位，在使用时蛋白处于变性或半变性状态下，结果可以令人满意；但不能够保证识别天然蛋白以蛋白作为抗原制备的抗体，识别蛋白的线性和构象表位，基本上所有的实验都可以应用，所以，用蛋白作为抗原应是首选，但是在多肽抗原已可满足实验要求而且得到蛋白有一定难度的情况下，以多肽作为抗原制备抗体更加合适。

3、什么情况应该考虑用设计多肽做抗原？答：如果氨基酸序列已知，但是由于基因克隆或表达等原因得不到抗原蛋白，或者仅需要得到针对抗原蛋白某几个特定表位的抗体，就可以采用多肽合成的方式得到抗原。

W e s t e r n b l o t一抗和二抗的选择Westernblot一抗和二抗的选择抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE 五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。

在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。

轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。

二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。

由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。

二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。

二，如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，**捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。

检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。

Westernblot一抗和二抗的选择抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE 五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。

在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。

轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。

二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。

由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。

二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。

二，如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，**捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。

检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。

如何选择合适的流式抗体随着流式细胞术应用领域的日益广泛，流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多，加上多色分析实验方案需求的增长，逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题，给实验顺利开展带来了诸多困扰。

流式抗体如何选择，也成为了流式技术是否能被成功应用的关键因素之一。

如何从众多的流式厂商中筛选出最适合您的抗体，优宁维交给您方法：第一：满足所需抗体的基本要求（抗原、识别种属、能用于流式实验）①目标蛋白特异性：确定目的细胞的特异性表面标记或者胞内标记，确定检测指标；②识别种属：严格按照样本种属来源进行选择，流式抗体基本无法进行种属交叉反应；③可用于流式实验,说明书中明确标注经FC 实验测试，最好有实验数据图和用量说明；在查询抗体时这三要素是抗体查询必需填写项，下面是正确示范案例图1（参考优宁维官网高级查询）流式微信公众号：流式专家或UNIV-FCMsolution图1第二：确定流式细胞仪的配置（激光器+探测器）图2任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱：第一个是激发光谱（Excitation，Ex）：–是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。

–吸收波峰（最大吸收波长）。

第二个是Ex-Max 发射光谱（Emission）：–是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光。

–发射波峰（最大发射波长）：Em-Max 发射波峰--最大发射波长。

（如图2）那么荧光素跟我们的流式抗体选择有什么关系？在设计流式配色方案前，根据可能需要同时检测指标的多少，先确定需要在哪台流式细胞仪上机检测，对该仪器的参数配置，要了解以下几个方面信息：①激发器：常见的流式细胞仪有 405，488nm 和 635nm 三个激光器，不同流式仪器激光器配置不同，但有些机器在购买时只装了一个激光器，需要注意的是，型号相同的机器也未必激光配置相同;激光器是跟荧光素的激发波长相关，所选择荧光素一定是流式仪器激光激发范围内的。

W e s t e r n b l o t一抗和二抗的选择Westernblot一抗和二抗的选择抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE 五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。

在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。

轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。

二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。

由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。

二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。

二，如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，**捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。

检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。

protein l抗体流式全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白质抗体是由免疫系统产生的一种具有特异性的蛋白质，可以与目标蛋白质结合形成蛋白质复合物。

