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DNA重组技术的基本工具PPT

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1.1DNA重组技术的基本工具 公开课课件

1.1DNA重组技术的基本工具 公开课课件
亲，你还记 得我吗？
磷酸二酯键
氢键
G
A A C T T A A G
T
T C
G
C
基因工程的概念
指按照人们的愿望,进行严格的设计 并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋 予生物以新的遗传特性,创造出更符合人 们需要的新的生物类型和生物产品。由于 基因工程是在DNA分子水平上进行设计和 施工的，因此又叫作DNA重组技术或基因 拼接技术。
寻根问底：
DNA连接酶与DNA聚合酶的区别
DNA连接酶 DNA聚合酶
对象
不需要模板 连接DNA片段
以一条DNA链为 模板，连接单个 核苷酸
作用
都是形成磷酸二酯键
三、分子运输车—基因进入受体细胞的载体
将目的基因送入受体细胞、并带动目的基因复制 作用： 必须具备的条件：
• 在受体细胞中能自我复制并稳定保存 • 有一至多个酶切割位点，而且每种酶切位 点最好只有一个 • 有标记基因，便于筛选（抗生素抗性基因、 产物具有颜色反应的基因等） • 对受体细胞无害
4.下列四条DNA分子，彼此间具有黏性末端的 一组是（ D ）
A．①②
B．②③ C．③④
D．②④
5．实施基因工程第一步的一种方法是把所需的基因从 供体细胞内分离出来，这要利用限性内切酶。一种限制 性内切酶能识别DNA子中的GAATTC顺序，切点在G和 A之间，这是应用了酶的（ B ） A．高效性 B.专一性 C．多样性 D.催化活性受外界条件影响 6．人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗 性基因，该抗性基因的主要作用是（ B ） A．提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B．有利于对目的基因是否导入进行检测 C．增加质粒分子的分子量 D．便于与外源基因连接
GAA T T C C T T AAG

重组DNA技术的基本工具课件-高二生物人教版选择性必修3

重组DNA技术的基本工具课件-高二生物人教版选择性必修3
➢连接平末端：
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
➢几种相关酶的比较
名称 限制酶
作用部位 磷酸二酯键
作用结果 将DNA切成两个片段
DNA(水解)酶 磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
DNA连接酶
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶
磷酸二酯键
功能 只能将具有互补__黏__性__末__端____的 “缝合”__两__种__末端，但连接
特性 DNA片段连接起来
__平ห้องสมุดไป่ตู้_末__端___之间的效率相对较低
相同点
都恢复被限制酶切开的___磷__酸__二__酯__键____。
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
➢连接黏性末端：
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
过程演示：
重组DNA分子
5′ …ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC… 3′ 3′ …TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG… 5′
5′ …TCCTAGAATTCTCGGTATG AATTCCATAC… 3′ 3′ …AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG… 5′
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入 塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
析出DNA
DNA的粗提取与鉴定
3.方法步骤
（4）DNA的鉴定： 将丝状物或沉淀物溶于2mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂， 混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
对照组
实验组
水浴加热
思考1：如何评价结果？ DNA纯度： 看提取物颜色 DNA的量： 看与二苯胺反应颜色的深浅

高中生物选修3专题1第1节dna重组技术的基本工具_3

高中生物选修3专题1第1节dna重组技术的基本工具_3

平末端
当限制酶从识别序列的中心轴线处切 开时，切开的DNA两条单链的切口，是平 整的，这样的切口叫平末端。
（一）、限制性核酸内切酶
1、来源：原核生物 2、种类：约4000种 3、特点：专一性 4、切割位点：磷酸二酯键 5、形成末端：黏性末端、平末端
？
寻根问底：根据你掌握的知识， 你能推测这类酶存在于原核生 物中的作用是什么吗
专题一 基因工程
回顾： 基因工程的概念：
优点又：叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通 俗定的向说地，改就造是生按物照的人遗们传的性意状愿；，把一种生物 的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后 放实到现另基一因种在生不物同的物细种胞之里间，的定转向移地，改迅造速生培物育 的出遗生传物性新状品。种
基因重组 生物体外
工 欲 善 其必 事先
利 其 器
二、DNA重组技术的基本工具
• 准确切割DNA的工具（“分子手术刀”） ——限制性核酸内切酶 （限制酶）
• DNA片段的连接工具（“分子缝合针”） ——DNA连接酶
• 基因转移工具（“分子运输车”） ——运载体
（一）、限制性核酸内切酶
限制性内切酶从哪里寻找？
1、来源：原核生物 2、种类：约4000种
（二）、DNA链接酶
DNA连接酶链接的是什么
磷酸二酯键
磷酸二酯键
（二）、DNA链接酶
E·coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”
起来，但效率较低
T4DNA连接酶
形成磷酸二酯键
（三）、运载体
1、作用：将目的基因导入受体细胞

