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RNAi的原理和应用

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RNAi的原理和应用

摘要：RNA干扰(RNA interference ,RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。在内切核酸酶(一种具有RNase Ⅲ样活性的核酸酶，称为Dicer.) 作用下加工裂解形成21～25 nt （核苷酸）的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA ,即siRNA。果蝇中RNase III 样核酸酶Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 结合域和PAZ 结构域. 已发现在哺乳动物中也存在Dicer 同类物。 siRNA与特定的酶结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC。

关键词：RNA干扰 siRNA miRNA 抑制机制

Principle and application of RNAi

Wang Chunrong

Sichuan Normal University.

Abstract: RNA interference (RNA interference, RNAi) is a defense

mechanism of evolutionary

conserved against transgenic or alienvirus invasion. The endonuclease (one with RNase Ⅲ like activity of nuclease, referred to as

Dicer.) processing fracture formed under the action of 21 ~ 25

NT (nucleotide) composed of sense and antisense sequences

of small interfering dsRNA, namely siRNA. RNase III like nucleic

acid enzyme Dicer in Drosophilacontains helicase (helicase) activity

and dsRNA binding domainand PAZ domain. Have been found

in mammals there are Dicer analogues. SiRNA and specific

enzyme combined with the formation of RNA induced silencing

complex RISC.

Keywords: siRNA miRNA RNA interference suppressionmechanism

目录

第一章对RNA干扰的基本认识………………………………………………………1

1.1 RNA干扰提要………………………………………………………1

1.2RNA干扰的发现…………………………………………………………………………….1

第二章作用机制………………………………………………………………………………2

2.1RNA干扰的作用机制…………………………………….........................2

2.2RNA干扰的分子抑制机制…………………………………………………3

2.2.1 转录抑制…………………………………………………………………………………..3

2. 2.2 转录后抑制……………………………………………………………………….………3

2.2.3 翻译抑制…………………………………………………………………………………..3

第三章RNA干扰的作用…………………………………………………………….4

第四章RNA干扰的应用…………………………………………………………….4

参考文献…………………………………………………………………………………….6

致谢……………………………………………………………….. …………………………6

前言：RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默[1] 。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic

RNAi)[2][3]。在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚到于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。RNAi现象在生物中普遍存在。

正文：

第一章对RNA干扰的基本认识

1.1 RNA干扰提要

RNA干扰(RNA interference ,RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA ,dsRNA) 导入细胞后,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制( posttranscriptional gene siliencing , PTGS) 范畴。RNAi 广泛存在于生物界,从低等原核生物,到植物,真菌,无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象,只是机制也更为复杂。

RNA干扰(RNAi)是近年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法，该技术通过双链RNA的介导，可以特异性地阻断或降低相应基因的表达。在肿瘤研究中，通过RNAi技术可以选择性地抑制人类肿瘤相关基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长。该技术的应用为癌症的基因治疗提供了新的方法。

癌基因的激活认为是肿瘤发生的根本原因之一，各种癌基因都可以成为肿瘤基因治疗的靶点。利用基因家族中多个基因具有同一段同源性很高的保守序列这一特性,针对这一区段序列设计相应的siRNA，通过体外合成或构建在体内表达siRNA的载体的方法转入细胞中，可以特异性的封闭这些基因的转录产物而不影响其他基因的表达。

1.2RNA干扰的发现

RNA干扰现象是1990年由约根森（Jorgensen）研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的影响时所发现，为得到颜色更深的矮牵牛花而过量表达查尔酮合成酶，结果意外得到了白色和白紫杂色的矮牵牛花，并且过量表达查尔酮合成酶的矮牵牛花中查尔酮合成酶的浓度比正常矮牵牛花中的浓度低50倍。约根森推测外源转入的编码查尔酮合成酶的基因同时抑制了花中内源查尔酮合成酶基因的表达[5]。

1992年，罗马诺（Romano）和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达[6]。1995年，Guo和Kemphues在线虫中也发现了RNA干扰现象[7]。

