组培实验报告：胡萝卜愈伤组织诱导培养

山西师范大学学报(自然科学版)第18卷第2期Journal of Shanxi Teacher c s University Vol.18No.2 2004年6月Natural Science Edition June2004文章编号:1009-4490(2004)02-0071-06胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究尹文兵,李丽娟,黄勤妮,李艳红(首都师范大学生物系,北京100037)摘要:分别以胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层为外植体诱导出愈伤组织,并建立细胞悬浮系.实验结果表明:胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体;诱导松散型愈伤组织的最佳激素浓度配比是1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT;细胞悬浮培养细胞最佳起始密度为1.125@104个/mL~2.325@104个/50mL时,7d~9d为对数生长期;继代培养4代~5代时,可得到稳定的悬浮细胞系.关键词:胡萝卜;组织培养;细胞悬浮培养;松散型愈伤组织;生长曲线中图分类号:S631.2文献标识码:A胡萝卜(Daucus carota L.),属于十字花科植物,是一种十分重要的蔬菜作物,由于其营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培.中国是农业大国,胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用.因此,加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要[1].近些年来,随着生物技术与分子生物学技术的快速发展,作为生物技术研究的理想材料,许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究.我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展,特别是在组织培养、原生质体融合[2]、遗传转化及再生等方面.但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多,因此继续深入研究还是很有必要的.本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基和细胞悬浮培养的条件进行探讨,为其次生代谢产物A-胡萝卜素、B-胡萝卜素的生产以及将来的工厂化和分子生物学研究打下基础.1材料和方法1.1材料来源胡萝卜种子由中国农科院蔬菜所提供.1.2方法收稿日期:2004-03-22作者简介:尹文兵(1979)),男,山西安泽人,首都师范大学在读硕士研究生,主要从事功能基因组学方面的研究.72山西师范大学学报(自然科学版)2004年1.2.1胡萝卜愈伤组织的诱导(1)以胡萝卜子叶和下胚轴为外植体诱导[2].将胡萝卜种子搓去种毛,然后在75%的酒精中消毒5min,无菌水冲洗一遍后,用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍,再用无菌水浸泡30min,最后用无菌水漂洗一遍,接种在无激素的MS培养基上.10d左右种子开始萌发,待两片子叶伸展,而心叶刚刚显露时,将幼苗的下胚轴和子叶切成0.3c m 左右的小段,接种在附加植物激素1.0mg/L2,4-D,1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT,2.0mg/L 2,4-D,2.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT的MS培养基的三角瓶中,培养30天左右,即可诱导出愈伤组织.继代培养时,将老的和生长不良的愈伤组织去掉,将大的健康的愈伤组织切至0.5c m,再放于含0.1mg/L2,4-D的MS培养基(pH5.7)上继续培养.诱导和继代培养均在黑暗条件下进行,培养温度为25e,继代培养时间为3周~4周更换一次培养基.观察并记录继代过程中愈伤组织状态的变化.(2)以胡萝卜直根形成层为外植体诱导.用清水洗净胡萝卜直根,用小刀削去表皮和顶部,将其在75%的酒精中消毒5min,再用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍,再用无菌水浸泡30min,最后用无菌水漂洗一遍.消毒好的胡萝卜直根,切去下边的2/ 3部分,留下部分用消毒好的小刀,沿截面横切成厚度1mm左右的小圆片,然后将小圆片的韧皮部和木质部切去,留下形成层,再切成长3mm,宽1.5mm,高1mm的小长块,接种在(1)中的诱导培养基上,获得愈伤后进行继代培养,培养环境条件与(1)相同.1.2.2胡萝卜细胞悬浮系的建立[3]用镊子夹取在固体继代培养基上继代20d左右的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的愈伤,接种在含0.3mg/L2,4-D的液体培养基(pH5.7)中,每100mL的三角瓶中加入液体培养基50mL,摇床转速为110r/min,温度为25e,黑暗培养.每隔7d继代一次,连续培养4代~5代后逐渐形成稳定的细胞系.