蛋白质抗体可以通过多种方式制备，例如从动物、细胞培养液或合成等方式获得。

蛋白质抗体通常用于识别、检测、纯化目标蛋白质，也可以用于研究目标蛋白质与其他生物分子的相互作用。

流式细胞术是一种通过检测细胞表面或内部蛋白质的技术，它利用流式细胞仪对标记有不同蛋白质抗体的细胞进行分类和分析。

在流式细胞仪中，细胞经过标记的蛋白质抗体与荧光染料结合并发出荧光信号，通过检测这些信号可以分析细胞表面或内部蛋白质的表达水平、分布情况等。

流式细胞术不仅可以用于检测某种蛋白质抗体在细胞中的表达情况，还可以通过多色标记不同蛋白质抗体，来研究多种蛋白质在细胞内的相互作用。

蛋白质抗体流式分析在生命科学研究中具有重要的应用价值。

通过蛋白质抗体流式分析可以对细胞表面或内部蛋白质的表达水平进行快速准确的检测，为科学家们提供了用于疾病诊断、药物筛选等研究的重要数据。

蛋白质抗体流式分析可以用来研究蛋白质间的相互作用，通过多色标记不同蛋白质抗体，可以同时检测多种蛋白质在同一细胞中的表达情况，揭示蛋白质间的相互作用网络。

蛋白质抗体流式分析还可以用来研究免疫细胞的功能、细胞凋亡等生理过程，为揭示生命科学的奥秘提供了有效工具。

蛋白质抗体流式分析是一种能够准确、高效地研究蛋白质在细胞内的表达情况和相互作用的技术，为生命科学研究提供了重要的工具和方法。

随着流式细胞仪技术的不断发展和完善，相信蛋白质抗体流式分析将在未来的生命科学研究中发挥越来越重要的作用，为揭示生命的奥秘、探索未知领域提供更多的新思路和方法。

【此文共504字】。

第二篇示例：流式细胞术是一种用于研究蛋白质和细胞的技术，因为其在检测细胞膜上特定蛋白质的表达和分析细胞群中不同类型的细胞上的应用而变得越来越受欢迎。

利用特定抗体结合靶蛋白进行检测的流式分析是一种常见且有效的方法。

抗体药物筛选的一般方法
抗体药物筛选的一般方法包括以下步骤：
1. 选择适当的靶标：根据疾病的特征和致病机理，选择适当的靶标，如细胞表面蛋白、细胞因子及其受体等。

2. 制备抗体库：制备包括单克隆和多克隆抗体在内的抗体库，通过不同的筛选方法进行抗体筛选。

3. 筛选抗体：利用ELISA、PCR、流式细胞术等方法对抗体库进行筛选，筛选出具有高亲和力、高度特异性、低副作用等优良特性的抗体。

4. 验证抗体：在试管和体内进行抗体验证，如体内药物动力学、药物药效学、毒性测试等，以确定抗体的安全性和有效性。

5. 优化抗体：通过改变抗体结构、引入基因工程技术等方法进行抗体的优化，提高抗体的亲和力和特异性，降低免疫原性等。

6. 开发生产工艺：根据抗体的特点和用途开发相应的生产工艺，如细胞培养、蛋白纯化等。

7. 工业化生产：将筛选出的优良抗体进行工业化生产，以满足临床需求。

抗体检测常用筛选方法抗体检测是一种关键的方法，可用于检测人体内的抗体水平，以判断是否感染了某种病原体或接种了某种疫苗。

通过抗体检测，医生可以评估病人的免疫状态，并进行相应的治疗和预防。

在抗体检测中，常用的筛选方法包括酶联免疫吸附检测（ELISA）、免疫荧光检测、免疫印迹和流式细胞术等。

首先，酶联免疫吸附检测（ELISA）是一种常用的抗体检测方法。

ELISA利用抗原与抗体的特异性结合来检测抗体的存在。

该方法通常涉及将目标抗原吸附到固定表面上，然后与待测样品中的抗体相互作用。

通过添加特定的酶标记抗体和底物，可以观察到酶的催化反应，从而确定抗体的存在和数量。

其次，免疫荧光检测是一种基于荧光标记的抗体检测方法。

该方法使用荧光染料标记的抗体与待测样品中的抗原相互作用。

当光束照射待测样品时，荧光染料会发射出特定的荧光信号。

通过观察样品中的荧光信号的强度和分布，可以确定抗体的存在和分布情况。

另外，免疫印迹是一种常用的蛋白质检测方法，也可以用于抗体的筛选。

该方法涉及通过将待测样品中的蛋白质分离和定位。

首先，样品中的蛋白质会通过凝胶电泳分离，然后转移到固定于膜上的蛋白质上。

接下来，待测样品中的蛋白质与特定抗体相互作用，这些抗体通常以酶标记。

最后，通过加入底物，可以观察到酶的催化反应，并确定抗体的存在和数量。

最后，流式细胞术是一种用于细胞表面抗原检测的方法。

该方法涉及将待测细胞与荧光标记的抗体相互作用。

通过在流式细胞术仪器中将细胞悬浮在液体中，并通过激光束照射，可以测量荧光标记的抗体所产生的荧光信号的强度和分布。

通过观察细胞表面抗原的荧光信号，可以确定抗体的存在和数量。

抗体检测是一种重要的实验室技术，具有许多临床应用。

它可以用于诊断疾病，评估疫苗的有效性，监测患者治疗过程中的免疫反应等。

通过选择适当的抗体检测方法，可以提高检测的灵敏性和准确性，为医生提供更多的有关患者免疫状态的信息。

然而，抗体检测也存在一些局限性。

经典——教你如何选择流式抗体一、如何搭配流式抗体荧光标记流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定的：流式细胞仪能检测多少个通道、需要同时检测检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记。

如果流式细胞仪的通道越多，那么同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多.A、如何根据流式细胞仪搭配流式抗体流式细胞仪能检测多少个通道是由有多少根激光决定的以及每根激光的功能决定的，所以首先需要注意两点：流式细胞仪有哪些激光。

