红根甘肃桃根系MYB基因片段的克隆及序列分析

大白菜转录因子MYB基因家族在花粉形成过程的研究进展摘要：大白菜（Brassica rapa L. ssp pekinesis）是中国最重要的蔬菜作物之一，存在明显杂种优势，利用自交不亲和系和雄性不育系制种是目前最常用的杂交制种技术。

雄性不育系，雌雄同株植物中，雄蕊发育不正常，不能产生有功能的花粉，但它的雌蕊发育正常，能接受正常花粉而受精结实，并能将雄性不育遗传给后代的植物品系。

Myb(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)转录因子是最大的植物转录因子家族成员之一，参与了细胞分化、细胞周期的调节，激素和环境因子应答，并对植物次生代谢以及叶片等器官形态建成具有重要的调节作用。

植物MYB转录因子以台有保守的MYB 结构域为共同特征，广泛参与植物发育和代谢的调节单一MYB结构域的MYB转录因子在保持染色体结构和转录调节上发挥着重要作用，是MYB转录因子家族中较为特殊的一类。

Myb类转录因子参与了植物花色素形成过程的调控，对果皮、果肉，甚至叶片的着色都起到了重要作用。

MYB，控制大白菜籽粒α淀粉酶的诱导表达，同时控制大白菜花器官，尤其是花粉的发育。

关键词:大白菜;雄性不育;Myb转录因子;花药绒毡层;花粉高等植物花药形态发育完成后, 小孢子母细胞被四层二倍体的壁细胞, 即表皮层、内皮层、中层和绒毡层所围绕。

作为花药壁的最内层, 绒毡层直接与发育中的配子体相互作用。

本文通过绒毡层发育的各时期的形态结构改变及物质的变化来阐述绒毡层对花粉发育的影响, 同时通过阐述绒毡层发育相关的特异表达基因, 进一步认识了绒毡层的功能及其与花药发育的相互关系。

高等植物的配子需要单倍体的配子体细胞和二倍体的孢子体细胞的共同参与而产生。

当高等植物花药形态发生完成后, 小孢子母细胞被四层二倍体的壁细胞所围绕。

这四层细胞从外向内依次是: 表皮层、内皮层、中层和绒毡层。

绒毡层作为花药壁的最内层直接与发育中的配子体相互作用。

多年生黑麦草MYB转录因子基因的克隆及序列分析凌瑶;李成磊;吴琦【摘要】To further study the function of the MYB in stress resistance and development in Lolium perenne L. , the conserved region of MYB transcription factor which is related with resilience and development was amplified by PCR using homologous method and cloned from leaves of the Lolium perenne L. Sequence analysis and function prediction were performed as well. Sequencing results showed that three different gene fragments of MYB transcription factor were cloned and named separately as LpMYBl ,LpMYB2 and LpMYB3.The DNA lengths of LpMYBl ,LpMYB2 and LpMYB3 were 221 bp,221 bp and 202 bp,which included 103 bp,103 bp and 84 bp introns, respectively. All of them encoded 39 amino acids. Sequence homologous comparison showed that these three genes might be involved in adversity response and morphogenesis of Lolium perenne L. Phylogenetic analysis indicated that phylogenetic development of the three genes was consistent with the evolutionary model of monocotyledons. The results showed that the three MYB genes were involved in the expression of resistance and development of Lolium perenne L. , which provides a foundation for study of function of MYB transcription factor gene in Lolium perenne L.%为进一步研究MYB类基因在多年生黑麦草抗逆和发育中的功能,以多年生黑麦草为材料,采用同源克隆的方法对其抗逆和发育相关MYB转录因子的保守区进行PCR扩增和克隆,并进行了序列分析和功能预测.测序结果表明,获得了3个不同的MYB转录因子基因片段,分别命名为LpMYB1、LpMYB2和LpMYB3.LpMYB1和LpMYB2长度均为221bp,内含子为103 bp,编码39个氨基酸；LpMYB3长度为202 bp,内含子为84 bp,编码39个氨基酸；同源比对结果表明,所得3个MYB基因可能参与多年生黑麦草对逆境的应答和植株的形态建成；进化树分析表明,3个MYB基因的系统发育符合单子叶植物的进化模式.由此可见,3个MYB基因参与了多年生黑麦草抗逆性和发育的表达,为进一步研究多年生黑麦草MYB转录因子基因的功能研究奠定基础.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2012(041)008【总页数】6页(P171-176)【关键词】多年生黑麦草;MYB转录因子;基因克隆;序列分析【作者】凌瑶;李成磊;吴琦【作者单位】四川农业大学动物医学院,四川雅安652014;四川农业大学生命科学与理学院,四川雅安625014;四川农业大学生命科学与理学院,四川雅安625014【正文语种】中文【中图分类】S816.5+转录因子（transcription factor，TF）也称反式作用因子，可在转录水平上调控靶基因的表达，从而调控植物生长发育和生理代谢过程。

华北农学报·2011，26（5）：107-111收稿日期：2011－05－20基金项目：中央级公益性科研院所科研业务费专项资金资助（2008-17）作者简介：杨文杰（1970－），男，山东泰安人，讲师，博士，主要从事生物化学与分子生物学研究。

通讯作者：唐益雄（1965－），男，湖南邵东人，研究员，博士生导师，博士，主要从事生物化学与分子生物学研究。

大豆MYB 基因GmMYBJ7的克隆及表达分析杨文杰1，2，吴燕民2，唐益雄2（1．淮阴师范学院江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室，江苏淮安223300；2．中国农业科学院生物技术研究所，北京100081）摘要：MYB 蛋白是植物体中一类重要的转录因子，广泛参与植物生理代谢和发育过程的调节。

本研究对利用RACE-PCR 分离克隆的MYB 转录因子基因GmMYBJ7的功能进行了初步研究。

Norhern 杂交对GmMYBJ7在不同组织中的表达情况进行了检测，结果只在茎、叶中检测到了GmMYBJ7的表达；酵母表达结果显示，GmMYBJ7具有明显的转录激活功能，β-半乳糖苷酶活性为24．31U ；半定量RT-PCR 检测显示，在表达GmMYBJ7的转化烟草中，类黄酮代谢途径中的苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL ）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H ）、4-香豆酰辅酶A 连接酶（4CL ）、查尔酮合成酶（CHS ）、黄烷酮-3-羟化酶（F3H ）等关键酶的表达显著降低，结果表明，GmMYBJ7可能参与植物类黄酮合成的调控。

关键词：大豆；MYB 转录因子；基因表达调控中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：1000－7091（2011）05－0107－05Cloning and Characterization of the MYB Gene GmMYBJ 7from SoybeanYANG Wen-jie 1，2，WU Yan-min 2，TANG Yi-xiong 2（1．Huaiyin Normal University ，Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural Biotechnology around Hongze Lake ，Huai'an 223300，China ；2．Biotechnology Research Institute ，ChineseAcademy of Agricultural Sciences ，Beijing 100081，China ）Abstract ：The MYB proteins play an important role in plant ，which involved in the regulation of the process of metabolism and development extensively．The function of MYB transcription factor gene GmMYBJ7，which was isola-ted from soybean using the method of RACE-PCR ，was to be clarified preliminarily in this paper．The expression pattern of GmMYBJ7in different organs was studied using Northen blot．The results showed that the expression of GmMYBJ7was detected in the leaves and stems．The transcriptional activation ability of GmMYBJ7protein was con-firmed by the yeast system with β-galactosidase activity of 24．31U．Semi-quantitative RT-PCR analysis indicatedthat GmMYBJ7may also repress the expression of some flavonoid biosynthetic genes ，such as PAL （Phenylalanine ammonia lyase ），C4H （cinnamate-4-hydroxylase ），4CL （4-coumaroyl-CoA ligase ），CHS （Chalcone Synthase ），CHI （chalcone isomerase ）and F3H （flavanone 3-hydroxylase ），which is considered to be related to flavonoid biosynthe-sis in palnt．Key words ：Soybean ；MYB transcription factors ；Gene expression and regulation 转录因子对植物的生长发育及生理代谢调控均具有十分重要的作用。