细胞悬浮培养液体培养基成分与愈伤组织继代培养的培养基相同,但不加琼脂.每隔1d在倒置显微镜下观察细胞形态、分散程度并照相,进行细胞计数,以建立细胞数生长曲线.1.2.3细胞悬浮生长曲线的测定取0.5g悬浮培养物,接入新鲜液体培养基中,进行振荡培养,每隔1d取样1次,共培养13d,连续做3次平行实验.1.2.4悬浮细胞数目的测定用血球计数板法[1]对胡萝卜悬浮细胞计数,全部操作在无菌环境下进行,每个结果为4次平行实验的平均值.细胞数按下面公式计算:1mL悬浮液中的总细胞数=A/5@25@ 104@B,A为5个中方格总细胞数,B为稀释倍数.2结果与讨论2.1外植体对愈伤组织状态的影响有文献报道,不同外植体的脱分化能力不同,诱导出愈伤组织的频率和愈伤组织的状态也不同.在胡萝卜愈伤组织诱导时,本实验采用三种外植体:胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层.经过30d观察发现,三种外植体经过培养均诱导获得了愈伤组织.结果如下:以子叶为外植体的大约有2/3诱导获得了愈伤组织,多数愈伤组织呈浅黄色,生长旺盛,质地松散,含水量大,分散性好,但也有一些状态不好,色泽发暗,选取好的可作为细胞悬浮培养的材料;以下胚轴为外植体几乎所有都获得了愈伤组织,并且愈伤组织生长旺盛,呈黄色,比较疏松,分散性好,适宜于细胞悬浮培养;而以直根形成层为外植体获得的愈伤组织不多,色泽较暗,有些带褐色,愈伤组织生长缓慢,质地较硬,分散度差,不适宜于细胞悬浮培养.因此,可认为胡萝卜下胚轴是诱导愈伤组织和进行细胞悬浮培养的理想外植体.2.2 激素对愈伤组织状态的影响不同的激素及激素浓度直接影响着愈伤组织的状态、质地和分散性,而这些因素又是松散愈伤组织的关键,也是进行细胞悬浮培养的必要前提.因此,本实验诱导胡萝卜愈伤组织及继代培养设计了4种激素组合[见1.2.1(1)],通过多次继代培养发现,1.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT 组合诱导出的胚性愈伤组织(见图1)生长旺盛、呈黄色米粒状分散性好、质地松软、含水量小,有利于细胞悬浮培养,而半胚性愈伤不适合进行细胞悬浮培养.其他3种组合中,2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT 诱导出的愈伤组织也比较疏松,而另两种诱导出的愈伤组织质地比较坚实,有褐化现象.可见,2,4-D 与KT 的结合有利于疏松愈伤组织的诱导.图1 胡萝卜松散型愈伤组织 左图:胚性愈伤 右图:半胚性愈伤Fig.1 The imcompact calli.of Daucus carota L Left:embrogenic callus Ri ght:semiembrogenic callus2.3 继代次数与细胞状态之间的关系在细胞悬浮培养的过程中,需要不断地进行继代,来筛选出良好的、较稳定的细胞系.继代过程中,细胞悬浮液的颜色、细胞的形态、大小、数量不断在发生着变化.第1、2次继代时,细胞悬浮液为白色或浅黄色,混浊,有许多大颗粒,倒置显微镜下观察,细胞多数成团,保持较旺盛的分裂能力,单细胞大多呈长形、梭形、不规则形(见图2),细胞个体较大;3、4次继代时,细胞悬浮液变为黄色,比较粘稠,颗粒大小分布均匀,倒置显微镜下观察,分裂的细胞团增多,有的细胞团明显可见有20个~30个球形细胞组成,单细胞数目增多,而且大多呈球形;5次继代时,细胞悬浮液(见图3)呈透明的黄色,澄清,呈油状流动,颗粒分布很均匀,直径大多在0.5m m~1mm,倒置显微镜下观察,细胞团和单细胞很多,大多呈球形(见图4),大小均匀;6、7次继代以上时,悬浮液变得比较澄清,呈浅黄色,悬浮颗粒大小均匀,倒置显微镜下观察,细胞大多成团,可以清楚的看出细胞呈球形,比较均匀,73 第2期 尹文兵,等:胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究也有单细胞,但是不多,这可能与细胞聚集成团的特性有关.图2 不规则细胞(10@) 图3 黄色的细胞悬浮液Fig.2 Irregular cell (10@)Fig.3 Yellow cell suspension因此,继代培养过程中,随着继代次数的增多,细胞悬浮液由无色或浅黄色变为黄色,由混浊变为澄清、透明,颗粒大小由不均匀到均匀,最终直径在0.5mm~1mm,倒置显微镜下观察,单细胞由长形、梭形、不规则形变为规则的球形,细胞系逐渐趋于稳定.随后,我们又从筛选出来的细胞系将细胞接种到不含激素的MS 培养基上,7d 后长出新的愈伤组织,30d 后长出胡萝卜全苗并转入蛭石成活(图5),说明以细胞系转化为新的愈伤组织生成再生植株是成功的.图4 球形细胞(40@) 图5 再生植株Fi g.4Global cell (40@) Fig.5Plant regeneration2.4 细胞起始密度对细胞悬浮培养的影响在细胞悬浮培养时,细胞生长需要一个最低生长密度,低于此密度,细胞生长速率降低或根本不生长[4].适宜的起始密度可以缩短细胞系筛选的时间,起始密度过大过小不仅会影响细胞系筛选的时间而且不利于稳定细胞系的建立.同时,细胞的起始密度对细胞培74山西师范大学学报(自然科学版) 2004年养周期也有影响.为此,本实验设计了4个密度梯度:0.4@104个/50mL,1.125@104个/50mL,2.325@104个/50mL,8.875@104个/50mL.培养13d,细胞状态随天数的变化见表1。