1998年，安德鲁·法厄（Andrew Z. Fire）等在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中进行反义RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA显示出了更强的抑制效果[1]。从与靶mRNA的分子量比考虑，加入的双链RNA的抑制效果要强于理论上1:1配对时的抑制效果，因此推测在双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有某种酶活性参与其中。并且将这种现象命名为RNA干扰。

2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛（Craig C. Mello）由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。

第二章作用机制

2.1RNA干扰的作用机制

RNAi 的第一步是：dsRNA（双链RNA） 在内切核酸酶(一种具有RNase

Ⅲ样活性的核酸酶，称为Dicer.) 作用下加工裂解形成21～25 nt （核苷酸）的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA ,即siRNA。果蝇中RNase III 样核酸酶Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 结合域和PAZ 结构域. 已发现在哺乳动物中也存在Dicer 同类物.

RNAi 的第二步是：siRNA与特定的酶结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC(由siRNA 中的反义链指导形成)，RISC复合物中含siRNA、核酸内切酶、核酸外切酶以及解旋酶\同源RNA 链搜索活性等，其中的siRNA解链成为单链，由其中的反义链识别与其同源的靶mRNA，并与靶mRNA配对结合，在mRNA的近中点位置将靶mRNA切割，并由RISC中的酶把靶mRNA降解，从而阻断了mRNA传递遗传信息的功能。

siRNA 可作为一种特殊引物,在RNA 依赖RNA聚合酶(RdRp) 作用下以靶mRNA 为模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA ;新生成的siRNA又可进入上述循环. 这种过程称为随机降解性多聚酶链反应(random degradative PCR) . 新生的dsRNA 反复合成和降解,不断产生新的siRNA ,从而使靶mRNA 渐进性减少,呈现基因沉默现象. RdRp 一般只对所表达的靶mRNA 发挥作用,这种在RNAi 过程中对靶mRNA 的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能. 每个细胞只需要少量dsRNA 即能完全关闭相应基因表达,可见RNAi 过程具有生物催化反应的基本动力学特征.（在植物和线虫中存在的信号放大过程，但是在哺乳动物中不存在这种现象,可能与在哺乳动物体中siRNA不能作为RdR的引物有关。）

此外，：解开siRNA的双链后，反义RNA链能作为双链RNA合成的一个引物，以mRNA为模板， (RNA dependentRNA polymerases，RdRPs，又称作RDRs)的作用下形成新的dsRNA，并再次被Dicer识别并切断后形成新的siRNA，这种新产生的siRNA(次级siRNA,secondary siRNA)又可形成更多的RISC复合物并作用于mRNA，使mRNA降解。因此小剂量的dsRNA即可诱导强大的PTGS，即PTGS具有类似于激素作用或PCR那样的级联放大效应。

最新的研究进一步揭示,ATP 在siRNA 介导的RNAi 中具有重要作用. 较长dsRNA 向siRNA 的转变要有ATP 参与. siRNA 与蛋白因子形成一个无活性的约360 kD 的蛋白PRNA 复合体; 随之, siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA 复合体(RISC) ,此步具有ATP 依赖性. RISC 活性复合体对靶mRNA 的识别和切割作用,这一步可能不需ATP参与. 此外,ATP 使siRNA 5′端带上磷酸分子,且对siRNA 的功能具有重要作用. 上述过程中siRNA 双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变,因为siRNA 双链体与细胞裂解物、ATP

等孵育后再除去ATP 及其它辅助因子,含有siRNA 的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA 分子

2.2RNA干扰的分子抑制机制

2.2.1 转录抑制

与RNAi有关的dsRNA及蛋白质可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和DNA发生甲基化作用，使相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能表达。这种在转录水平上阻断基因功能，使基因沉默的RNAi方式被称为转录基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)。 这种现象先在植物中得到证实,但是在哺乳动物中是否存在仍有争议。2004年Svoboda等研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过RNAi引起靶基因表达沉默的长dsRNA不能引起相应DNA区域从头合成DNA的甲基化。Morris等也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的siRNA能够引起其区域内CG岛以及组蛋白H3K9的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。