1.1 DNA重组技术的基本工具0

1.1 DNA重组技术的基本工具0

切割位点：磷酸二酯键
举 例：EcoRI限制酶能识别 GAATTC序列，并在G和A 之间切开 结果：形成两种末端
限制性内切酶
限制 酶
黏性末端和平末端
限制酶在原核生物中有什么作用？
• 限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA 侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保而达到保护自 身的目的。 • 限制酶不会将自己的DNA 切割吗？ • 含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具 备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化 酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶 不能将其切开。
1.1 DNA重组技术的基本工具
高二生物组
DNA重组技术的基本工具
• 限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
• DNA连接酶——“分子缝合针”
• 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
分布：主要在原核生物中 作用特点：特异性，即识别特定核 苷酸序列，切割特定的两个 核苷酸之间的磷酸二酯键。
• DNA连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？
议一议
1、从化学组成来看，载体应含有什么成分？ 双链DNA 2、能否用SARS病毒作为基因载体？ 不能 3、作为载体，若没有切割位点将怎样？ 不能进行DNA的重组 4、携带目的基因的载体是否进入了受体细胞， 如何鉴定？ 载体上应有标记基因 5、假如目的基因导入受体细胞后不能复制， 将怎样？ 可能造成基因丢失
DNA连接酶——“分子缝合针”
• 种类：两种：
一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。 一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。
• 特点：
E·coli连接酶只能连接黏性末端；
T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。

人教版教学课件湖南省安仁一中生物必修三《11dna重组技术的基本工具》课件

人教版教学课件湖南省安仁一中生物必修三《11dna重组技术的基本工具》课件

5、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段， 试分析： ①GC… ②AATTC… CG… G… ③ …GC ④ …CTTAA …CG …G ⑴其中①和 ③ 是由一种限制酶切割形成的 平 末端，两者要重组成一个DNA 分子， 所用DNA连接酶通常是T4 DNA连接酶 。 ⑵ ② 和 ④ 是由另一种限制酶切割形成的 黏性 末端，两者要形成重组DNA片段， coli DNA连接酶 。 所用的连接酶通常是 E·
• 什么叫黏性末端？ 当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开 时，被限制酶切开的DNA两条单链的切口， 带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补 配对，这样的切口叫黏性末端。
什么叫平末端？
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时， 切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样 的切口叫平末端。
思考
为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？
P
G
即脱氧核糖、磷酸基之间的连接 P
A
DNA聚合酶
DNA连接酶
连接DNA链 双 链
DNA聚合酶
单 链
连接部位
将单个核苷酸加 到已存在的核酸 在两DNA片段之 片段的3’末端的 间形成磷酸二酯 羟基上，形成磷 键 酸二酯键
限制酶切割后有两种不同的结果，一 种产生黏性末端，一种产生平末端。那么 恢复它们的连接时，所用DNA连接酶是 否可以不加选择？
一、限制性核酸内切酶 ——“分子手术刀” 1、来源：主要从原核生物中分离纯化出来 2、种类：约4000种 3、作用:
限制性核酸内切酶能识别双链DNA分子的某种特 定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个
核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
思考：
限制酶切割DNA后形成的末
端——黏性末端、平末端是如 何形成的？