南昌大学实验报告胡萝卜愈伤组织诱导姓名：学院：专业：班级：学号：胡萝卜愈伤组织诱导实验一母液的配制与保存一、实验目的1.学习母夜的配制方法和母液的保存方式。

2.熟悉掌握制备母液的操作。

二、实验原理培养基中提供植物生长所需的营养成分，才能满足植物正常的生长发育的需求。

主要包括水分、有机物质、盐类，而配制母液时将其分为大量、微量、钙盐、镁盐、铁盐、有机和肌醇分别配制。

配臵培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配臵，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量分别先配制成一系列的母液臵于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配臵即可。

三、实验材料、试剂和仪器设备1．试剂NH4NO3,KNO3,KH2PO4,CaCl2〃2H2O,MgSO4〃7H2O,FeSO4〃7H2O Na2-EDTA, MnSO4〃4H2O,ZnSO4〃7H2O,H3BO3,KI,Na2MoO4〃2H2OCuSO4〃5H2O,CoCl2〃6H2O,肌醇，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，蒸馏水。

2.仪器设备电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml）量筒（1000ml、100ml、25ml），容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，移液管（10ml，5ml，1ml）试剂瓶，玻璃棒数支，药芍，称量纸等。

四、实验步骤 1 、计算：计算各化学成分所需要的量。

大量、微量和盐类按扩大50倍，定容500ml的配制计算。

有机和肌醇按扩大100倍，定容200ml的配制计算。

计算后制成配方表。

2、制定标签：裁取7张适当大小的牛皮纸，用铅笔写上MS，种类，并标明此类母液所含物质，质量，定容体积，扩大倍数吸取量，制备人，制备日期。

3、大量元素母液的配制：先用量筒量取300ml蒸馏水放入500ml 烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3 ,KNO3 , KH2PO4 , 待第一种化合物完全溶解后再加入第二种化合物，溶解过程用玻璃棒搅拌，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液转移至500ml 容量瓶中，并用蒸馏水将烧杯和玻璃棒洗涤3次，每次约50ml，而后用蒸馏水定容至500ml，然后转移至细口试剂瓶中，贴上标签，并臵于冰箱中低温保存备用。

本科学生综合性实验报告
学号姓名
学院生命科学学院专业、班级09级生物科学B班实验课程名称植物组织培养实验
教师及职称龙维彪（讲师）
开课学期2011 至2012 学年下学期填报时间2012 年 6 月 1 日
一．实验设计方案
二．实验报告
⑴胡萝卜愈伤组织的诱导结果：
经过诱导，4瓶都出现污染状况，做继代培养用小组的实验材料。

⑵继代培养的结果：
如上图所示，继代培养得到的三瓶均无污染，三瓶中的愈伤组织增殖情况均良好，其中3瓶特别好，愈伤组织呈现结构疏松的特点。

污染情况：无污染。

长势情况：长势良好。

颜色情况：部分颜色有点暗淡，少部分为金黄色，颜色发亮。

云南大学生命科学学院本科教学实验教学中心细胞工程实验实验报告胡萝卜愈伤组织诱导培养实验摘要：以胡萝卜为实验材料，利用直根形成层为外植体诱导出愈伤组织，探讨了不同激素比例对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，然后在诱导后的愈伤组织多次继代培养获得生长旺盛的分化组织，接着进行再分化，在胡萝卜培养过程中掌握诱导培养技术还有细胞培养所要求的无菌技术。

关键字：胡萝卜；愈伤组织；继代培养；再分化；组织培养胡萝卜(Daucus carota L)为伞形科两年生草本植物，因其营养丰富、又具药用价值，且耐运输、易栽培、病虫害少和耐贮藏，而成为人们常食蔬菜。

同时又作为生物技术研究的理想材料，因此建立一个高效的、实用的组织培养快速繁殖体系则是研究植物遗传转化的基础。

本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基进行探讨，研究了激素对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，为其高效生产次生代谢产物α-胡萝卜素、β-胡萝卜素以及将来组织培养的工厂化和分子生物学研究打下基础【1】。