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RNAi技术在植物基因功能研究中的应用

RNAi技术在植物基因功能研究中的应用

ＲＮＡｉ技术在植物基因功能研究中的应用

摘要 RNAi技术是研究基因功能的重要工具。其原理是对某个已知基因，设计诱导其沉默的dsRNA，通过合适手段导入细胞或机体使产生干涉效应的信号分子siRNA，导致基因表达水平下降或完全沉默。通过基因表型变化，鉴定该基因功能。从RNAi的研究背景和作用机制出发，对近年来利用RNAi技术研究植物基因功能的概况、诱导方法和载体作一综述。

关键词 基因沉默；RNAi技术；植物基因功能

1RANi的研究背景

1998年，Fire等[1]发现，过去利用正反义RNA阻断基因表达都是因体外制备的单链RNA中污染极少量双链RNA（dsRNA）所引起的，并发现在线虫中导入dsRNA，mRNA明显减少，推论存在某种机制特异地破坏降解内源mRNA，导致某个基因沉默，即转录后基因沉默（PTGS）。在此情况下，启动子是活跃的但不能正常积累mRNA。这种现象被称为RNA干涉（RNAi）。研究表明RNAi现象广泛存在大多数真核生物中，起到自行监控细胞中异常的mRNA、封闭该基因表达、抵御病毒感染及阻断转座子的作用。

RNAi技术是将人工合成或载体表达的小的双链RNA（siRNA）导入真核细胞，促使内源RNA降解，高效特异阻断体内特定基因的表达，诱使细胞表现出特定基因缺失表型，获得功能丧失或降低的突变体。RNAi技术具有高度的特异性和高效的干扰活力，是研究基因功能的强有力的工具而被广泛应用。

2RNAi的作用机制

对模式生物的研究发现[2]，生物体内外源或内源的dsRNA经酶切，可形成具有5’末端磷酸基、3’末端羟基和2个突出的单链核苷酸的信号分子siRNA，诱发RNAi机制。最近研究中还发现，在植物中除了转录后水平沉默（PTGS），RNAi也能在基因的转录水平（TGS）上发挥作用。

2.1酶的作用

参与RNAi发生的Dicer酶特异识别dsRNA，该酶依赖ATP，能将转基因和

病毒感染等引入的dsRNA，逐步切割成含21-23个核苷酸siRNA，启动细胞内RNAi反应。RNAi过程的另一种重要的酶是RNA指导的RNA聚合酶（RdRP）。RdRP的作用，使进入细胞内的dsRNA数量呈指数级扩增，RNAi效应得以放大。故少量dsRNA可使大量靶mRNA大幅度下调。

rnai干扰技术原理

rnai干扰技术原理

rnai干扰技术原理

RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是一种通过特异性降解靶向基因mRNA的方法，从而抑制目标基因表达的技术。RNAi技术的原理源于细胞内天然的基因沉默机制，通过这种机制，细胞可以利用小分子RNA来调控基因表达。RNAi技术的应用已经在基础研究和临床治疗中取得了重要进展。

RNAi技术的原理基于三个主要分子，小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）和RNA诱导沉默复合物（RISC）。siRNA是由外源DNA或RNA转录而来，它可以与靶向基因的mRNA互补配对，从而导致该mRNA的降解。miRNA则是由内源基因产生的，它们可以与mRNA的3'非翻译区域互补配对，从而抑制翻译或导致mRNA的降解。RISC是一个多蛋白复合物，它能够识别并结合siRNA或miRNA，并将其引导到靶向mRNA上，从而促进mRNA的降解或抑制翻译。

RNAi技术的应用非常广泛，包括基因功能研究、药物研发和治疗等领域。在基因功能研究中，科研人员可以利用RNAi技术靶向性地沉默特定基因，从而研究该基因在细胞生物学和生理学过程中的作用。在药物研发领域，RNAi技术被用于开发针对特定基因的治疗药物，例如针对癌症和遗传性疾病的治疗。此外，RNAi技术还被应用于农业领域，用于改良作物品质和抗病性。