1.1 DNA重组技术的基本工具

1.1 DNA重组技术的基本工具

A、Sma1酶切
B、EcoR1酶切
C、BamH1和Hind3双酶切
C更合理。可以避免目的基因和质粒自身环化， 避免目的基因和质粒反向连接。
小结
基因工程 的工具
限制酶
主要存在于原核生物中 具有专一性(识别序列) 切开DNA分子的磷酸二酯键
DNA连 接酶
连接磷酸二酯键
种类
E.coliDNA连接酶 T4 DNA连接酶
基因工程的概念
基因工程的别名
DNA重组技术
操作环境 操作水平 基本过程
原理 结果
生物体外 DNA分子水平
剪切→ 拼接 → 导入 → 表达 基因重组
定向地改造生物的遗传性状， 获得人类所需要的产品。
1.1 DNA重组技术的基本工具
基因的剪刀——限制酶 基因的针线——DNA连接酶 基因的运载工具——运载体
黏性末端
G
AA T T C
C TTAA
G
黏性末端
G AAT T C C TTAAG
重组DNA分子
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
G
A ATT
CT T A A
G
三.分子运输车——运载体
运载体应该具备什么样的条件？
1.能够在宿主细胞中 复制并稳定地保存。
2.具多个限制酶切点， 以便与外源基因连 接。
3.具有某些标记基因， 便于进行鉴定和筛 选。
常用的运载体：质粒、λ噬菌体的衍 生物、动植物病毒
质粒
实际上在基因工程操作中，真正被用作载 体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行 过人工改造的。
表达载体
小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRⅠ 、BamHⅠ的酶切位点，ampR为青霉素抗 性基因。tetR为四环素抗性基因，P为启动 子，T为终止子，ori为复制原点。

DNA重组技术的基本工具

DNA重组技术的基本工具

DNA聚合酶
DNA连接酶
区别1
1)只能将单个核苷酸连 1)在两个DNA片段之 接到已有的核酸片段上，间形成磷酸二酯键
形成磷酸二酯键
2)以一条DNA链为模板，2)将DNA双链上的两 区别2 将单个核苷酸通过磷酸 个缺口同时连接起来，
二酯键连接成一条互补 不需要模板 的DNA链
相同点
形成磷酸二酯键
Go on
将不同种来源的DNA片段连接起来
Go back
二、“分子缝合针” —— DNA连接酶 ①作用:
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA， 即将脱氧核糖和磷酸连接起来.
②作用原理：
催化磷酸二酯键形成
E·coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
生物A基因片段
……GAATTC…… ……CTTAAG……
生物B基因片段
……GAATTC…… ……CTTAAG……
EcoRⅠ 酶切
……G AATTC…… ……CTTAA G……
……G AATTC…… ……CTTAA G……
不同来源的DNA片段混合
……GAATTC…… ……CTTAAG……
……GAATTC…… ……CTTAAG……
⑴细菌的质粒
⑵噬菌体或某些动植物病毒
质粒是基因工程最惯用的载体。 质粒是一种裸露的、构造简朴、独 立于细菌染色体（即拟核DNA）之外， 并且含有自我复制能力的双链环状 DNA分子。
最惯用的质粒是大肠杆菌的质粒， 其中常含有抗药基因，如四环素的 标记基因。质粒的存在与否对受体 细胞生存没有决定性作用，但复制 只能在受体细胞内完毕。
磷酸二 酯键

3.1.1 DNA重组技术的基本工具

3.1.1 DNA重组技术的基本工具
磷酸 T4DNA连接酶 DNA连接酶
能连接黏性末端 能连接黏性末端和 黏性末端和 T4噬菌体 二酯键 平末端(效率较低) 平末端(效率较低)
分子运输车” 三、基因的运载体——“分子运输车” 基因的运载体 分子运输车
分子运输车” 三、基因的运载体——“分子运输车” 基因的运载体 分子运输车
载体需要的条件： ⒈载体需要的条件： ⑴有1-多个限制酶切点 ⑵对受体细胞无害 导入基因能在受体细胞中复制 能在受体细胞中复制、 ⑶导入基因能在受体细胞中复制、表达 有某些标记基因， ⑷有某些标记基因，便于筛选 常用运载体： ⒉常用运载体： ⑴细菌的质粒 ⑵λ噬菌体衍生物或某些动植物病毒
1.1 DNA重组技术的基本工具 重组技术的基本工具 重组技术
基因工程
提取目的基因 目的基因与运 载体结合 目的基因导入 受体细胞 目的基因的检 测与鉴定
1.1 DNA重组技术的基本工具 重组技术的基本工具
基因的“剪刀” 基因的“剪刀”——限制性核酸内切 限制性核酸内切 酶 基因的“针线” 基因的“针线”—— DNA连接酶 连接酶 基因的运载体
• 常用的载体：质粒 常用的载体：
重组DNA分子： 重组DNA分子： DNA分子 启动子 终止子 目的基因 标记基因
有切 割位 点 能复制并带着 插入的目的基 因一起复制
有标记 基因的 存在， 存在， 可用含 氨苄青 霉素的 培养基 鉴别
注意： 注意：真正用作运载体的质粒都是人 工改造过的。 工改造过的。
不需要模板
连接酶——“分子缝合针” 分子缝合针” 二、DNA连接酶 连接酶 分子缝合针
1、种类： 种类：
E·coli DNA连接酶 coli DNA连接酶 DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 功能 相同点 差别 只能连接黏性末端 只能连接黏性末端

