土壤微生物的分离纯化及理化性质的研究

从土壤中分离和纯化细菌、放线菌(华南师范大学生命科学学院 10生物技术与工程2班第3组)摘要:土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物的主要菌源。

通过采用无菌操作技术，先用稀释法制备土壤的菌悬液，然后结合选择培养基用平板划线法分离出纯菌株，最后用斜面接种的方法对菌株进行保存。

通过观察和描述培养特征对菌株所属类群进行初步鉴定，对放线菌进行镜检，对细菌进行革兰氏染色方法观察，以及进行细菌最适合pH生长的初步研究。

观察到放线菌的孢子结构；得知该细菌为革兰氏阴性菌，且研究得知该细菌最适合生长的pH是7.48。

关键词：土壤；分离；纯化；放线菌；细菌；pHSeparate and purify the bacteria andactinomycetes from the soilLiu GuoXing，Lin Qiongfen, Mo Dan(Biological technology and engineering， College of Biological Science , South ChinaNormal University )Abstract:The soil is the microorganism life supreme headquarters, and is the main fungus source to seek the important application potential microorganism. Through the aseptic technique, uses the dilution method preparation soil the fungus to hang the fluid first, then the union choice culture medium separates the pure strain with the plate streaking law, finally uses the incline vaccination the method to carry on the preservation to the strain. Through the observation and describe training characteristics on the preliminary appraisal belongs strains groups, actinomyces on anti-bma bacteria to gram stain method observation, and the most suitable for the growth of bacteria pH preliminary study. We have observed the actinomycetes’spore structure and known this bacterium is a kind of the Gram-negative bacteria. Besides, through the research we have known that the most suitable pH for the bacterium to grow is 7.48.Key words:soil; separation; purification; actinomycetes; bacteria; pH引言土壤是微生物生活的大本营，不同土壤中各类微生物的数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次是放线菌和霉菌。

其中，大多数细菌的最适宜pH为6.5-7.5，放线菌一般生活在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中。

要想从土壤中获得某种微生物的纯培养，可以采用平板划线法进行分离纯化，借助沾有菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散成为由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。

利用选择培养基抑制其他菌的生长而使某种菌充分生长的特点，结合牛肉膏蛋白胨培养基和高氏1号培养基可分别选择出细菌和放线菌。

通过该实验学习从样品中分离不同微生物的方法，掌握梯度稀释法、平板划线法和斜面接种等方面的无菌操作技术，熟悉对微生物观察与研究的方法，如影印法观察放线菌，革兰氏染色法观察细菌，分光光度计计数法研究细菌的理化性质（pH）等。

微生物与人类息息相关，它对人类的假定贡献和无法估量的开发潜力。

为我们展开了广阔的应用前景，所以研究微生物的生命活动有着重要意义，其中pH与微生物的生命活动有密切联系[1]。

为了更好地为人类的生活和健康做出更大的贡献，将进一步探究 p H 对微生物的影响。

为了更好地为人类的生活和健康做出更大的贡献，将进一步探究pH对微生物的影响。

1.材料与方法1.1材料研究材料：土壤（于实验前采集后马上进行稀释，制备菌悬液）1.2方法1.2.1梯度稀释法（稀释）A.称取土样2.00g，在火焰旁加到一个盛有48ml无菌水并装有玻璃珠的100ml锥形瓶中。

振荡20-30min，使样品中的菌体、芽孢或孢子均匀分散。

静止20-30s，标记为编号1。

B.按照一定的梯度进行稀释（该实验采用20倍梯度）①取3个各装有9.5ml无菌水的25ml锥形瓶，分别按照顺序标记好2、3、4.②在无菌操作台上，用微量移液器从1号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到2号锥形瓶中，摇匀后，再用微量移液器从2号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到3号锥形瓶中，依此类推，分别将土壤悬液稀释20、400、8000倍③然后将4个锥形瓶的悬液分别涂布在已经制备好的牛肉膏蛋白胨平板和高氏1号平板上（分别编号1-4），置于28度培养箱中培养（细菌培养2d，放线菌培养3d）1.2.2 平板划线法（纯化）采用平板划线法的分区划线法。

将平板分四个区域，其中第四区是单菌落的主要分布区域。

先将接种环沾取少量菌在平板第一区划若干平行线，将接种环上多余菌体烧死。

平板转动60-70º后，再以第一区划线的菌体为菌源，由第一区向第二区作第二次的平行划线，依次在第三区和第四区划线。

1.2.3斜面接种技术（保存）取接种环→接种环冷却、取菌→接种→培养1.2.4影印法（观察）在最后划线的培养基用小刀小心地铲一个单菌落，翻过压印在载玻片中央，小心地移开菌落，载玻片中央就留下了菌落印痕。