1.材料和方法1.1材料来源：胡萝卜根，长10~20cm，直径1cm以上。

1.2方法：1.2.1愈伤组织的诱导培养（1）培养基的配制：MS +2，4-D 2mg/L + KT 0.5mg/L+3%（30g/L）白砂糖+0.95%（9.5g/L）琼脂，pH5.8（2）胡萝卜的选材、修剪和清洗：选择新鲜较粗的萝卜，先用自来水冲洗，再2％洗涤剂浸泡20分钟，清水冲洗（注意材料损伤）（3）对材料进行灭菌：在超净工作台上用75％乙醇30-60s；0.1%升汞8-10分钟; 无菌水冲洗3-5次；（4）无菌修剪：用解剖刀进一步去除两端1cm，将中断切成0.5cm厚的薄圆片，然后再切去外壁2—3mm厚的皮，选取中间的部分移至无菌的部分，用刀通过形成层切成1cm2的小块；（5）接种：无菌操作将处理好的材料接种于培养基上，2-3个材料/瓶（6）培养及观察记录：25 ℃，光照培养，定期观察污染情况，生长状况1.2.2继代培养从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在无激素的新鲜培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3个切块。

一、实验目的1. 掌握植物组织培养技术，特别是胡萝卜愈伤组织的诱导培养方法。

2. 了解胡萝卜愈伤组织诱导过程中各因素对愈伤组织生长的影响。

3. 熟悉无菌操作技术，提高实验操作的规范性和准确性。

二、实验材料1. 胡萝卜（品种：心里美）2. MS培养基母液3. 常用试剂：琼脂、蔗糖、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1、氯化钙、氢氧化钠、盐酸、酒精等4. 实验器材：超净工作台、高压蒸汽灭菌器、移液器、剪刀、镊子、培养皿、培养瓶等三、实验方法1. 胡萝卜外植体的选取与消毒选取胡萝卜根尖部位作为外植体，用70%酒精消毒30秒，再用无菌水冲洗3次。

2. 胡萝卜愈伤组织的诱导培养将消毒后的胡萝卜外植体接种到MS培养基中，添加适量的植物生长调节剂（如2,4-D、NAA等），在恒温培养箱中培养。

3. 胡萝卜愈伤组织的继代培养当愈伤组织生长到一定阶段后，将其转移到新的培养基中进行继代培养，继续观察愈伤组织的生长情况。

4. 胡萝卜愈伤组织的诱导效果分析通过观察愈伤组织的生长速度、颜色、质地等特征，分析不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响。

四、实验结果1. 胡萝卜愈伤组织的诱导培养在MS培养基中添加2,4-D浓度为0.5mg/L时，胡萝卜愈伤组织诱导效果最佳，诱导率可达90%。

2. 胡萝卜愈伤组织的继代培养在继代培养基中，胡萝卜愈伤组织的生长速度较快，颜色逐渐变浅，质地逐渐变软。

3. 不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响在实验中，我们发现2,4-D、NAA、IAA等植物生长调节剂对胡萝卜愈伤组织的诱导效果有一定影响。

其中，2,4-D浓度在0.5mg/L时，诱导效果最佳。

五、实验结论1. 胡萝卜愈伤组织诱导培养是一种有效的植物组织培养方法，可用于植物繁殖、基因转化等研究。

2. 在胡萝卜愈伤组织诱导过程中，植物生长调节剂2,4-D对愈伤组织的诱导效果最佳。

3. 通过实验，我们掌握了胡萝卜愈伤组织诱导培养的基本操作技术，为进一步研究植物组织培养提供了实验基础。

本科学生综合性实验报告
学号074120219 姓名吕师留
学院生命科学学院专业、班级07级应生A班实验课程名称植物组织培养实验
教师及职称龙维彪（讲师）
开课学期2009 至2010 学年下学期
填报时间2010 年 5 月11 日
云南师范大学教务处编印
一．实验设计方案
1．实验现象与结果
1.1我们小组负责配制有机成分母液的配制，配好后透明澄清，配制完成，下一星期再用时也没有产生沉淀。

1.1.2胡萝卜块根接种经两个星期培养的结果为所示：
由于我的图片没有，所以只能写下记录结果本次实验形成愈伤组织的效率是100%每一瓶的接种量为5块。

有两瓶比较好，一瓶被烫伤一点，主要的原因是接种时胡萝卜块大小适中，且无菌操作好。

1.1.3胡萝卜愈伤组织接种后，经两个星期培养的结果为如下图所示：
此次实验圆满成功，愈伤组织多，且多，色泽鲜艳，质地疏松，都过60ml的刻度线。

3．实验总结
此次实验获得圆满成功，学会了无菌操作，且其他操作技能也得到锻炼。

教师评语及评分：
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北京师范大学珠海分校实验报告姓名：实验名称：胡萝卜愈伤组织的诱导学院（系、所）：工程技术学院学科专业：生物技术导师姓名：报告时间：2012.2.15—2012.3.20实验序号01实验名称胡萝卜愈伤组织的诱导实验时间2012.2.15—2012.3.20实验室工程技术学院1206 1209 1．研究背景1.1 胡萝卜胡萝卜（Daucus carrot），属于十字花科植物，是一种十分重要的蔬菜植物。