不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的.B、搭配荧光素原则搭配流式荧光素有2个原则：每个通道只能选择1种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配，但需注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的话，上流式以后，容易导致补偿过度。

C、如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道，怎么办？如果需要做5个指标，而流式细胞仪只能做4个通道，首先将指标归成2类，再将样本分成2份，分别检测。

比如需要同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么将样本分成两份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。

二、同型对照（Isotypy Control）编辑本段回目录1、为什么要用同型对照？同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。

同型对照是真正意思上的阴性对照，它不但可以用来设定流式细胞仪的电压，而且还可以帮忙省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。

在流式细胞仪上样前，染色方式如下：样本管：一抗＋样本同型对照管：同型对照＋样本2、如何选择同型对照？一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体，比如抗人的CD56 APC标记的抗体，货号是555518,成份是Mouse IgG1,κ。

那么它的同型对照应该是APC标记的Mouse IgG1,κ，货号是555751。

抗体选择随着生命科学的发展，围绕蛋白进行的研究越来越多，抗体试剂在实验中的重要性越来越举足轻重。

面临着纷呈复杂的抗体试剂市场，如何选择到适合自己实验的抗体就变得尤为重要。

当我们要检测目的蛋白在组织中表达情况的时候，如何选择适合我们实验需要的抗体，并恰当保存使用，是每个科研人员需要细心考虑的。

抗体种类繁多，品牌众多，技术参数不一，价格和质量更是相差甚大，如何购买到高质量价格合适的抗体，并准确地做出我们想要的结果，其中有很多细节需要注意。

一、抗体选择总体原则1. 关于特异性的选择特异性的选择主要需要考虑四个方面：蛋白特异性、种属特异性、实验方法特异性、标记物的特异性。

（1）蛋白特异性针对需要检测的蛋白查找抗体，几个细节要区分，重组表达的蛋白和内源性蛋白的检测，对抗体的要求是不一样的，注意查看抗体说明书的检测说明。

如果重组蛋白不是全长表达，则需要注意抗体的免疫原区域是否在重组蛋白区域内。

内源性蛋白最好能清楚其剪切与修饰的方式，特殊表型的蛋白需要进行序列比对，并结合抗体免疫原序列，查看交叉反应的情况。

磷酸化蛋白检测需要确定具体位点，不同位点的磷酸化意味着可能有不同的机制存在，不宜一概而论。

（2）种属特异性同种蛋白不同物种，有着或大或小的差异。

目前大部分商品化抗体都是以人源蛋白序列为模板重组蛋白或设计多肽抗原的，根据蛋白的同源性情况与其他种属发生交叉反应。

需要参照说明书注明的可反应种属信息。

一些稀有种属很难找到抗体，可以通过蛋白的序列比对，选择同源序列免疫的抗体，不过一般这种情况生产商不会受理其关于质量的申诉，如果可以申请到免费的抗体样品，则利于抗体选择。

（3）实验方法特异性目前使用抗体的实验方法有很多，不同的使用方法过程中，因为对蛋白样品的处理方式不一样，蛋白的含量有差异，对抗体的识别表位和效价要求都是不一样的。

具体的根据说明书注明的产品应用方法进行选择。

但是生产商一般不会将每个抗体都进行各种实验的检测，目前检测比较多的只是WB、IHC、IF等，如果针对具体的实验方法没有找到合适的抗体的，可以结合蛋白序列分析和抗体的抗原信息，选择尽可能有效果的抗体。

1)细胞膜荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。

②按照上样管标记分别加入对应的荧光抗体（一般抗体为20ul/100ul血，PE-Cy5和ECD标记抗体一般为10ul/100ul），室温避光反应15min。

③加入2ml溶血剂，避光室温溶血10min~15min，目测血样呈透明的淡红色，1500rmp离心5min，去上清。

④加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤两次。

⑤加入1mlPBS或者生理盐水重悬细胞，准备上样。

注意事项：●加入血样和抗体前，须注意编号和血样及抗体的一致性。

●实验室要注意冬天保温，夏天降温，防止室温过低或过高，影响抗原抗体反应。

●溶血时，溶血剂和血样的比例为50:1，当血样体积发生变化时，注意溶血剂体积的变化。

2)细胞膜kappa/lambda荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。

②加入2ml溶血剂，避光室温溶血10min~15min，目测血样呈透明的淡红色，1500rmp离心5min，去上清。

③加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤三次④沉淀物中按上样管标记分别CD45-PE-CY5和kappa/lambda试剂盒和同型对照，避光反应15~30min⑤加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤两次⑥保留沉淀物种加入1mlPBS或者生理盐水，准备上样。

