海芋过氧化氢酶的分离纯化及其性质

分离过氧化物酶体的方法过氧化物酶体在细胞里可是个独特的存在呢。

要把它分离出来，有一种密度梯度离心法。

这就像是在一个超级微观的世界里玩分层游戏。

把细胞破碎后的混合液放在一种特殊的密度梯度介质里，然后让离心机呼呼转起来。

不同的细胞器因为密度不一样，就会在这个梯度里跑到不同的位置。

过氧化物酶体呢，就会在属于它自己的那个密度层乖乖待着，这样就能把它和其他细胞器分离开啦。

还有一种免疫磁珠分离法呢。

这个就更有趣啦。

想象一下那些小小的磁珠就像一个个有超能力的小助手。

先给这些磁珠装上能特异性识别过氧化物酶体的抗体，就像给小助手装上了专门寻找目标的雷达。

然后把这个带着“雷达”的磁珠放到细胞裂解液里，磁珠一碰到过氧化物酶体就会紧紧抱住它。

这时候只要用个磁场，就能轻松地把磁珠连带过氧化物酶体一起吸出来啦，就像用魔法把目标物给吸走一样。

差速离心法也是常用的哦。

这个方法就像是在做筛选。

先低速离心，那些比较大、比较重的细胞器就先沉淀下去了，而过氧化物酶体还在溶液里呢。

然后再提高转速离心，过氧化物酶体就慢慢被分离出来啦。

这就像是从一群小伙伴里，先把大块头挑出去，再把目标小伙伴找出来。

不过呢，不管用哪种方法，都得小心翼翼的。

就像对待超级珍贵的小宝贝一样。

因为在细胞这个小小的世界里，每个细胞器都很脆弱，一不小心就可能把过氧化物酶体弄“伤”啦。

而且这些方法也不是百分百完美的，有时候可能会混进来一些其他的东西，还得经过进一步的检测和纯化呢。

但不管怎么说，这些方法已经能让科学家们比较好地把过氧化物酶体分离出来，去探索它更多的奥秘啦。

一种嗜热嗜碱过氧化氢酶的分离纯化及鉴定摘要：试图从嗜热嗜碱的嗜热子囊菌中分离纯化过氧化氢酶,以得到具有嗜热嗜碱性质的过氧化氢酶。

根据研究表明，嗜热嗜碱的嗜热子囊菌中的过氧化氢酶该酶为双亚基结构,分子量约为1·9×105,亚基分子量约为9·5×104，。

并且嗜热嗜碱过氧化氢酶均在广泛的pH 范围内表现稳定,酶亚基分子量较大,而大分子亚基被发现有更好的温度、pH 稳定性, H2O2耐受性[19]。

现在通过对酶的盐析及透析除盐、DEAE-Sepharose 离子交换层析、Superdex-200 凝胶过滤层析等方法对其进行分离纯化，通过对其分子质量的测定、酶活力的测定，等对其进行鉴定。

关键词：过氧化氢酶 分离纯化 鉴定1 实验流程图2 实验步骤2.1 菌种培养从-20 ℃冰箱保藏的嗜热子囊菌菌种挑取一环接入盛有70 mL种子培养基中(糖度为6°P的天然麦芽汁，pH 7.5)的250 mL 摇瓶中，在37 ℃、200 r/min 培养12 h. 然后以6%接种量接种至装有80 mL 发酵培养基的500 mL 摇瓶中，在37 ℃、200r/min 培养30 h.2.2 酶的盐析及透析除盐取发酵液,过滤去除菌体,加硫酸铵至饱和度50%, 5℃下过夜,10000 r ·min-1离心15 min,除去沉淀（除去其他不溶性杂质）,上清液继续加入硫酸铵至饱和度90%, 5℃下静置12 h,离心收集沉淀,用少量10 mmol ·L-1的Tris-HCl(pH 8·0)缓冲液溶解,蒸馏水透析48 h （除去硫酸铵等小分子离子杂质）,透析后的酶液5℃下保存，得到嗜热嗜碱过氧化氢酶的粗提取物。

2.3 DEAE-Sepharose 离子交换层析DEAE-Sepharose 离子交换层析柱经 0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH7.2)平衡后，初酶液上样5mL ，用0～1mol/L 的NaCl 溶液(用0.05mol/L ，pH7.2 的磷酸缓冲液配制)进行线性梯度洗脱，流速 30mL/h ，每管收集 5mL ；然后测定各管 CAT 活力和蛋白质含量，收集活性较高的各管酶液（得到嗜热嗜碱过氧化氢酶的细提取物），4℃蒸馏水透析脱盐过夜。

过氧化物酶的提取、分离、纯化及其测定实验1 过氧化物酶的提取、分离、纯化一、目的意义酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。

为要研究酶，首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化。

不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。

在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。

本实验的目的是了解并掌握匀浆、盐析、透析及酶活性测定的原理及操作。

二、原理（一）酶的提取从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。

此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，也有在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。

如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。

其次，细胞中存在抑制物质，如酚、酸、离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。

酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如-SH、-NH2，通过1,4-加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。