在火焰下固定，滴一滴石炭酸复红染色液染1分钟，水洗晾干，至于高倍镜或油镜下观察。

1.2.5革兰氏染色法（观察）1.2.5.1制片细菌涂片→固定→结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红复染→观察1.2.5.2镜检将染色后的载玻片，先用低倍镜找到目的物，在用高倍镜观察，最后滴加一小滴液体石蜡油与涂片处，用油镜进行观察，观察细菌的形状和排列方式，以及记录颜色结果。

1.2.6分光光度计计数法，浊度法（测量）①不同pH的菌液的培养在已经培养好的PH为7的锥形瓶中分别吸取0.5ml的菌液于其他各PH梯度的液体培养基（已标记为pH6、pH6.5、pH7、pH7.5、pH8）中，置于37℃的摇床中培养32h,转速为180r/min。

②测量光密度值（OD）先从摇床中取出观察各菌的生长情况，并分别置于比色杯中测定600nm的OD值。

分别用各个浓度所对应的试管中的空白培养基做对照③记录数据后，以光密度（OD）值为纵坐标，pH值为横坐标，绘制标准曲线。

1.结果与分析2.1平板划线法纯化结果2.1.1放线菌平板第二次划线后基本可以纯化出较高纯度的放线菌单菌落，从图中可以看出，培养基上的放线菌纯度较高，大小形状也较相近，基本没有杂菌的存在。

放线菌的菌落较小，质地不均匀，中间厚边缘薄，表面呈粉末状（覆盖有灰色的孢子），干燥、较厚，不透明，与培养基结合紧密，菌落正反面、中心与边缘颜色不一致，具有泥腥味。

镜检时看到的大多为散落的放线菌孢子，较难看到放线菌的细胞结构。

2.1.2细菌平板图1：放线菌第二次划线（正面） 图2：放线菌第二次划线（反面）第二次划线后基本可以纯化出较高纯度的细菌单菌落，从图中可以看出，单菌落普遍都较小，表面较光滑、湿润、粘稠，质地均匀，透明，正反面颜色一致，菌落与培养基结合不紧密，具有臭味。

2.1.3最终斜面保存图5：分离纯化后最终获得的细菌斜面（左）及放线菌斜面（右）最后将于培养箱28℃恒温培养的斜面取出，进行保存。

如图细菌无杂色，放线菌培养至孢子成熟。

2.2影印法观察放线菌图6:放线菌影印法观察(10×40)视野中主要看到的是孢子结构，基本上看不到完整的气生菌丝结构，孢子形状为圆形，成熟的分生孢子呈现黑色。

2.3革兰氏染色法观察细菌图7:细菌的革兰氏染色(10×40)革兰氏染色后镜检发现该细菌被染成了红色，说明该细菌为革兰氏阴性菌。

革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的脂类物质，而肽聚糖含量较少，交联度又低，故用脱色剂脱色时，溶解了脂类物质，增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物容易渗出，结晶紫细菌细胞被脱色，经复染后，就染上复染液的颜色，呈红色。

而革兰氏阳性细菌细胞壁中肽聚糖的含量高且交联度高，脂类含量少，经酒精或丙酮脱色时，肽聚糖层的孔径变小，通透性变低，因此细胞仍保留初染时的紫颜色。

2.4分光光度计计数法测量细菌最适宜生长pH2.4.1预实验（波长600nm ）：图8：预实验OD 值随pH 变化折线图预实验OD值随pH变化折线图012345 3.02 5.977.068.0411pHOD值平均OD值实验OD值随pH变化折线图123455.976.537.067.488.04pH OD值平均OD值从预实验可以推测该细菌的最适生长pH 介于7与8之间，因此可在pH7、8之间取几个梯度做进一步的实验，寻找该细菌生长的最适pH 。

2.4.2实验(波长600nm)：图9：实验OD 值随pH 变化折线图在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与光吸收值(OD)成正比，菌数越多，OD 越大。

因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的OD ，就可反应出菌液的浓度。

菌液浓度越大,说明该菌在这个pH 值中生长的越好,则越接近该菌的最适pH 值。

本实验测定细胞培养物在600nm 光吸收，从预实验中得出pH 在7.00左右的时候该菌生长得最好。

再把pH 的梯度范围缩小，同样得到pH 值为7.48（接近7.50）时，OD 值最高，即在该实验中pH 值7.48是细菌的最适pH 值，因此可以知道该细菌的最适pH 值在7.48左右。

3.讨论3.1实验的结论3.1.1土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物的主要菌源，能够分离出细菌，放线菌等常见微生物。