注意事项：●沉淀物中的液体不能留太多，控制保留液体体积，保证抗体效价●溶血判断请参照细胞膜荧光抗体标记标准操作规程3)细胞内荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。

②按照上样管标记分别加入对应的包膜荧光抗体（一般抗体为20ul/100ul血，PE-Cy5和ECD标记抗体一般为10ul/100ul），室温避光反应10min。

③加入破膜剂试剂盒A液100ul剧烈震荡混匀，避光固定10min④加入约4ml（2/3上样管液体），1500rpm离心5min，去上清⑤沉淀物首先剧烈震荡混匀，然后小心加入破膜剂试剂盒B液100ul，不得震荡和剧烈摇晃，避光反应5min⑥加入上样管所标记对应的胞内荧光抗体，避光反应15min⑦加入约4ml（2/3上样管液体），1500rpm离心5min，去上清⑧重复步骤7两次，加入1mlPBS或者生理盐水，准备上样。

流式抗体比率计算公式引言。

流式细胞术是一种用于分析和排序细胞的技术，它可以通过测量细胞表面或内部的特定蛋白质来对细胞进行分类和分析。

在流式细胞术中，抗体被用来标记特定的蛋白质，从而使得这些蛋白质能够被流式细胞仪检测到。

在流式细胞术中，抗体的使用是非常重要的，而抗体的效率和准确性则取决于抗体的比率。

本文将介绍流式抗体比率的计算公式以及其在流式细胞术中的重要性。

流式抗体比率计算公式。

流式抗体比率是指在流式细胞术中使用的抗体的比率。

它通常是指抗体的浓度和细胞数量之间的比率。

流式抗体比率的计算公式如下：流式抗体比率 = 抗体浓度 / 细胞数量。

其中，抗体浓度是指在流式细胞术中使用的抗体的浓度，通常以ug/ml或ng/ml为单位；细胞数量是指在流式细胞仪中进行分析的细胞的数量。

流式抗体比率的计算公式可以帮助实验人员确定在流式细胞术中使用的抗体的适当浓度，从而确保流式细胞分析的准确性和可靠性。

流式抗体比率的重要性。

流式抗体比率在流式细胞术中非常重要。

正确的抗体比率可以确保流式细胞术的准确性和可靠性。

如果抗体的浓度过高，可能会导致假阳性结果，从而影响实验的准确性；如果抗体的浓度过低，可能会导致假阴性结果，从而影响实验的灵敏度。

因此，确定适当的流式抗体比率对于流式细胞术的成功非常重要。

另外，流式抗体比率的计算公式还可以帮助实验人员确定在流式细胞术中需要使用的抗体的数量。

通过计算抗体的比率，实验人员可以确定在流式细胞仪中需要使用的抗体的数量，从而确保实验的成功。

实验操作。

在进行流式细胞术之前，实验人员需要确定适当的流式抗体比率。

以下是一些实验操作的步骤：1. 确定抗体的浓度，首先，实验人员需要确定在流式细胞术中使用的抗体的浓度。

通常，抗体的浓度是根据厂家提供的建议浓度来确定的。

实验人员可以根据厂家提供的建议浓度进行初步实验，然后根据实验结果来确定最适合的抗体浓度。

2. 计算细胞数量，实验人员需要确定在流式细胞仪中进行分析的细胞的数量。

抗体的选择：在选择上一般建议实验种属和抗体种属亲缘性越远越好，不宜同源。

二、一抗、二抗的选择原理及方法1. 一抗选择要点（从兔血清里制备的叫兔源多克隆抗体）（1）确定抗体的名字，注意中英文名字、它名、亚型等信息。

（2）确定你的实验类型，Elisa，WB，IHC，ICC，还是FACS。

一般抗体的说明书都会列出该抗体经验证过适用于何种实验的类型，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种实验验证，请根据说明书列出的已验证的类型来选择适合你实验的抗体。

（3）确定实验样本的种属，Human，Mouse，还是Rat。

一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种物种实验，请根据说明书列出已验证的种属来选择适合你实验的抗体。

（4）样本蛋白的结构性质。

了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，待测样本蛋白的结构域和样本在提取和处理过程中是否会变性，蛋白空间构象的改变，会影响抗体的免疫亲和反应。