RAPD技术在甘肃桃遗传多样性与种质资源分析中的应用近年来，随着生物技术的迅猛进步，RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）技术作为一种快速、简便且经济有效的分子标记技术被广泛应用于植物遗传多样性与种质资源分析中。

甘肃是我国重要的桃产区之一，具有丰富的桃种质资源，RAPD技术在甘肃桃的遗传多样性和种质资源分析中发挥了重要作用。

RAPD技术是一种PCR（Polymerase Chain Reaction）扩增方法，利用随机引物扩增植物DNA样本的可变区域，得到一系列随机分布的DNA片段。

相比于其他分子标记技术，RAPD 技术具有操作简易、需要的DNA量少、扩增效率高等优点。

在甘肃桃的遗传多样性分析中，RAPD技术使用多样的随机引物对不同种质的桃进行PCR扩增，得到了一系列具有多态性的DNA片段。

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，可以将扩增得到的DNA片段分离出来，形成可以观察的DNA条带图谱。

通过分析DNA条带图谱的差异，可以探究不同桃种质间的遗传干系和遗传多样性水平。

探究发现，甘肃桃种质资源中存在着丰富的遗传多样性。

通过RAPD技术分析，发现不同品种的桃在DNA条带图谱上有着明显的差异，表明不同品种具有不同的遗传特征。

同时，RAPD技术还能够检测到种质资源中的基因突变和基因重组事件，为选择育种和种质鉴定提供了重要依据。

在甘肃桃的种质资源分析中，RAPD技术也发挥了重要作用。

RAPD技术不仅可以鉴定品种间的遗传干系，还可以评估不同品种的遗传相似性和遗传距离。

通过建立遗传相似性矩阵和遗传距离矩阵，可以使用聚类分析和主成分分析等统计方法对不同品种进行分类和划分。

这些探究结果对于桃种质资源的保卫、利用和育种具有重要的指导意义。

另外，RAPD技术还可以用于甘肃桃的品种鉴定和纯度检测。

通过RAPD技术可以建立桃品种的DNA指纹图谱，利用DNA指纹图谱可以准确鉴定不同桃品种，并对品种的纯度进行检测。

‘甘肃红豆草’肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析陈春艳;马晖玲;董文科【摘要】Total RNA of Onobrychis viciaefolia ‘Gansu’was extracted from leaf.The RNA was used to clone Actin gene fragment by RT-PCR,then the gene fragment was cloned into pMD1 8-T vector.The gene was sequenced after identifying the positives clone by PCR.The results revealed that the actin gene fragment from Onobrychis viciaefolia ‘Gansu’contained 258 bp and encoded a sequence of 86 amion acids.Similarity comparison showed that it shared over 88% similarity of nucleotide sequence similarity and over 92% similarity of amino acid sequence with other actin in the GenBank.The gene was submitted to GenBank and was given the accession number KP159623.Semi-quantitative PCR analysis indicated that the expression quantity of Actin gene was similar in differentorgans,however,the expression quantity of BAN gene encoding anthocyanin reductase was different.The results show that Actin gene can be used as the reference for analysis of gene expression in Onobrychis viciifolia ‘Gansu’.%以‘甘肃红豆草’叶片总 RNA 为模板,通过 RT-PCR 方法扩增出肌动蛋白(Actin)基因片段,并克隆到pMD18-T载体,阳性克隆经PCR鉴定后测序.结果表明：序列分析表明,该片段长258 bp,编码86个氨基酸,所得序列与GenBank中注册的Actin基因核苷酸序列的相似性在88%以上,与其他肌动蛋白的氨基酸序列的相似性达92%以上.注册该基因到 GenBank中,注册号为KP159623.采用半定量 RT-PCR方法,分析Actin基因在甘肃红豆草不同组织器官中的表达量相对恒定,而编码花青素还原酶的BAN基因在器官间的表达量差异较大,表明其可作为研究其它重要功能基因在‘甘肃红豆草’中的表达和调控的内参基因.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】6页(P151-156)【关键词】甘肃红豆草;肌动蛋白基因;克隆;序列分析【作者】陈春艳;马晖玲;董文科【作者单位】甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃兰州 730070; 河南科技大学农学院，河南洛阳 471003;甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃兰州 730070;甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】Q78肌动蛋白(Actin)是存在于真核生物细胞中的一种重要的蛋白质，是构成细胞骨架中的微丝系统的基本成分，参与真核细胞的细胞分裂、细胞运动、细胞形状变化、胞内物质运输以及细胞内信号传导等[1-3]许多重要的生命活动.Actin基因在进化过程中，在核苷酸及氨基酸水平上保持较高的保守性和同源性[4].Actin基因在各种组织中恒定表达，因而常被作为看家基因，也广泛用于半定量和定量PCR研究的内参基因，来比较不同来源的目的基因表达量的差异[5].迄今为止，已从许多高等植物中克隆到了Actin基因，包括碱蓬(Suaeda glauca,EU429457)、水稻(Oryza Sativa,AY212324和CT831215)、大麦(Hordeum vul gare,AK251023)、毒麦(Lolium temulentu,EU328529)、小米(Setaria italica,AF288226)、玉米(Zea mays,EU967073)、谷子(Setaria italica,AF282625)、刚竹(Phyllostachys bambusoides,EU009452)、拟南芥(Arabidopsis thaliana,AY096397)、毛白杨(Populustomentosa,EF418792)、玉兰(Magnolia denudate,AF281323)、花生(Arachis hypogaea,DQ873525)、霸王(Zygophyllum xanthoxylum,EU019550)、地黄(Rehmanniaglutinosa,EU526396)、白沙蒿(Artemisia sphaerocephala,FJ587512和FJ515905)、蓖(Ricinus communis,AY360221.1)、番木瓜(Caricapapaya,FJ696416)、陆地棉(Gossypium hirsutum,FJ560483)等.这些研究证实Actin是一种用于比较其它基因表达的有效的内参基因.而有关红豆草Actin基因克隆与分析以及作为内参基因的适宜性评价目前仍未见报道.红豆草(Onobrychis viciaefolia)为多年生草本植物，其地上部分粗蛋白质及氨基酸含量丰富，含有一定数量的粗脂肪、多种维生素和矿物质及其它化学物质.红豆草的种子产量和产草量高，结实性能较好，营养物质全面而丰富，适口性优良，而且能显著增加土壤含氮量，是一种花蜜液数量多的植物[6].‘甘肃红豆草’(Onobrychis viciaefolia ‘Gansu’)是由普通红豆草和高加索红豆草杂交多次混合授粉的植株中单株选择培育成的[7].其具有产草量高、早熟、抗病虫害强、耐旱和耐盐碱的特点，适宜在干旱、半干旱地区栽培.另外，当给家畜饲喂单宁含量很高的红豆草后不会患臌胀病，普遍认为红豆草是在遗传资源创新途径和饲草利用方式上解决紫花苜蓿引起牲畜臌胀病发生的一种理想牧草.红豆草作为一种优良的豆科牧草，也是一种良好的种质资源，目前日益受到研究者的关注.而有关红豆草Actin基因分析将为其他功能基因表达特征和生理调节的研究奠定基础.本研究拟以‘甘肃红豆草’叶片为材料，用RT-PCR方法克隆红豆草Actin基因，检测此基因作为内标参照的可靠性，为研究红豆草生理代谢的分子生物学机制的研究提供参考.1 材料与方法1.1 材料和试剂1.1.1 试验材料红豆草品种为‘甘肃红豆草’(Onobrychis viciifolia ‘Gansu’)，由甘肃农业大学草业学院提供.1.1.2 试验试剂和处理方法 M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit、SanPrep DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程公司，引物由北京赛百盛生物公司合成，Taq酶、DNA Marker、pMD18-T Vector购自大连宝生物工程有限公司，其它药品、试剂为常规国产分析纯.