由于其营养价值高,及其适于生食、加工、烹调等多种用途,在世界范围内广泛栽培。

中国是农业大国,胡萝卜作为蔬菜作物在人们生活中起着重要的作用.因此,加快我国胡萝卜育种研究以成为迫切需要。

近些年来,随着生物技术与分子生物学技术的快速发展，作为生物技术研究的理想材料，许多国家对胡萝卜体细胞杂交技术、遗传转化与再生技术、分子标记与基因克隆技术进行了广泛深入的研究。

我国科研工作者在胡萝卜的生物技术与分子生物学研究上也取得了一定进展，特别是在组织培养、原生质体融合、遗传转化及再生等方面。

但是在胡萝卜细胞培养方面并不是太多。

因此继续深入研究还是很有必要的。

此外，由于市面上的胡萝卜价格比较便宜，材料易得，而且在组织培养方面容易诱导发生，我们可以通过这个实验熟悉植物组培。

1.2 组织培养植物组织培养概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。

器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。

植物组织培养概念（狭义）指用植物各部分组织，如形成层。

薄壁组织。

叶肉组织。

胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。

2．实验设备与材料2.1 实验设备冰箱、普通天平、分子天平、试剂瓶（棕色和白色）、量筒、烧杯、容量瓶、药勺、称量纸、玻棒、标签纸、三角瓶、吸管、玻璃棒、精密pH试纸（5.4～7.0）、PH试纸（5.4～7.0）、封口膜、橡皮筋、微波炉、高压蒸汽灭菌锅、已灭菌滤纸、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、大烧杯、小烧杯、50ml三角瓶、50ml 量筒、100ml量筒、10ml和5ml还有2ml吸管、200ml定容瓶。

一、实验目的1. 掌握植物组织培养的基本原理和方法。

2. 学习胡萝卜愈伤组织的诱导、继代培养和细胞悬浮培养技术。

3. 了解胡萝卜体细胞胚胎发生培养的过程。

二、实验原理植物组织培养技术是利用植物细胞的全能性，通过人工控制培养条件，使植物细胞或组织在体外发育成完整植株的技术。

胡萝卜愈伤组织诱导、继代培养和细胞悬浮培养是植物组织培养技术中的重要环节。

三、实验材料与仪器材料：- 胡萝卜- MS培养基- 营养液- 消毒剂- 玻璃器皿- 移液器- 高压蒸汽灭菌器- 恒温培养箱四、实验步骤1. 胡萝卜外植体消毒- 将胡萝卜洗净，切成小块，用70%酒精消毒30秒，然后用无菌水冲洗3次。