海洋生物中重要酶类的纯化与鉴定随着人们对海洋资源的深入开发和研究，发现海洋中存在着许多珍贵的生物资源，其中包括很多重要酶类。

酶是一种生物催化剂，对于化学反应速度的加速、生物物质的合成和降解、代谢调控等方面都起着至关重要的作用。

因此，海洋中的酶类资源具有广阔的研究和应用前景，是现代生物技术和药物研究领域中不可缺少的重要资源。

然而，海洋中的生物资源非常复杂，要从中提取和纯化出目标酶类，需要经过一系列复杂的操作和检测步骤。

下面将介绍海洋生物中重要酶类的纯化与鉴定。

一、酶类的来源与分类酶类来源于自然界中的各种生物，包括动物、植物和微生物等。

根据其作用特性和结构特征，可以将酶类分为多种类型，如水解酶、氧化酶、还原酶、转移酶、异构酶等。

在海洋生物中，也存在着各种类型的酶类，如蛋白酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶等。

二、酶类的纯化方法酶类的纯化是指将海洋生物中的目标酶类从其他杂质分离出来，得到较为纯净的酶制剂的过程。

酶类的纯化方法一般分为物理方法和化学方法两种。

1.物理方法物理纯化方法主要包括离心、摇床、超滤等。

其中，离心法是通过不同的离心速度将混合物中的细胞碎片、代谢产物等不同大小和密度的物质分离开来，从而得到目标酶类。

摇床法是利用水平振荡将混合物分成不同重量的层次，从而将目标酶类分离出来。

超滤法则是利用不同的孔径大小过滤膜将不同分子量的物质分离出来。

2.化学方法化学纯化方法主要包括沉淀分离、离子交换、凝胶过滤、亲和层析等。

其中，沉淀分离法是利用加入一些沉淀剂，将想要分离的酶类沉淀下来。

离子交换法则是利用具有活性的离子交换树脂将混合物中的酶分离。

凝胶过滤法是利用具有孔隙的聚合物凝胶将不同分子大小的物质分离开来。

亲和层析则是利用与目标酶类有特异性结合的亲和剂纯化出目标酶制剂。

三、酶类的鉴定方法酶类的鉴定是指对酶制剂的纯度、活性、稳定性等指标进行测试分析，以确定是否满足制药或其他生物技术应用的要求。

常用的酶类鉴定方法主要包括以下几种：1.测定酶的活性：通过测定酶对某种底物的反应速度来确定酶的活性水平。

酶的分离纯化---介绍酶分离纯化的步骤、原则和评价方法⏹酶的分离提纯●酶分离纯化的目的：研究酶的性质、作用、反应动力学、结构与功能的关系、阐明代谢途径；作为生化试剂和药物。

●酶提纯主要包括：酶制剂的浓缩；杂蛋白和杂质的去除●分离纯化方法的衡量指标总活力回收；比活力提高的倍数。

材料处理抽提分离纯化鉴定机械、化学，组织/细胞破碎,蛋白质释放缓冲液、离子浓度pH，蛋白质溶解到缓冲液，盐析、有机溶剂、等电点、吸附、超滤，缩小体积离心离心离子交换、凝胶过滤、疏水层析、亲和层析、高效液相、快速蛋白质液相层析、电泳、结晶电泳、结晶、溶解度、高效液相，二种以上分子量、等电点、活性酶总活力比活力回收率纯化倍数酶总活力比活力酶总活力比活力酶总活力比活力酶总活力比活力酶的分离提纯过程⏹评价指标●总活力=活力单位数/ml×总体积（ml）●比活力=活力单位数/ mg蛋白（氮）=总活力单位数/ 总蛋白（氮）mg ●纯化倍数=每次比活力/第一次比活力●回收率=每次总活力/第一次总活力某科研人员在对酶分离纯化过程中得到以下实验结果：请根据上述实验结果回答以下问题：⑴在六部分离纯化过程中，哪一步（A）分离效果最好，哪一步（B）分离效果最差？依据是什么？⑵上述A和B步骤分离纯化方法的原理是什么？⑶该酶是否已经纯化？还可以用什么方法确定其纯度？分离步骤总蛋白质含量(mg) 活力单位数1 粗分离20 000 4 000 0002 盐析 5 0003 000 0003 等电点分离4 000 1 000 0004 离子交换200 900 0005 亲和层析50 750 0006 分子筛层析45 675 000分离步骤总蛋白含量mg 活力单位数比活力回收率纯化倍数1粗分离20 000 4 000 00020010012盐析 5 000 3 000 0006007533等电点分离 4 000 1 000 00025025 1.254离子交换200900 000450022.522.55亲和层析50750 0001500018.75756分子筛层析45675 0001500016.8875回收率=100*每一步的活力单位数/第一步的活力单位数纯化倍数=每一步的比活力/第一步的比活力取XXmL 酶液测定其中蛋白质的含量，换算总蛋白含量取XXmL 酶液测定其中酶活力单位数，换算活力单位数总活力数/总蛋白含量宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化纯化步骤总蛋白总活力比活力纯化倍数回收率（mg）（U）（U/mg蛋白）（%）1、粗酶液80 4320 54 1 1002、乙醇沉淀29 3585 123 2.27 833、醋酸钙沉淀21 2980 141 2.64 694、盐析 4 1771 464 8.52 415、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 276、结晶0.12 130 1072 19.70 3。