所用的试剂为新开封试剂，用灭菌的0.1%焦碳酸二乙脂(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水配置，塑料耗材均需用0.1% DEPC dH2O处理24 h，高温灭菌，烘干后备用；研钵、试剂瓶、玻璃棒、容量瓶等物品经180 ℃高温烘烤5 h，避免RNase污染.1.2 总RNA提取方法1.2.1 CTAB法粗提总RNA 1)取0.1 g红豆草叶片在预冷的研钵中，加液氮冷冻研磨成粉末，并转移到1.5 mL的离心管中；2)将65 ℃预热的提取缓冲液600μL[RNA提取缓冲液为2%CTAB(W/V)、4%PVP(W/V)、100 mmol/L Tris -Cl(pH8.0)、25 mmol/L EDTA(pH8.0)、1.4 mol/L NaCl、使用前加入2%β-巯基乙醇(W/V)]加入到1.5 mL含植物材料的离心管中，剧烈震荡1 min，确保植物材料充分裂解，65 ℃温浴10 min，期间震荡2～3次；3)于4 ℃下12 000 r/min离心10 min；取上清液，加入600 μL水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡混匀，冰上放置10 min；于4 ℃下12 000 r/min离心10 min；4)将上清液转移至另一新的1.5 mL离心管中，重复步骤(3)1次；5)取上清液，加入1/3体积的10 mol/L LiCl混匀后，-20 ℃放置3 h，于4 ℃下12 000 r/min离心20 min；6)弃上清液，沉淀溶解于500 μL 0.1%DEPC dH2O中，加入1/10体积的3mol/L NaAC(pH5.2)，充分溶解后加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-70 ℃处理30 min，于4 ℃下12 000 r/min离心10 min，弃上清液；7)用70%的乙醇洗涤一次，4 ℃下12 000 r/min离心5 min；8)重复步骤(7)1次，尽量吸去残余乙醇；9)弃上清液，沉淀于室温下风干后得到RNA的粗提物，加入50 μL0.1%DEPC dH2O溶解RNA，于-80 ℃保存备用.1.2.2 总RNA的纯化将上述步骤制备的总RNA粗提物2管合并为1管，然后加入900 μL 0.1%DEPC dH2O溶解，加入等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡混匀，于4 ℃下12 000 r/min离心20 min；取上清液，加入1/10体积的3 mol/L NaAC(pH5.2)，2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-70 ℃放置30 min，于4 ℃下12 000 r/min离心20 min，弃上清液；用70%的乙醇洗涤2次，4 ℃下12 000 r/min离心5 min；弃上清液，沉淀干燥后加入50 μL0.1%DEPC dH2O充分溶解，于-80 ℃保存备用.1.3 总RNA质量检测1.3.1 总RNA纯度及浓度检测取1 μL RNA样品，于Merinton微量分光光度计测定D260、D280，RNA样品浓度(以0.1%DEPC dH2O为空白液调零).1.3.2 总RNA琼脂糖凝胶电泳检测取10 μL RNA溶液，在1%琼脂糖凝胶电泳(缓冲液为1×TBE缓冲液，电压100 V)30 min后，置于凝胶成像系统中照相.1.4 基因克隆1.4.1 First-Strand cDNA合成使用上海生工生物工程公司反转录试剂盒进行First-Strand cDNA合成反应，合成后产物于-20 ℃保存备用.1.4.2 PCR Actin基因根据GenBank数据库中公布的近缘物种的肌动蛋白基因序列，利用DNAMAN 6.0软件设计PCR扩增引物：Actin P1:5′-GAGCGTTTCCGTTGTCCTGA-3′；Actin P2:5′-AGGTGCTGAGGGAAGCCAAA-3′.PCR反应体系(25 μL)包括cDNA 1 μL，10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，引物Actin P1和Actin P2(10 pmol/μL)各1 μL，5U/μL Taq酶0.5 μL.反应程序为：预变性：94 ℃、4 min，变性：94 ℃、1 min，退火：59 ℃、1 min，延伸72 ℃、1.5 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min.反应结束后取10 μL 反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物.1.4.3 与T载体连接转化感受态细胞及测序将纯化回收的PCR产物与pMD18-T Vector连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选.挑选阳性克隆，提取质粒DNA，PCR扩增鉴定后送于上海生工生物公司测序.1.5 Actin基因生物信息学分析基因开放阅读框通过NCBI提供的ORFFinder(/gorf/gorf.html)寻找；核苷酸序列相似性检索通过NCBI的BlastN、BlastP和DNAMAN 6.0软件进行分析；用MEGA 6.0软件进行氨基酸序列比对和Actin类蛋白质序列系统进化树分析.1.6 Actin基因组织器官表达特性分析采用半定量RT-PCR方法对‘甘肃红豆草’Actin基因进行组织器官特异性表达分析.分别提取甘肃红豆草根、茎、叶的总RNA，以等量的RNA反转录合成cDNA 为模板，进行RT-PCR.反应程序为：预变性94 ℃、1 min，变性94 ℃、30 s，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、40 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min.反应结束后取10 μL反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物.进行3次重复试验.通过目的条带的亮度来分析基因表达的差异.2 结果与分析2.1 RNA的提取和琼脂糖凝胶电泳检测以‘甘肃红豆草’叶片为材料，利用改良CTAB法，提取的总RNA，经微量分光光度计测定D260/D280为1.90，凝胶电泳显示28s和18s条带较清晰，且28s条带的亮度高于18s条带(图1)，结果表明得到的总RNA既未发生降解，又无DNA、蛋白质等污染，质量和纯度较高.图1 总RNA 1%琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Quality checking of total RNA in 1% denaturalization formaldehyde agarose gel2.2 Actin基因的扩增及克隆以cDNA为模板，用引物Actin P1和Actin P2进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物.PCR扩增得到约250 bp左右的片段(图2).回收PCR产物，连接至pMD18-T Vector，经蓝白斑筛选后，挑选阳性克隆，提取质粒进行PCR扩增鉴定，得到目的片段大小约为250 bp(图3).表明这些克隆为阳性克隆，将其命名为：pMD-Actin，送交上海生工生物公司测序.M:DL2000 Marker;1:PCR扩增产物.图2 Actin基因的PCR扩增Fig.2 PCR amplification of Actin geneM:DL1000 Marker;1,2:阳性克隆PCR产物.图3 阳性克隆的PCRFig.3 PCR analysis of positive clones2.3 测序结果及序列分析测序得到一段258 bp的序列，编码86个氨基酸(图4).将该序列在GenBank中进行Blast比对，发现该序列与其他植物的Actin基因核苷酸序列的相似性在88%以上，氨基酸序列的相似性达92%以上.表明克隆到的片段为Actin基因片段.M:DL1000 Marker;1,2:阳性克隆PCR产物.图4 ‘甘肃红豆草’Actin基因片段的核苷酸序列及推测的氨基酸序列Fig.4 The nucleic acid sequence and deducedamino acid sequence of Actin gene fragment from onobrychis viciifolia‘Gansu’‘甘肃红豆草’Actin与其它物种Actin氨基酸序列比对结果表明，其保守氨基酸达74个，而非保守氨基酸仅有12个，仅在第1、2、6、7、12、32、38、40、42、53、62、65个氨基酸残基处存在差异(图5).说明克隆到的片段为Actin基因的高度保守区域.其Actin氨基酸序列与豆科大豆、禾本科玉米的相似性最高，达到99%；与禾本科蒙古冰草的相似性最低，为92%.甘肃红豆草Actin氨基酸序列与同科植物间的相似性在98%以上，在不同物种间Actin基因氨基酸序列仍具有高度的保守性.2.4 系统进化分析‘甘肃红豆草’Actin基因与十字花科拟南芥、豆科大豆、禾本科玉米、豆科紫花苜蓿Actin基因编码的氨基酸相似性最高，达98%以上；与禾本科稗、禾本科蒙古冰草氨基酸的相似性最低，为94%和92%.可见，不同科植物Actin氨基酸的相似性都在92%以上.由此可见，高等植物的Actin基因核心片段的保守性和稳定性强，是一种高度保守的看家基因.2.5 Actin基因的组织器官特异性表达分析采用RT-PCR技术对甘肃红豆草Actin基因进行组织器官特异性表达分析，以等量的甘肃红豆草根、叶和茎的总RNA为模板，分析Actin基因的组织器官表达特征.结果如图7所示，Actin基因在甘肃红豆草根、叶和茎中的表达量基本一致，无明显差异，表达相对稳定.而BAN基因在根、叶和茎中表达存在明显差异. A.mongolicum蒙古冰草(ACL36421)；A.thaliana拟南芥(NP_196543)；D.longan龙眼(ABY66084)；E.crus-galli稗(ADR32360)；E.japonica枇杷(AFP43696)；G.max大豆(AAB40076)；M.sativa紫花苜蓿(ACD31684)；O.viciifolia cv.GS甘肃红豆草；S.rebaudiana粗叶菊(ACE87856)；Z.mays玉米(NP_001146931)；Consensus表示一致性序列，并在序列下用小写字母列出；根据保守程度高低依次使用黑色、红色和蓝色阴影标示.注：括号中的编号为GenBank登录号.图5 不同种Actin氨基酸序列比较Fig.5 Comparison of the amino acid sequences of Actin in different speciesAgropyron mongolicum蒙古冰草；Arabidopsis thaliana拟南芥；Dimocarpus longan龙眼；Echinochloa crus-galli稗；Eribootrya japonica枇杷；Glycine max大豆；Medicago sativa紫花苜蓿；Onobrychis viciifolia cv.GS甘肃红豆草；Stevia rebaudiana粗叶菊；Zea mays玉米；GenBank登录号与图5同.图6 Actin蛋白与其他物种Actin类蛋白构建的系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of Actin proteins in Onobrychis viciifolia ‘Gansu’ and other species图7 ‘甘肃红豆草’不同器官的Actin和BAN基因表达比较Fig.7 Comparison of Actin and BAN expression in different organs of Onobrychis viciifolia‘Gansu’3 讨论Actin构成细胞骨架微丝系统，在自然选择过程中承受着巨大的选择压力，因而其核苷酸序列和氨基酸序列都表现出高度的保守性[9]。