- 将消毒后的胡萝卜小块接种于MS培养基中。

2. 愈伤组织诱导- 将接种后的胡萝卜小块放入恒温培养箱中培养，温度控制在25℃左右，光照时间为12小时/天。

- 观察胡萝卜小块的愈伤组织形成情况。

3. 愈伤组织继代培养- 将形成的愈伤组织转移到新的MS培养基中进行继代培养。

- 继代培养过程中，每隔一段时间更换一次培养基。

4. 细胞悬浮培养- 将继代培养后的愈伤组织切成小块，接种于营养液中。

- 将接种后的细胞悬浮培养于恒温培养箱中，温度控制在25℃左右，光照时间为12小时/天。

- 观察细胞悬浮培养过程中细胞生长和繁殖情况。

5. 胡萝卜体细胞胚胎发生培养- 将细胞悬浮培养获得的细胞转移到新的培养基中进行胚胎发生培养。

- 观察胚胎发生培养过程中胚胎的形成情况。

五、实验结果与分析1. 愈伤组织诱导- 在适宜的培养条件下，胡萝卜小块逐渐形成愈伤组织。

2. 愈伤组织继代培养- 经过继代培养，愈伤组织数量增加，体积增大。

3. 细胞悬浮培养- 细胞悬浮培养过程中，细胞生长和繁殖良好，形成了大量悬浮细胞。

4. 胡萝卜体细胞胚胎发生培养- 胚胎发生培养过程中，部分细胞形成了胚胎，进一步发育成胡萝卜植株。

六、实验结论1. 通过本实验，成功诱导了胡萝卜愈伤组织。

一、实验目的1. 了解植物组织培养的基本原理和方法。

2. 掌握胡萝卜组织培养的操作步骤。

3. 观察胡萝卜愈伤组织诱导、增殖、分化等过程。

4. 分析胡萝卜组织培养的实验结果，探讨影响实验效果的因素。

二、实验材料与仪器1. 实验材料：胡萝卜、无菌手术刀、镊子、剪刀、无菌滤纸、无菌水、无菌培养基等。

2. 实验仪器：超净工作台、培养箱、显微镜、电子天平、移液器、培养皿等。

三、实验方法1. 胡萝卜外植体准备：将胡萝卜洗净，用无菌手术刀将胡萝卜根切成小块，每个小块约1cm×1cm，放入75%酒精中消毒30秒，再用无菌水冲洗3次。

2. 胡萝卜愈伤组织诱导：将消毒后的胡萝卜小块接种于MS培养基中，培养温度为25℃±2℃，光照强度为2000lx，光照时间为12小时/天。

3. 胡萝卜愈伤组织增殖：待愈伤组织形成后，将其转接到增殖培养基中，继续培养。

4. 胡萝卜愈伤组织分化：将增殖后的愈伤组织转接到分化培养基中，诱导其分化成植株。

5. 观察与记录：定期观察胡萝卜愈伤组织的生长状况，记录实验数据。

四、实验结果与分析1. 胡萝卜愈伤组织诱导：在MS培养基中，胡萝卜小块经过7天培养，部分小块开始形成愈伤组织，愈伤组织呈白色、半透明状。

2. 胡萝卜愈伤组织增殖：在增殖培养基中，愈伤组织经过10天培养，体积明显增大，颜色逐渐变深。

3. 胡萝卜愈伤组织分化：在分化培养基中，愈伤组织经过15天培养，部分愈伤组织分化出芽和叶片，形成完整的植株。

4. 影响实验效果的因素分析：（1）培养基配方：MS培养基中含有丰富的营养成分，有利于胡萝卜愈伤组织的生长和分化。

（2）外植体消毒：消毒效果直接影响愈伤组织的形成和生长，消毒时间不宜过长，以免损伤外植体。

（3）光照条件：光照强度和光照时间对愈伤组织的生长和分化有重要影响，适宜的光照条件有利于愈伤组织的形成和分化。

（4）温度：温度是影响胡萝卜愈伤组织生长和分化的关键因素，适宜的温度有利于愈伤组织的生长和分化。

胡萝卜愈伤组织的培养摘要：实验中的胡萝卜的组织培养实验成功率比较低，主要体现在污染率较高和出芽率低上，在长期的实验中，有些胡萝卜的愈伤组织基本分化不出芽。

针对这一问题我们反复实验。

通过把培养出来的胡萝卜的愈伤组织进行悬浮培养后，再转接到固体培养基上，从而使得胡萝卜愈伤组织更容易分化出芽来。

并使整个过程控制在无菌条件下，现就胡萝卜组织培养的整个实验过程控制作一详细介绍。

关键词：胡萝卜；组织培养；无菌控制1.实验流程（1）实验总流程：MS母液培养基的配置→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配制→胡萝卜愈伤组织诱导→胡萝卜愈伤组织的继代培养→观察记录（2）无菌操作流程：实验员消毒→实验室、无菌台灭菌→实验器材的灭菌→无菌接种→消毒→实验台卫生（3）胡萝卜愈伤组织诱导培养流程：胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配置→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的分装→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基灭菌→取材及材料的消毒灭菌→接种与培养（4）胡萝卜愈伤组织的继代培养流程：器械及实验者的消毒灭菌→剥离愈伤组织诱导培养所得的愈伤组织→胡萝卜愈伤组织接种2.实验仪器及材料胡萝卜(市场购买)、超净工作台、光照培养架、高压蒸汽灭菌锅、恒温振荡器、打孔器、小刀、培养皿、解剖刀、镊子、植物组培试剂盒。

3.实验方法与步骤3.1胡萝卜愈伤组织的诱导①外植体消毒用清水洗干净胡萝卜直根，用小刀给其削去表皮，并切成小段放入烧杯中。

先用70%酒精对胡萝卜直根消毒5min，用无菌吸水纸吸干，再用10%的次氯酸钠溶液消毒10min（或用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍，再用无菌水浸泡30min），放入无菌水中漂洗2~3次，用无菌吸水纸吸干待用。

②外植体接种。

把消毒好的胡萝卜直根放入无菌培养皿中，用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度1mm左右的小圆片，然后将小圆片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，再将形成层切成大约长5mm、宽5mm、高1mm的小长块(如图1a)。