总之，RNAi技术作为一种强大的基因沉默技术，已经在生命科学研究和医学领域发挥了重要作用，并且有着广阔的应用前景。随着对RNAi技术原理的深入理解和技术的不断改进，相信RNAi技术将会在未来发挥更加重要的作用。

rnai的原理

rnai的原理

rnai的原理

RNAi的原理。

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种由外源双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默的现象，是一种高度保守的生物现象，存在于真核生物的细胞中。RNAi技术被广泛应用于基因功能研究、疾病治疗和农业生产等领域。本文将介绍RNAi的原理及其在基因沉默中的作用机制。

RNAi的原理主要包括三个步骤，RNA干扰诱导、RNA干扰信号放大和RNA干扰效应。首先，外源dsRNA或内源miRNA被切割成21-23个碱基的小RNA片段，这些小RNA片段与RNA诱导靶向基因沉默的复合物结合，形成RNA诱导沉默复合物（RISC）。RISC可将小RNA片段的信息传递到靶标mRNA上，导致mRNA的降解或翻译抑制，从而实现基因的沉默。

RNAi在基因沉默中的作用机制主要涉及到两种小RNA，siRNA和miRNA。siRNA是由外源dsRNA切割产生的，可以完全匹配靶标mRNA序列，导致mRNA的降解；miRNA则是由内源基因产生，与靶标mRNA序列部分匹配，主要导致翻译抑制。siRNA和miRNA都能通过RISC介导的方式实现基因的沉默，从而调控细胞的生理过程。

RNAi技术在基因功能研究中有着重要的应用。通过合成siRNA或miRNA，可以特异性地沉默目标基因，从而研究其在细胞信号传导、代谢途径、细胞周期等生物学过程中的作用。此外，RNAi技术还可以应用于疾病治疗，例如利用siRNA沉默病毒基因或致病基因，治疗病毒感染或遗传疾病。在农业生产中，RNAi技术也可以用于抗虫、抗病和改良作物品质等方面。

总之，RNAi作为一种高效、特异性的基因沉默技术，已经成为生命科学研究和生物技术应用中的重要工具。通过深入理解RNAi的原理和作用机制，我们可以更好地利用这一技术，推动基因功能研究、疾病治疗和农业生产的发展。

rnai技术原理

rnai技术原理

rnai技术原理

RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种通过降低特定基因的表达来调控基因功能的方法。RNAi技术起源于一种细胞自身的保护机制，该机制通过降解特定的RNA分子来抑制与这些RNA相对应的基因的表达。该技术可以用来研究和操控基因功能，为研究基因的功能和开发新的治疗方法提供了有力的工具。

RNAi技术的主要原理是通过小分子RNA分子（小干扰RNA，siRNA）的介导，将目标基因的mRNA分解从而抑制该基因的表达。RNAi技术包括两个主要步骤：siRNA的合成和siRNA与目标基因的结合。

在合成siRNA的过程中，利用特定的酶系统将针对目标基因的RNA序列转录成双链RNA分子。这些双链RNA分子会被酶切成长度约为20到25个核苷酸的小片段，并形成siRNA。

siRNA与目标基因的结合是通过与目标基因的mRNA序列互补配对而实现的。一旦siRNA与目标基因的mRNA结合，酶复合物（RISC）会引导靶向基因的mRNA分解，从而阻断该基因的转录和翻译，进而抑制目标基因的表达。

通过引入合成的siRNA到细胞中，可以针对特定基因进行抑制。然而，由于siRNA是非特异性的，可能会对其他非靶向基因产生副作用。为了避免这种情况，研究人员通常会设计多个针对同一基因的siRNA序列，并经过筛选确定具有最佳特异性和效果的siRNA。

综上所述，RNAi技术通过利用siRNA与目标基因的mRNA结合来抑制基因的表达，从而调控基因功能。这项技术在基因功能研究、药物研发和疾病治疗等领域具有广泛的应用前景。