桃抗根癌病QTL定位及SAR抗性机制研究桃根癌病是严重影响生产的病害,抗性品种和砧木的应用是控制该病的有效途径。

本文针对桃抗根癌病种质、抗性遗传规律不明等问题,对不同地域来源的38份野生种质和189份地方品种进行田间接种评价,应用连锁及关联分析方法定位抗性性状相关QTL,并对桃防御根癌病的系统获得性抗性反应(SAR)进行探索。

主要结论如下:1.在不同时期,以筛选出的根癌土壤杆菌强致病力菌株AT4-3接种中桃抗砧1号实生苗,观察病症出现情况,结果表明:田间接种一般5月下旬至7月中旬均可进行。

2.通过对不同抗病指标的相关性分析,确定最大瘤直径为抗性鉴定的指标。

田间鉴定结果表明,在175份地方品种中,不存在对根癌病免疫的种质,也无高度抗病及中度抗病种质,只有中度感病材料16个,分别为张黄9号、吐-2、红根甘肃桃1号、扁桃、白沙、临白10号、鸳鸯垂枝、张白5号、迎春、毛桃变油桃、甜仁桃、肥城白里17号、新疆蟠桃无花粉、爱保太小花、粉寿星、早上海水蜜,其余均为高度感病种质。

在野生资源中,每份材料均存在不同程度的抗性分离。

其中,伏牛山望10表现高度抗病性;广元1号、蒙古扁桃、四道岭野生李和寿粉等4份材料为中度抗病,其余33份材料为中度或高度感病。

通过对红根甘肃桃1号自花授粉群体及杂交BC1群体的分析认为:红根甘肃桃1号的抗性是可遗传的,并受多基因控制。

3.利用红根甘肃桃1号与贝蕾的BC1群体构建的遗传连锁图谱,经过连锁分析定位到Cg11和Cg41两个抗根癌病QTL,分别位于第1和第4连锁群上,对表型变异的解释率为10.4%和13.7%。

4.以分布于桃基因组上的52对SSR标记,基于114个地方品种所组成的自然群体的抗性表型数据,进行全基因组关联分析,检测到与标记UDP96-008和UDP98-405关联的位点2个,分别位于第3和第7连锁群。

对66个地方品种所组成的自然群体的表型数据与SNP标记的全基因组关联分析,共检测到31个关联位点,其中有9个位于第2连锁群,其余的22个位于第6连锁群。

SINO-OVERSEAS GRAPEVINE & WINE摘 要：MYB 转录因子在响应各类非生物胁迫中发挥着重要作用。

本研究以‘阳光玫瑰’葡萄为材料，鉴定了1个盐胁迫响应MYB 转录因子基因VvMYB 30，并对其特性及功能进行研究。

该基因cDNA 全长为984 bp ，编码327个氨基酸。

生物信息学分析发现，VvMYB30含有1个保守的R2R3蛋白结构域，与甜橙CsMYB30转录因子的同源性最高，相似度为64.75%，归属于Subgroup Ⅰ亚类。

亚细胞定位及转录激活分析表明，VvMYB30定位于细胞核，且具有转录激活活性。

qRT-PCR 结果表明，VvMYB 30受盐胁迫诱导，处理24 h 表达量达到最高，为对照的6.86倍。

将VvMYB 30基因转化拟南芥，盐胁迫下VvMYB 30转基因拟南芥种子萌发率和幼苗的成活率均显著高于野生型，表明过表达VvMYB 30可增强转基因拟南芥的耐盐性。

关键词：阳光玫瑰；MYB 转录因子；盐胁迫；功能分析中图分类号：S663.1 文献标志码：A DOI ：10.13414/ki.zwpp.2024.01.003收稿日期：2023-07-06基金项目：镇江市重点研发计划-现代农业（NY202002）；江苏农林职业技术学院科技项目（2020kj040） 江苏省第六期“333高层次人才培养工程”第三层次培养对象资助项目作者简介：解振强（1980—），硕士，研究方向为葡萄无土栽培。