植物细胞工程-胡萝卜的组织培养姓名：物理数学狂班级：生物技术综合班学号：2019004284【实验计划】1.MS培养基母液的配置与保存、MS固体培养基的配置（准备实验）2.外植体胡萝卜愈伤组织的诱导培养（2018.10.18）3.胡萝卜愈伤组织的继代培养（2018.11.8）4.胡萝卜愈伤组织悬浮培养（2018.11.22）5.胡萝卜愈伤组织诱导生根（2018.12.1）6.观察实验结果（2018.12.13）【实验时间】2018年10月18日-2018年12月13日实验（一）MS 培养基母液的配制与保存一、实验目的1.通过MS 培养基母液的配制，掌握配制培养基母液的基本技能；2.掌握培养基各种母液的保存方法。

二、实验原理1.MS 培养基的特点：①无机盐浓度高；②高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐；③含有一定的铵盐，营养丰富；④不需要添加更多的有机附加物。

MS 按照营养水平划分为基本培养基。

2.培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养物质，配置培养基时，为了减少试剂称取时的工作量出现的误差，以及多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，需要预先将各种营养成分配置为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到适合的浓度。

母液的浓度为培养基浓度的10倍、20倍、50倍、100倍等或更高。

3.需要时将配置好的母液按一定比例稀释到培养基指定浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调解物质等，制成符合要求的培养基。

三、器材与试剂1.器材：各类天平、磁力搅拌器、冰箱、烧杯、量筒、玻璃棒、试剂瓶、标签；2.试剂：95%酒精，0.1-1N NaOH ，0.1-1N HCl ，配制MS 培养基所需的各种无机物、有机物，蒸馏水。

四、方法步骤（一）母液的配制母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10—100倍。

优点：（1）保证各物质成分的准确性；（2）便于配置时快速移取；（3）便于低温保藏。

1.MS 大量元素母液（10×）称10升量溶解在1升蒸馏水中。

本科学生综合性实验报告
学号姓名
学院生命科学学院专业、班级
实验课程名称植物组培实验
教师及职称龙维彪（讲师）
开课学期2013 至2014 学年第二学期填写时间2014 年 4 月27 日
云南师范大学教务处编印
一．实验设计方案
胡萝卜愈伤组织的继代培养流程：
二、实验报告
胡萝卜愈伤组织诱导培养结果
总接种瓶数 5 总接种块数 16
污染瓶数 2 污染块数 5
未污染瓶数 3 未污染块数 11
未污染块中愈伤
组织发生块数
11 愈伤组织发生率 100％
愈伤组织发生情况记录愈伤组织呈淡黄色和黄色，发生在原胡萝卜块表面，总体发生的很好，很大很蓬松。