3-1重组DNA技术的基本工具(教学课件)高中生物人教版 (2019)选择性必修3

3-1重组DNA技术的基本工具(教学课件)高中生物人教版 (2019)选择性必修3
之间的磷酸二酯键 。
两DNA片段要具 有相同且互补的 黏性末端才能拼 起来
注意：用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键 基因工程 不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
02 “分子缝合针”----DNA连接酶
2. 种类： ①E.coli DNA连接酶
• 从大肠杆菌中分离得到 • 只能连接互补黏性末端
识别序列 GAATTC
【反馈练习】
①…CTGCA …G
A. ①③；②④
②…G …CTTAA
③ G… ACGTC…
④ AATTC… G…
B. ①②；③④ C. ①④；②③ D.以上都不对
缺口怎么办？
02 “分子缝合针”----DNA连接酶 1. 作用：将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸
3’
5’
01 “分子手术刀”----限制性内切核酸酶（限制酶）
读：5’→ 3’
仔列4细 有. 识观何别察 特序点左列？侧特四点种：限制酶识别的特定序
①大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸 组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个 或其他数量的核苷酸组成。
EcoRⅠ 5’……G-A-A-T-T-C……3’ 3’……C-T-T-A-A-G……
2）分类：E.Coli DNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？） 3.“分子运输车”—— 载体
1）作用：将外源基因送入受体细胞
2）种类：质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒
3）应具备条件： ①有一个至多个限制酶切割位点 ——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
✭真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒 的基础上进行过人工改造的。

DNA重组技术的基本工具课件

DNA重组技术的基本工具课件

目 开
①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后形成的黏性末端。
关 ②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末
端。
③在 DNA 连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形
成的黏性末端能否连接起来？为什么？
学习·探究区
解析 一般来说，一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核 苷酸序列，并在特定的切割位点切割 DNA，限制酶Ⅰ切割质粒的 过程为：
时 栏
DNA 上的碱基是反向对称重复排列的。
目
开
关如
以中心线为轴，两侧碱基互补对称；
以 为轴，两侧碱基互补对称。
学习·探究区
③结果：经限制酶切割产生的 DNA 片断末端通常有两种形 式：__黏__性__末__端___和__平__末__端__。 a．_黏__性__末__端___
本
课 是限制性核酸内切酶在识别序列的_中__心__轴__线__两__侧___将 DNA
学习·探究区
第1课时
探究点一 基因工程的概念及工具酶
本 1．基因工程的概念
课 时
“工欲善其事，必先利其器”。我国拥有自主知识产权
栏 目
的转基因抗虫棉，就是通过精心设计，用“分子工具”
开 关
构建成的。培育抗虫棉首先要在体外对含有抗虫基因的
DNA 分子进行“切割”、改造、修饰和“拼接”，然后，
导入棉花体细胞内，并使重组 DNA 在细胞中表达。
学习·探究区
由上述资料填写下表，理解基因工程的概念。
通过体外_D_N__A_重___组___和_转__基__因__等技术，
手段
本
赋予生物以新的_遗__传__特__性___
课 时 栏 目
目的
按照人们的愿望，创造出更符合人们需要 的新的_生__物__类__型__和_生__物__产__品__

重组DNA技术的基本工具-高二生物课件(人教版2019选择性必修3)