E-mail:*****************通信作者：赵鹏程（1989—），博士，主要从事葡萄分子生物学研究。

E-mail:**************Cloning and Salt Tolerance Analysis of VvMYB 30 from Grape (V. vinifera )XIE Zhenqiang 1, XU Huanyu 1, HUANG Jinxia 2, CAI Shanya 1, LI Gang 1, ZHAO Pengcheng 1*（1. Jiangsu V ocational College of Agriculture and Forestry, Jurong 212400, China; 2. Yangzhong Economic Development Zone Management Committee, Yangzhong 212200, China)2024(1): 20-27Abstract: MYB transcription factors play an important role in responding to various abiotic stresses. This studyused 'Shine Muscat' grape as the material to clone a salt stress responsive MYB transcription factor gene VvMYB 30, and conducted research on the characteristics and functions of VvMYB 30. The sequence analysis indicated that the full-length coding sequence of VvMYB 30 was 984 bp and encoded 327 amino acids. Bioinformatics analysis showed that VvMYB30 contained a conserved R2R3 domain and had the highest homology with sweet orange CsMYB30 transcription factors (64.75% similarity) and belonged to subgroup Ⅰ. Subcellular localization and transcriptional activation analysis showed that VvMYB30 was localized in the nucleus and had transcriptional activation activity. qRT-PCR showed that VvMYB 30 was induced by salt stress, and the expression level reached the highest at 24 h, which was 6.86 times higher than the control. The salt tolerance test showed that the seed germination rate and seedling survival rate of VvMYB 30 transgenic Arabidopsis were significantly higher than the wild type under salt stress, it indicated that overexpression of VvMYB 30 could enhance the salt tolerance of transgenic Arabidopsis .Key words: Shine Muscat; MYB transcription factor; salt stress; functional analysis葡萄MYB 转录因子基因VvMYB 30的克隆及其耐盐性分析解振强1，许桓瑜1，黄金霞2，蔡善亚1，李刚1，赵鹏程1*（1. 江苏农林职业技术学院，江苏句容 212400；2. 扬中市经济开发区管委会，江苏扬中 212200）SINO-OVERSEAS GRAPEVINE & WINE葡萄作为重要的经济果树在优化农业结构和促进农民增收等方面发挥了重要作用。

《桃PpNAC72基因的克隆及功能分析》摘要：本文详细介绍了桃树中PpNAC72基因的克隆过程，并对其功能进行了深入分析。

通过生物信息学分析、基因克隆、表达模式分析以及转基因功能验证等手段，揭示了PpNAC72基因在桃树生长发育及抗逆性中的潜在作用。

一、引言桃树作为重要的果树作物，其抗逆性及果实品质一直是果树遗传育种的重要研究方向。

近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，基因克隆与功能分析已成为探究果树遗传改良的关键手段。

其中，NAC（NAM/ATAF1/2/CUC2）转录因子家族在植物生长发育和抗逆反应中发挥着重要作用。

本研究以桃树为材料，对PpNAC72基因进行克隆及功能分析，旨在为桃树遗传改良提供理论依据。

二、材料与方法1. 材料本实验所用材料为桃树叶片，取自健康、无病虫害的桃树。

实验中所用到的引物、试剂和仪器均按照实验需求选择和准备。

2. 方法（1）基因克隆：利用PCR技术，通过特异引物扩增得到PpNAC72基因序列。

（2）生物信息学分析：对克隆得到的PpNAC72基因序列进行序列比对、结构预测及表达模式分析。

（3）表达模式分析：采用实时荧光定量PCR技术，分析PpNAC72基因在不同组织及不同逆境条件下的表达情况。

（4）转基因功能验证：构建PpNAC72基因的过表达和沉默载体，通过遗传转化法转入桃树中，观察转基因桃树的生长和抗逆性变化。

三、结果与分析1. PpNAC72基因的克隆与序列分析通过PCR扩增得到PpNAC72基因的全长cDNA序列，经序列比对和结构预测，发现该基因属于NAC转录因子家族，具有典型的NAC结构域。

2. 生物信息学分析PpNAC72基因的氨基酸序列与其他植物NAC转录因子具有较高的相似性，表明其在植物中具有保守的生物学功能。

此外，通过表达模式分析发现，PpNAC72基因在桃树的根、茎、叶等组织中均有表达，且在逆境条件下表达量有所上升。

3. 表达模式分析实时荧光定量PCR结果显示，PpNAC72基因在桃树的不同组织和不同逆境条件下的表达模式具有显著差异。

干旱胁迫下红麻MYB转录因子的克隆及表达特性分析1.1、立题意义及国内外的研究现状与存在问题红麻（Hibiscus cannabinus L.）是耐旱、耐盐碱、适应性高、抗逆性强的韧皮纤维作物，在麻纺、造纸、板材、动物饲料、可降解地膜、食用和药用等领域被广泛开发利用(方平平 et al., 2009)。

MYB 类转录因子是一类含MYB 结构域的转录因子，其命名源自禽成髓细胞瘤病毒致癌基因同源物类(v-myb avian myeloblastosis viral oncogenehomolog, MYB)，具有高度保守的MYB DNA 结合结构域是其共有的特征。

动物MYB 类转录因子的DNA 结合结构域通常含有3 个50~53 个氨基酸的不完全重复区，对应称为之R1、R2 和R3 区，每个MYB 区域中一般都含有3 个保守的色氨酸残基(其间隔18 或19 个氨基酸)起着疏水核心的作用，可折叠成一个螺旋-转角-螺旋的结构，是与目标DNA的大沟结合的结构基础(Ganter and Lipsick, 1997)。

与动物MYB 类转录因子对应，植物中的MYB 类转录因子可简单分成3 个亚类：R1-MYB、R2R3-MYB 和R1R2R3-MYB，其主要成员是含2个MYB 结构域的MYB 蛋白，此外，Dubos 等(2010)报道了在一些植物中还存在一种结构为4R-MYB(R1R2R2R1/2)的小亚族。

最早克隆得到的植物MYB 转录因子是玉米的C1 基因(Paz-Ares et al., 1987)。

随着人们对转录调控研究的逐渐重视，获得的各植物MYB 相关基因的数量迅速增加，对其功能也有了深入的研究。

目前已经从各种植物中鉴定出了丰富的MYB 转录因子家族基因，如拟南芥中MYB 成员约有130个，玉米中约有100 个 (Haga et al., 2007; Kranz et al., 2000)。

研究表明，植物MYB 基因家族在植物生长发育的全过程中都起到重要的作用，其广泛参与次生代谢调控、对逆境胁迫和激素的应答(Abe et al., 2003; Singh et al., 2002; Vannini et al., 2004)，并在细胞分化、形态建成和光信号传导等方面起重要的调控作用(inelli et al., 2008; Meissner et al., 1999; Raffaele et al., 2006; 郭晋隆 et al., 2012)。

球茎甘蓝MYB62转录因子的克隆与表达特征分析王鑫淼;赵孟良;邵登魁;尕桑;任延靖【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2024(39)2【摘要】为了明晰球茎甘蓝MYB62转录因子的序列特征及其在逆境胁迫后的表达特征,进一步探索球茎甘蓝MYB62转录因子的生物学功能,为后续MYB62转录因子功能鉴定提供理论依据,以球茎甘蓝为研究对象,采用同源克隆的方法获得球茎甘蓝MYB62转录因子基因,并对其进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR的方法分析MYB62在球茎甘蓝不同组织间以及逆境胁迫后的表达特征。