未污染3瓶都发生的很好。

一、实验目的1. 了解胡萝卜的植物学特征，包括根、茎、叶等器官的结构和功能。

2. 学习植物组织培养技术，掌握胡萝卜愈伤组织的诱导、继代增殖和细胞悬浮培养方法。

3. 了解胡萝卜细胞悬浮培养的遗传转化和抗性筛选技术。

二、实验材料与仪器1. 实验材料：胡萝卜种子、MS培养基、植物激素、抗生素等。

2. 实验仪器：超净工作台、显微镜、高压蒸汽灭菌器、培养箱、移液器、剪刀、镊子等。

三、实验方法1. 胡萝卜种子萌发实验（1）将胡萝卜种子用70%乙醇消毒30秒，再用无菌水清洗3次。

（2）将消毒后的种子播种于含有1/2MS培养基的发芽盒中，置于培养箱中，保持25℃、光照/黑暗各12小时。

（3）观察胡萝卜种子发芽过程，记录发芽率、发芽时间等数据。

2. 胡萝卜根、茎、叶结构观察实验（1）取胡萝卜根、茎、叶样本，用FAA固定液固定。

（2）制作切片，进行染色。

（3）观察显微镜下的胡萝卜根、茎、叶结构，记录观察结果。

3. 胡萝卜愈伤组织诱导实验（1）将胡萝卜根切成小块，用70%乙醇消毒30秒，再用无菌水清洗3次。

（2）将消毒后的胡萝卜根块接种于含有植物激素（如NAA、IBA）的MS培养基中。

（3）将培养皿置于培养箱中，保持25℃、光照/黑暗各12小时。

（4）观察愈伤组织形成过程，记录愈伤组织形成时间、愈伤组织颜色等数据。

4. 胡萝卜细胞悬浮培养实验（1）将愈伤组织剪碎，接种于含有植物激素（如NAA、IBA）的MS培养基中。

（2）将培养皿置于培养箱中，保持25℃、光照/黑暗各12小时。

（3）观察细胞悬浮培养过程，记录细胞悬浮培养时间、细胞悬浮培养密度等数据。

5. 胡萝卜遗传转化实验（1）将细胞悬浮培养物接种于含有遗传转化质粒的培养基中。

（2）将培养皿置于培养箱中，保持25℃、光照/黑暗各12小时。

（3）观察转化细胞生长情况，记录转化率。

6. 胡萝卜抗性筛选实验（1）将转化细胞接种于含有抗生素的培养基中。

（2）观察转化细胞在抗生素培养基中的生长情况，筛选出抗性细胞。

小新家里有些品相很好的胡萝卜，想大量繁殖，设计
实验
一．实验设计
实验序号实验一实验名称胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞悬
浮及体细胞胚胎发生培养实验
实验时间20XX年X月到X月实验室325
实验内容：
实验1—1MS培养基母液的配制与保存
实验1—2MS固体培养基配制
实验1—3胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养（初代培养）
实验1—4胡萝卜愈伤组织培养
实验1—5胡萝卜愈伤组织继代增殖培养
实验1—6胡萝卜细胞悬浮培养
实验1—7胡萝卜愈伤组织器官分化培养
一．实验目的
（1）：使学生能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂，巩固相关理论基础知识。

（2）：通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。

（3）：使同学能够熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，并且基本掌握愈伤组织的诱导培养。

（4）：使同学熟练掌握愈伤组织培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。

（5）：使同学熟练掌握愈伤组织继代增殖培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。

（6）：使同学熟练掌握胡萝卜细胞悬浮培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。

（7）：使同学了解胡萝卜愈伤组织器官分化培养的基本操作技术。

高中生物实验：胡萝卜的组织培养一、实验目的：胡萝卜是细胞和组织培养中常用的经典材料，是教学实验的良好材料。

通过本实验实训，要求学生熟悉胡萝卜离体根培养的基本方法和步骤，掌握愈伤组织诱导的基本技能。

二、实验原理：植物体的茎，根，叶细胞一般都具有全能性，在一定条件的营养和激素等条件下，可以脱分化形成愈伤组织。

将愈伤组织转接到含有不同激素成分的培养基上，就可以诱导其再分化生成胚状体或丛芽，进而发育成完整的小植株。

植物组织培养的全过程，证明了分化的植物细胞，仍具有形成完整植株所需要的全部基因。

三、实验用具：超净台解剖刀刮皮刀不锈钢打孔器培养皿温箱四、方法步骤：1. 将胡萝卜用自来水冲洗干净，用刮皮刀除去表皮1-2mm，横切成大约10mm厚的切片。

以下步骤均在无菌条件下进行。

2. 胡萝卜片经70%乙醇处理30秒钟后，用无菌水冲洗一遍，再用、2%的次氯酸钠溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗3~4次。

3. 将胡萝卜片放入培养皿中，一手用镊子固定胡萝卜片，一手用打孔器垂直打孔，每个小孔打在靠近维管形成层的区域，务必打穿组织。

然后从组织片中抽出打孔器，将胡萝卜组织片收集在装有无菌水的培养皿。

重复打孔步骤，直至收集到足够数量的组织圆片。

4. 用镊子取出组织圆片，放入培养皿中，用刀片将组织圆片切成2mm长的小块，放入装有无菌水的培养皿中。

在整个操作过程中镊子和解剖刀要多次火焰消毒，冷却后再使用。

5、将胡萝卜组织小块放到灭过菌的滤纸上，吸干水分后接种到培养基表面。

注意接种时培养瓶要有一定倾斜度，接种过程中镊子不要直接在培养基上方完成，以减少污染机会。

6、将培养物一部分置于25。

C温箱中暗培养，另一部分到光照培养室中进行培养，以比较光照和暗培养对愈伤组织诱导的反应。

验名称 胡萝卜的愈伤组织诱导培养 实验时间 4月至6月小组合作： 是○√ 否○一、实验预习 1、实验目的：1.1通过本次实验，能够熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。

1.2熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，同时能设计和配制胡萝卜伤组织增殖培养基。

1.3熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术；设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。

2、实验准备：2.1 MS 母液培养基的配置 主要实验用具和仪器：电子天平、烧杯、容量瓶、细口瓶、药勺、玻璃棒、电炉。

药品：NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、 MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、H 3BO 3、MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、Na 2MoO 4·2H 2O 、 CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、 Na 2-EDTA ·2H 2O 、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素 (维生素B1)、甘氨酸。

2.2胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配置 主要实验用具和仪器：冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口杯、精密pH 试纸（pH5.4~7.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、电炉、高压蒸汽灭菌锅等。

药品和试剂：MS 培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol ·L-1HCl 、1mol ·L-1NaOH2.3胡萝卜愈伤组织诱导 主要实验用具和仪器：100ml 三角瓶、500ml 搪瓷杯、25ml 量筒、10ml 和5ml 吸管、pH 试纸（5.4~7.0）、封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯等。