大肠杆菌实验报告

大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选

0740063 阿噟兰

1.前言

抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。DNA

对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有 DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。

在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。

紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。

因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。

2.材料和方法

实验材料、仪器和试剂

菌种：大肠杆菌

仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器

试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水

大肠杆菌紫外诱变实验

【实验目的】 初步掌握诱变方案的设计和紫外诱变的实验手段。理解自发突变和紫外诱变的机理，分 析不同诱变目的、诱变手段和诱变筛选在诱变应用中的关系。了解诱变育种在微生物工业中的作用。

【实验原理】 微生物菌种质量优劣对发酵工业具有至关重要的作用，由于自然界中的菌种一般在生产 上都有不同程度的缺陷，而且自然突变频率低，突变幅度小，单纯依靠自然界中微生物群体来进行的自然选择有很大的局限性，往往不能满足实际生产的需要。因此现在的微生物发酵生产菌种绝大多数都是经过人工改造的，而菌种改造有诱变改造和基因改造两方面。虽然现在基因工程菌已经成为越来越重要的菌种改造方式，但通过物理化学诱变对菌种品质进行改造仍然是工业生产菌重要的来源。

诱变分为物理诱变和化学诱变。物理诱变采用紫外光、X射线、射线、射线、射线、 快中子和超声波等，其中紫外光诱变因其效果好、实验设备简单等优点而成为应用最广泛的物理诱变剂。

而化学诱变则是采用一些可以和DNA起作用，改变其分子结构，最终引起遗传改变的化学物质对诱变对象进行处理，得到诱变菌种的方法。实验室中常用的有亚硝酸、硫酸二乙酯、亚硝酸胍等（这3种诱变剂诱变效果依次增加，毒性也依次增大）。

物理诱变往往被分为电离辐射和非电离辐射，常用的电离辐射有X射线、射线、射线、快中子等。电离辐射的特点是穿透力强，对生物作用分为直接作用和间接作用。辐射的直接作用是指辐射所产生的直接物理损伤，是由于能量量子直接与染色体作用而造成的原始损伤，是一种物理作用；而辐射的间接作用则是一种化学作用，是由于生物细胞中的水分子受到辐射作用产生各种自由基，这些自由基和溶质分子或直接和染色体发生作用产生遗传损伤。

由于不同作用的时效差别，辐射的作用过程大体可分为物理、物理化学、化学和生物学效应等4个阶段，时效发生可以从10-12s到几年。辐射中常采用的剂量单位为伦琴（R）。一个伦琴相当于在00C及101325Pa（760mmHg）下，每立方厘米干燥空气中能产生个离子对的电离剂量。

分离

灭菌

↓

倒平板

↓

培养

↓

划线分离

LB液体和固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌

将固体培养基倒入4个灭菌后的培养皿中，制备平面培养基

在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养12h

平板划线法

培养皿倒置，37℃恒温培养12~24小时

划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。

涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。

（一）制备LB培养基（通用的细菌培养基）

1、配方：蛋白胨10.0克，牛肉膏5.0g，氯化钠10.0克，水1000ml

（配固体培养基再加琼脂20克）

2、流程

计算称量溶解调pH分装加塞，包扎灭菌

倒平板

培养基配制(特)

培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。

1、 按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中：

例如：配制350mlLB培养基配方如下：[配置双份]

成分名称 蛋白胨

TRYPTONE 氯化钠 酵母提取物

YEAST

XTRACT 去离子水

称取质量

3.5g 3.5g 1.75g 补足350ml

2、 用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、溶解。待灭菌。

①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用___三角漏斗 _。

②加塞：试管用塑料盖或__棉花塞___；三角瓶口用_封口膜__或_ 6层纱布封口,再用__牛皮纸__或报纸封口。

③包扎：用_牛皮纸__或报纸

④灭菌：高压蒸气灭菌法 1）加水：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是不触及内胆 _.

2）装锅：物品放置的要求__整齐、稳定、留出空隙 ：加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_排气槽__内。再以__两两对称 方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺

栓松紧一致，勿使漏气。 3）加热排气：打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀。4）保温保压：当锅内压力升到 1_kg/cm2时，控制热源，维持压力至15 _min。 5）出锅： 切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至_0_时，打开_排气阀__，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。 否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。 灭菌后，通常将实验用具放入60℃~80 ℃_烘箱 中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起_污染_。

实验1 微生物的分离、培养及计数

实验原理

纯化分离：人为提供适宜的菌落生长的条件（包括营养、温度、Ph等）。用平板划线法，通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞菌落。

筛选：转基因大肠杆菌有抗氨苄青霉素基因，所以在含有氨苄青霉素的LB培养基中可以正常繁殖长成菌落。而普通的大肠杆菌没有抗氨苄青霉素基因，咋含有氨苄青霉素的LB培养基中不能繁殖。由此可进行大肠杆菌的筛选。

梯度稀释并计数：通过浓度梯度稀释把液体培养基培养的大肠杆菌稀释到一定浓度，用稀释涂布平板法，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。由此可计数计算大肠杆菌的数量。

实验目的

1. 通过制备LB固体培养基，对平板进行划线等，学会使用固体LB平板。

2. 通过用液体培养基，学会对微生物进行扩大培养。

3. 通过稀释，学会用计数器对微生物进行计数。

实验材料和药品

待分离的大肠杆菌菌液、高压蒸汽灭菌锅、LB固体培养基、LB液体培养基、接种环、玻璃涂布器、培养皿、恒温培养箱、摇床、酒精灯、无菌水、移液枪、EP管

实验步骤（用简单的流程图表示）

制备LB固体培养基（计算、称量、溶化、灭菌、倒平板） 平板划线

（第一次含AMP,

第二次不含AMP） 筛选出普通大肠杆菌后，转接入液体LB培养基

浓度梯度稀释：

（10-4、10-5）

计数，观察实验现象，记录实验数据。 稀释涂布平板法

（分别涂10-4、10-5） 扩大培养

37℃摇床震动培养

实验数据的记录与分析（如照片、表格等）

稀释倍数 104 105

大肠杆菌单个菌落个数 83 77 99 11 18 12

平均数 86.3 13.7

浓度 1.726×107 0.274×107