基因克隆结果表明,BocMYB62基因gDNA全长1353 bp,CDS为837 bp,包括4个外显子和3个内含子,编码278个氨基酸。

序列结构分析结果显示,BocMYB62为亲水性蛋白,具有2个SANT-MYB结构域,属于R2R3-MYB型MYB转录因子;空间结构预测显示其具有典型的α-螺旋结构;系统发育分析表明,BocMYB62与甘蓝型油菜MYB62亲缘关系最近。

时空表达结果显示,BocMYB62在绿色球茎甘蓝中的表达量始终高于在紫色球茎甘蓝中,且存在明显的组织特异性,在干旱胁迫后BocMYB62表达量显著升高,胁迫12 h表达量最高,低温胁迫后BocMYB62表达量显著低于对照,在4℃低温胁迫时表达量最低,推断BocMYB62可能参与花青素生物合成调控,并可能参与逆境胁迫的调控作用。

【总页数】9页(P62-70)【作者】王鑫淼;赵孟良;邵登魁;尕桑;任延靖【作者单位】青海大学青海省蔬菜遗传与生理重点实验室;青海大学省部共建三江源生态和高原农牧业国家重点实验室;玉树藏族自治州农牧业综合服务中心【正文语种】中文【中图分类】S635.03;Q78【相关文献】1.苎麻BnbZIP1转录因子基因的克隆与表达特征分析2.His标记的小鼠线粒体转录因子A的克隆和表达纯化及其多克隆抗体的制备3.转录因子DREB1A基因的克隆与Gateway克隆技术构建植物表达载体4.杨树MADS转录因子SVL基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备5.球茎甘蓝MYB115转录因子的克隆与表达分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