（5）单多克隆抗体的选择。

市面上的抗体还是以多克隆抗体为主，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。

2. 二抗选择要点（1）种属来源。

主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。

（2）标记物的选择。

有HRP、Biotin、荧光素等标记物。

一般SP三步法二抗选择Biotin标记的二抗，以与后面的SP结合反应，而免疫荧光染色就需要购买不同荧光素标记的二抗，如罗丹明、FITC、Cy3等常用荧光素。

只是生产商在检测时使用了不同的种属不同的样品类型，或是参照了不同的文献，对使用者来说，同样的样品，不管使用哪个品牌的，只要抗体是对的，目的条带只会出现在相同的位置。

关于分子量的问题，一般不建议看产品说明，WB中条带的位置由样品决定，并不会因为抗体不同而不同。

老板让我用流式的方法检测TH1217，我却一头雾水？小A：罗工你好，我接了一个课题，检测小鼠脾脏Th亚群的变化，一查文献就懵了，为啥脾脏的Th亚群检测的biomarker，有IFN,IL-4这些炎症因子呢？不是说一般鉴定细胞亚群都一些CD3，CD4开头的表面Marker吗？罗工：别急，我来告诉你，之所以检测这些炎症因子，是由Th1，Th2，Th17这些Th细胞亚群的特殊性导致的。

我们知道Th细胞包含了很多功能性亚群，但是截至目前，这些亚群本身的表面biomarker 知之甚少，有些文章中提出一些趋化因子受体CXCR3,CCR4,CCR6是其表面marker，然而这些文章绝大部分都是human的样本。

对于小鼠样本，我们只能退而求其次，从其细胞能特异性分泌某种炎症因子的特点上，来反推这类细胞是什么。

比如能分泌IFN-g的细胞我们一般认为其是Th1型细胞，能分泌IL-4的我们认为是Th2型细胞。

因此这些炎症因子正是用来作为鉴定区分Th亚群的关键指标，当然有时候我们也会选择更深层的核转录因子，比如Treg的常见指标就是Foxp3这个核转录因子：小A：哦！我大概明白了，那我就直接检测这些指标就行了？这些炎症和转录因子的流式检测和我之前做的CD3，CD4，CD8的染色有啥不一样的地方吗？罗工：炎症和转录因子的检测和表面染色很不一样。

小A：啊？不会吧，我就会染些简单的，咋办？罗工：别急，我来告诉你这些指标怎么染色，保证一看就懂：首先，不论炎症还是胞内因子都是无法像CD3那样直接加抗体染色的，因为我们常用的荧光流式抗体不具备自主穿透细胞膜的功能，直接加进去只会被细胞膜挡在门外，想要染上他们，需要我们手动给细胞建立抗体进入其内部的通道，即固定/破膜步骤。

固定可以让细胞内部的蛋白结构稳定下来，破膜可以让细胞表面产生孔径，方便荧光抗体进入内部染色：小A：原来是这样，那还好，可以接受，就是麻烦点。

但我怎么听师兄师姐说做炎症因子流式特别难，而且做一次实验时间特别长？罗工：这个确实，炎症因子的流式实验会多出一个步骤，就是体外刺激。

流式抗体的选择：1 流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择最基本的条件：目标蛋白特异性，反应种属以及应用实验。

2 流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。

在流式实验过程中，尽量减少实验工序和过程，以保证实验的真实和准确性。

因此在条件允许的范围内，建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。

3 流式抗体荧光标记的选择：如果实验中检测单一指标：不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。

FACS Calibur仪器为例：PE ＞APC ＞PE-Cy5 ＞PerCP ＞FITC ＞PerCP-Cy5.5，通常来说，PE最强，适用于弱表达抗原。

FITC强度较弱，适用于强表达抗原，使用范围比较广。

用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。

如果同时检测多个指标：确认流式细胞仪能检测多少个通道：流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。

各个通道之间的荧光素可以随意搭配。

如：实验者同时检测三个指标，可以在图1中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记，FITC、PE和PE-cy5。

切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响最后结果。

因此，流式细胞仪的通道越多，同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。

常用荧光标记包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。

同型对照的选择：流式细胞实验和其他抗体相关实验有点不同的就是需要选择同型对照。

同型对照，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，相当于实验的阴性对照。

同型对照选择与标记抗体同种属来源，同亚型，同荧光标记的抗体。

比如：抗人的CD3的PE标记的抗体，小鼠的IgG2a。

同型对照选择PE标记的小鼠的IgG2a。

流式抗体使用注意事项：1、建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。

细胞过量或抗体过量都可能使实验结果受影响，因此需要优化试验条件。

注：不同的流式技术对抗体的需求量有较大差异，例如传统流式细胞术（采用鞘液流系统）需要1×106个细胞为起始上样量，抗体用量为10μl，而微流式细胞术则只需5×105个细胞，抗体用量减少到5μl。