・研究原著・文章编号:100022790(2008)0920785203鼠抗人cTn I 单克隆抗体Fab 段基因克隆和序列分析李妍妍1,2,杨　笛2,卞智萍2,徐晋丹2,陈相健2,顾春荣2,张寄南2(南京医科大学第一附属医院:1老年医学科,2心血管病研究所,江苏南京210029)收稿日期:2007211208;　接受日期:2008202226基金项目:江苏省135临床生物学诊断与治疗重点实验室(SKZ 2200205),江苏省人类功能基因组重点实验室基金资助通讯作者:张寄南.Tel:(025)83738572　E mail:J inanzh506@yahoo .co m 作者简介:李妍妍.博士,主治医师,讲师.Tel:(025)83718836　Email:lyynj m u123@C lon i n g andD NA sequence ana lysis of an ti 2cTn I m ur i n e an ti body Fab frag 2m en tL I Yan 2Yan1,2,YAN G D i 2,B I AN Zhi 2Ping 2,XU J in 2D an 2,CHEN X iang 2J ian 2,G U Chun 2Rong 2,ZHAN G J i 2N an21Depart m ent of Geriatrics,2I nstitute of Cardi ovascular D iseases,First Affiliated Hos p ital,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China【Abstract 】A I M :T o obtain the gene of murine anti 2cTn I Fabfrag ment and analyse the nucleotide and deduced a m ino acid sequences .M ETHOD S:By RT 2PCR method,the c DNA of anti 2cTn Imurine antibody Fab frag ment was a mp lified fr om the hybri 2doma cells .Cl oning and subsequent sequence analysis of the Fab frag ment were perf or med .The deduced a m ino acid sequence was compared and analysed with p revi ously published sequences .RESUL TS:A band of app r oxi m ate 700and 800base pairs was a mp lified using I gG heavy chain p ri m ers and κlight chain p ri m ers,res pectively .Sequence analysis indicated that the deduced a m ino acid sequences were in consistent with the characterizati on of the a m ino acid p resent in the murine I gG1Fab frag ment (Gen Bank accessi on NO AY484430,AY484431;Pr otein Bank accessi on NO AAR83243,AAR83244).CO NCL US I O N:The cl oning andsequencing of a comp lete murine anti 2cTn I Fab frag ment p r ovides a basis f or the p r oducti on of the chi m eric anti 2cTn I antibody .【Keywords 】antibody,monocol onal;genes;sequence analysis;cardiac tr oponin I【摘　要】目的:克隆鼠抗人cTn ImAb Fab 段基因并进行序列分析.方法:设计扩增鼠I gG 重链Fd 段及κ轻链引物,从分泌cTn ImAb 的杂交瘤细胞中提取总RNA,RT 2PCR 扩增,对扩增产物进行分子克隆、测序及序列分析.结果:重链和轻链引物分别扩增出一约700bp 和800bp DNA 片段.经序列分析,与已发表的鼠I gG 基因序列对比,其核苷酸及其所推导的氨基酸序列符合鼠I gG1Fab 段特征.在Gen Bank 登录,登录号为AY484430(重链),AY484431(轻链);氨基酸序列登录号为AAR83243(重链),AAR83244(轻链).结论:本实验室获得了完整的鼠源性抗人cTn ImAb Fab 段基因,为鼠抗人cTn I 的人源化改造奠定了基础.【关键词】抗体,单克隆;基因;序列分析;血清心肌钙蛋白【中图号】R542.2 【文献标识码】A0　引言本室已有多株高特异高表达的鼠源性抗人cTn I 细胞株,用来检测心肌损伤时外周血中cTn I 水平高低,显示了较高的临床诊断价值[1-4].但由于鼠源性mAb 的人抗鼠抗体反应[5],使之不能用于体内诊断及作为治疗心肌损伤的药物载体,所以必须对其进行人源化修饰,有关鼠源性抗人cTnI 的人源化改造少见报道.本研究目的是将鼠源性抗cTn I 抗体Fab 段基因克隆出来并进行序列分析,为下一步制备嵌合抗体打下基础.1　材料和方法1.1　材料　杂交瘤细胞株1株(JS200202),大肠杆菌E .coli DH5α由本室保存.p MD182T 载体购自TaKaRa 公司.Taq DNA 聚合酶,AMV 逆转录酶(Pr o 2mega 公司);I PTG (异丙基2β2D 半乳糖苷),X 2Gal (52溴242氯232吲哚半乳糖苷)为上海生物工程公司产品.质粒小量抽提试剂盒为上海华舜生物工程公司产品,G03S L 离心式高纯质粒大量抽提试剂盒为上海申能博彩生物科技有限公司产品.1.2　方法1.2.1　PCR 引物设计　根据已发表的小鼠Fab 段的Fd 基因和轻链基因、FR1和第一恒定区3′端的保守的基因序列,设计扩增Fd 基因和轻链基因的5′端和3′端引物.重链Fd 段5′端引物:H1:5′2S AK GTG CAG CT C G AG S AG T CA GG A CCT 23′;H2:5′2G AG GTY CAG CT C G AA CAR T CT GG A CCT 23′;H3:5′2CAG GTC CAA CTC G AG CAG YCT GGG KCT 23′;H4:5′2G AG GTT CAG CTC G AG CAG T CT GGR GC 2W G 23′;H5:5′2G AR GTG AAG CT C G AA G AG WCT GG A SG A 23′;H6:5′2G AG GTG AAG CTT CT C G ACTCT GG A GGT 23′;H7:5′2G AA GTG MAG CTC G AG G AG T CT GGG GG A 23′;轻链基因的5′端引物1:5′2CCT CT A G AG ACA TCC AG A TG A MCC AGT CT C C 23′;2:5′2CCT CT A G AG ACA TYK TGC TG A CYC ART CTC C 23′;3:5′2CCT CT A G AR ACA TTG T RA TG A C MC ART CTC C 23′;4:5′2CCT CT A G AG ACA TYC AG M TG A CYC AGT CT C C 23′;5:5′2CCT CT A G AG G AG ACA TTG TG A TG A CCC AGT C 23′;6:5′2CCT CT A G AG AT A TTG TG M T AA CYC AGK MTS MAS YC 23′;7:5′2CCT CT A G AG AT A T CS W K A TG A C MC AG W CT M C 23′;8:5′2CCT CT A G AG CTG TTG TGR TG A CYC AAA CT C C 23′;9:5′2CCT CT A G AG ATG TTK TG A TG A CCC AMA CT C C 23′;10:5′2CCT CT A G AG ATG TTT TG A TG A MCC AAA YT C C 23′;11:5′2CCT CT A G AG ARA ATS TGC T CA CCC AGT CT C C 23′;12:5′2CCT CT A G AS AAA TTG TT C T CA CCC AGT CTC C 23′;13:5′2CCT CT A G AC AGG CTG TTG TG A CTC AGG AAT C 23′;重链Fd 段3′端引物　I gG1:5′2AGG CTT ACT AGT ACA ATC CCT GGG CAC AAT 23′;I gG2b:5′2CTC CTT ACT AGT AGG A 2CAGGGGTTG ATTGT 23′;I gG3:5′2GGG GGT ACT AGT CTT GGG T AT TCT AGG CTC 23′;轻链基因3′端引物:5′2GCG CCG TCT AG A ATT AAC ACT CAT T CC TGT TG AA 23′.以上S =C /G,Y =C /T,M =A /C,W =A /T,K =T/G,r =A /G,由TaKaRa 公司合成.1.2.2　细胞总RNA 提取　从生长良好、能分泌mAb cTn I 的杂交瘤细胞中,用异硫氰酸胍法从5×107杂交瘤细胞中提取总RNA.1.2.3　RT 2PCR 扩增及其产物克隆　以O ligo dT9为引物逆转录合成c DNA.以合成的c DNA 为模板,用上述上下游引物分别两两配对,进行PCR,扩增出Fab 段的重、轻链基因片段.重链Fd 段PCR 反应条件为:94℃变性45s,57℃退火45s,72℃延伸60s,35个循环,最后72℃延伸5m in;轻链反应条件为:94℃预变性10m in,94℃变性1m in,60℃退火1m in,72℃延伸1m in,35个循环,最后72℃延伸10m in .回收扩增的Fd 和轻链基因,分别插入pMD182T 载体中,取T 载体0.5μL,回收的Fd 或轻链基因4.5μL,L igati on Soluti on 15μL,总反应体积10μL,16℃过夜反应.取4μL 连接反应液转化E .coli DH5α菌[6].利用蓝、白斑筛选,菌落PCR 鉴定重组质粒.1.2.4　菌落PCR 鉴定目的基因片段插入　引物序列为T 载体的测序引物:上游引物(Sequencing Pri m er RV 2M ):5′2G AG CG G AT AA C AATT T C AC A C AGG 23′,下游引物(Sequencing Pri m er M13247):5′2CG CC A GGGTTTT CCC AGT C A CG AC 23′,PCR 反应条件为:94℃预变性10m in,94℃变性1m in,52℃退火2m in,72℃延伸2m in,30个循环,最后72℃延伸10m in .取10μL 的反应体积以13g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 产物.电泳照片经计算机图像分析软件Quantity One 处理.1.2.5　DNA 序列测定与分析　将DNA 样品及抽提的重组质粒送大连宝生物制品有限公司,经AB1310全自动测序仪进行序列测定.用DNAMAN 和BLAST 软件分析所测序列.2　结果2.1　RNA 提取和RT 2PCR 扩增的目的基因片段及测序　从分泌mAb cTn I 抗体的杂交瘤细胞系JS200202中提取总RNA ,紫外分光光度计A 260nm /A 280nm >1.9,说明提取的RNA 纯度很高.H 1,H 4,H 5,H 7上游引物与下游引物I gG 1扩增出800bp 左右片段;H 3扩增出400bp 左右片段;H 2,H 6未见片段扩出(图1).下游引物I gG 2b ,I gG 3与所有上游引物配对均未见片段扩出.测序报告证实H 1,H 4,H 5,H 7引物扩增的重链Fd 段基因具有同源性.图2,3为轻链PCR 扩增电泳图,将扩出的所有片段进行测序,表明L 13引物扩增出700bp 左右片段为抗体序列片段,其余为非抗体序列片段.2.2　转化感受态细菌　选取H 1和L 13的PCR 产物作连接反应,转化感受态细胞,可以看到重链和轻链组分布均匀的蓝白菌落,二者比例约为1∶1,白色菌落均有20余个,对重链、轻链分别挑取16个菌落.2.3　菌落PCR 电泳　可见重链800bp 左右的片段,可见轻链700bp 左右的片段(图4,5),证明有目的片段插入T 载体中.用小量质粒抽提试剂盒将质粒抽提出来,送至TaKaRa 公司测序.2.4　重组质粒的插入片段测序报告[7-9]　GenBank 登录号分别为AY484430,AY484431.轻链第23位和第93位亦为骨架区的两个半胱氨酸(Cys ).上述获得的抗体Fab 段基因即是杂交瘤细胞正常表达的抗人cTn I 单抗基因,为I gG 1亚型.网上核对V BASE 数据库,重链可变区属于VH 3家族,J 段来源于JH 3a ,轻链可变区属于VK Ⅱ亚类(Subgr oup Ⅱ),J 段来源于JK 2.3　讨论由于本实验室已有能分泌mAb cTn I 的杂交瘤细胞系,因此,我们首先合成若干对通用引物,用RT 2PCR 技术,将抗cTn I 抗体的Fab 段基因扩增出来,测序,经I nternet 网(网址:www .ncbi .nl m .nih .gov/ig 2blast )[7]核实,发现H 1,H 5,H 73种引物扩增出来的重链序列具有同源性,为同一序列;在轻链基因克隆中,获得一个无功能的轻链产物,它来自杂交瘤亲代细胞之一2骨髓瘤细胞SP2/0.有关该骨髓瘤细胞分泌轻链的全序列已见报道,最突出的特点是其轻链基因的第23位氨基酸是酪氨酸(Tyr ),而不是真正杂交瘤细胞所分泌轻链的半胱氨酸(Cys ).如L 225,L 6210等上游引物扩增出来的c DNA 片段,均为这种无功能的轻链产物.L 1,L 11,L 12等上游引物扩增出来的c DNA 片段测序,经核实证明,缺失FR1和CDR1功能区.唯有L 13上游引物扩增出来的700bp 的c DNA 片段为有功能的轻链基因产物.为得到完整的Fab 段基因序列,取H 1和L 13引物PCR 产物做T A 克隆.测序结果用BLAST 和DNAman 软件分析,得到氨基酸序列的编码框,中间都没有中止密码.目前国内外尚未见抗cTn I 抗体基因序列相关报道.在本实验中所得到的重链和轻链的基因序列已经被美国国立医学图书馆的免疫球蛋白数据库收录,登录号分别为AY484430,AY484431.抗人cTnI 抗体的Fab 段基因的克隆及序列分析为抗人cTnI 嵌合抗体的真核蛋白表达打下基础.【参考文献】[1]张寄南,杨国平,苏恩本,等.血清肌钙蛋白I 诊断急性心肌梗塞的研究[J ],中华心血管病杂志,1997,25(5),379-382.[2]张寄南,苏恩本,魏　瑾,等.血清肌钙蛋白I 升高与病毒性心肌炎诊断及病程关系探讨[J ],中华心血管病杂志,1999,27(6),421-424.[3]Nageh T,Sher wood RA,Harris BM ,et al .Cardiac tr oponin I forrisk stratificati on f oll owing percutaneous cor onary artery interventi on in acute cor onary syndr omes[J ].Catheter Cardi ovasc I nterv,2001,55(1),37-42.[4]mith S C Jr,Blair S N,Bono w RO,et al .AHA /ACC Guidelines f or Pre 2venting Heart Attack and Death in 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桃基因组中R类抗病基因同源序列的克隆与序列分析梁凤山;周春江;孔凡娜;王斌【期刊名称】《河北农业大学学报》【年(卷),期】2005(28)1【摘要】许多抗病基因均具有核苷酸结合位点(NBS)和富含亮氨酸重复区(LRR).根据已知的NBS-LRR型抗病基因蛋白质的保守序列,设计简并引物,用以扩增桃基因组中的抗病基因同源序列.获得一条大小约500 bp的扩增片段,克隆测序后得到4个NBS-LRR类抗病基因同源片段(PNBS1、PNBS2、PNBS3、PNBS4).推导的氨基酸均具有P-loop(激酶1a)保守区和中间的激酶2a、激酶3a保守区,除PNBS4外,均具有3端疏水结构域.它们与已克隆的N、L6、PRS2等抗病基因在核苷酸水平上的同源性为21.1%～58.8%;在氨基酸水平上的同源性为18.8%～41.4%.这些抗病基因同源片段(RGA)可做为分子标记筛选桃的抗病候选基因.【总页数】5页(P44-48)【作者】梁凤山;周春江;孔凡娜;王斌【作者单位】中国科学院,遗传与发育生物学研究所,北京,100101;河北农业大学,农学院,河北,保定,071001;中国科学院,遗传与发育生物学研究所,北京,100101;中国科学院,遗传与发育生物学研究所,北京,100101;中国科学院,遗传与发育生物学研究所,北京,100101【正文语种】中文【中图分类】Q75【相关文献】1.蒙古冰草基因组类反转录转座子基因同源序列的克隆与序列分析 [J], 石凤敏;云锦凤;赵彦;张瑞霞2.甘薯中NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及序列分析 [J], 林巧玲;曾会才3.甘薯中NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及序列分析 [J], 林巧玲;曾会才4.云南3种野生稻中抗病基因同源序列的克隆及序列分析 [J], 刘继梅;程在全;杨明挚;吴成军;王玲仙;孙一丁;黄兴奇5.水稻全基因组编码抗病基因同源序列分析 [J], 任鄄胜;肖培村;陈勇;吕启明;王玉平;赵慧霞;李仕贵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

桃属植物染色体核型及种间亲缘关系分析
郭振怀;葛会波;王秀伶;闫景慧
【期刊名称】《园艺学报》
【年(卷),期】1996(23)3
【摘要】通过对桃属（ＡｍｙｇｄａｈｕｓＬ．）植物中的甘肃桃（Ａ．ｋａｎ
ｓｕｅｎｓｉｓＳｋｅｅｌｓ）、山桃〔Ａ．ｄａｖｉｄｉａｎａ（Ｃａｒ．）Ｙü〕、新疆桃〔Ａ．ｆｅｒｇａｎｅｎｓｉｓ（Ｋｏｓｔ．ｅｔＲｉａｂ．）〕、普通桃（Ａ．ｐｅｒｓｉｃａＬ．）种间的染色体核型分析，对其亲缘演化关系进行了探讨。

结果表明：甘肃桃和山桃，新疆桃和普通桃核型相似，亲缘关系相近；甘肃桃和山桃核型的对称性大于新疆桃和普通桃，处于较原始的分类地位；染色体臂比表明，核型的不对称性为甘肃桃＞山桃＞新疆档＞普通桃，甘肃桃原始性最强。

【总页数】4页(P223-226)
【关键词】桃属;核型;亲缘关系;桃树
【作者】郭振怀;葛会波;王秀伶;闫景慧
【作者单位】河北农业大学;唐山市园林绿化管理处
【正文语种】中文
【中图分类】S662.103.2
【相关文献】
1.厦门三种木麻黄属(Casuarina)植物的种内遗传变异和种间亲缘关系分析 [J], 葛菁萍;林鹏
2.4种芒属植物的核型分析及亲缘关系探讨 [J], 唐艳梅;易自力;邓果特;杜凤;项伟;
郑铖;刘清波;刘福来;肖亮
3.樱属植物核型参数及种间亲缘关系分析 [J], 顾宇;史港影;李祯;王贤荣
4.花生属栽培种和野生种间亲缘关系的研究Ⅰ.染色体Giemsa C-显带带型分析 [J], 詹英贤;吴爱忠;程明;周向臣
5.桃属植物种间亲缘关系及演化研究──花粉蛋白SDS电泳分析 [J], 宗学普;俞宏;王志强;齐茉陵
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调控桃树抗旱反应的转录因子PpDREB1的克隆及功能鉴定龚玉梅;王青华;侯玉霞;王豁然【期刊名称】《宁夏大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2008(029)001【摘要】通过酵母单杂交技术从桃树中分离到转录因子PpDREB1,GenBank注册号为EF635424.PpDREB1编码蛋白含有一个高度保守的AP2/EREBP 结构域,一个核定位信号和一个激活域,属于AP2/EREBP类家族转录因子的新成员.Northern杂交分析表明,PpDREB1在桃树根、茎和叶中都表达,同时,PpDREB1表达被ABA和干旱诱导,PpDREB1 mRNA累积速度较快,高盐和低温也能诱导PpDREB1高效表达.PpDREB1编码蛋白能激活报告基因LacZ的表达,具有明显的转录激活能力.这些结果表明,PpDREB1参与了非生物胁迫的信号转导途径.另外,将PpDREB1基因构建到pCAMBIA1304表达载体CaMV35S启动子下游,通过农杆菌介导转化法将其转入野生型拟南芥细胞中,转基因拟南芥抗旱性增强.【总页数】5页(P66-70)【作者】龚玉梅;王青华;侯玉霞;王豁然【作者单位】国家林业局,科技发展中心,北京,100714;中国农业大学,理学院,北京,100094;中国农业大学,理学院,北京,100094;中国林业科学院,林业研究所,北京,100091【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.桃树PpGL2转录因子基因克隆及生物信息学分析 [J], 赵丽;潘彩霞;庞可勤;郭君洁;李伟;李鸿雁;;;;;;2.大豆E3连接酶基因GmPLR-2的克隆及抗旱功能鉴定 [J], 张靓;刘添祎;冀采凤;郭轩麟;邵瑞超;周靖萱;王丕武3.山楂中木质素合成调控转录因子MYB46的克隆及功能鉴定 [J], 陈可钦;雷莹莹;郭运娜;宋梦如;刘丽馥;代红艳4.贵州青钱柳膜结合转录因子CpMTF9的基因克隆及功能鉴定 [J], 安银;戴星;罗海霞;熊孟连5.贵州青钱柳膜结合转录因子CpMTF9的基因克隆及功能鉴定 [J], 安银;戴星;罗海霞;熊孟连因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。