重组DNA技术的基本工具-高二生物课件(人教版2019选择性必修3)
就是按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的 遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品， 从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设 计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。
1.原理： 基因重组 2.操作水平： 分子水平
3.结果：
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们 需要的新的生物类型和生物制品
限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
二 限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1、来源：主要从原核生物中分离纯化来的 2、种类：数千种 3、特点 : 能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并
使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
4、识别序列长度 : 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组 成，少数4个、8个或其他数量
四 基因导入受体细胞的载体——“分子运输车”
真正被用作载体的质粒，都是在天然 质粒的基础上进行过人工改造的。
大肠杆菌及质粒结构模式图
实例： 重组DNA分子的模拟操作
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
GCCGTATG…
… TCCTAG AATTCTCGGTATG AATTCCATAC … … AGGATCTTAA GAGCCATACTTAA GGTATG …
普通棉花不抗虫，苏云芽孢杆菌可以合成抗虫毒素——Bt毒蛋 白，请思考如何生产抗虫棉？
杂交育种？诱变育种？等技术能否实现？为什么？
杂交育种：同种生物之间进行； 诱变育种：在原有基因基础上发生基因突变，结果产生新的等位基因 （不定向）
克服远缘杂交不亲和的障碍；定向改造生物性状
一 基因工程
思考：能否将苏云金杆菌的“抗虫基因”导入棉花细胞，使棉花自 身产生抗虫蛋白来抵抗棉铃虫呢？

DNA重组技术的基本工具PPT课件

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随堂达标检测
活页规范训练
基因工程的工具酶
1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
(1)来源
主要来自于 原核生物
。
(2)特点
① 识 别 双 链 DN特A 定核分苷酸子 的 某 种
序列；
磷酸二酯键
②使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的
断裂。
(3)作用结果
中心轴线两侧
①黏性末端：在所识别序列的
将
DNA的两条链分别切开时形成中的心末轴端线。
课堂互动探究
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随堂达标检测
活页规范训练
基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车”
1．载体的种类有 质粒 λ噬、菌体
动植的物衍病生毒物、
等。
2．常用载体——质粒
(1)质粒是一种自裸我露复的制、结构简单双、链独环立状于DN细A 菌拟核DNA之外，
并具有
限制酶切割 能 力 的
分子外。源
(2)质粒DNA分子上有标一记至基多因个
随堂达标检测
活页规范训练
A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割 B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割 C．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割 D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 思维导图：
课堂互动探究
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随堂达标检测
活页规范训练
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2024/10/15
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3．载体的种类 (1)细菌质粒，它是细菌拟核DNA以外的小型双链环状DNA，有 的细菌只有一个，有的细菌有多个。 (2)λ噬菌体的衍生物和某些动植物病毒的DNA。 一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人 们根据不同的目的和需求，对某些天然的载体进行人工改造。

1.1DNA重组技术的基本工具

1.1DNA重组技术的基本工具

运载体必须具备什么条件？
5、运载体DNA分子大小应适合，以便提取 和在体外进行操作，太大就不便操作。
P7：3、天然DNA分子可以直接 用作基因工程运载体吗？ 自然存在的质粒DNA分子并不完全具 备上述条件，往往都要进行人工改造 后才能用于基因工程操作。
运载体存在于许多细菌和酵母菌中，作为运载体几个条 件的具体表现： 最常用的是大肠杆菌的质粒。 独立于细菌拟核DNA之外 1、复制原点： 的一种可以自我复制、 说明能复制并能带着 双链闭环的裸露DNA分子
限制酶作用过程：
注意观察限制酶切割的部位
重播
限制酶的切点：

磷酸二酯键
磷酸和脱氧 核糖之间的 化学键
磷 酸 二 酯 键
根据限制酶作用特点分析：
P7：2、原核生物限制酶为什么不剪
切本身的DNA？
原核生物本身的DNA分子中一般不 具备这种限制酶的识别切割序列。
限制酶所识别的序列有什么特点
大多数由6个核苷酸组成，少数4、5或8个。 呈碱基互补对称，无论是奇数个还是偶数个碱 基，都可以找到一条中轴线，其两侧的双链 DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
GAA TTC CTT AAG
CCAGG GGTCC
中轴线两侧分别切开
（大肠杆菌)
黏性末端
(粘质沙雷氏菌)
序列中轴线处切开
平末端
将切下来DNA片段拼接成新的DNA分子， 可用什么酶？
二、DNA连接酶——”分子缝合针 “
DNA连接酶的作用过程
探讨1：DNA连接酶连接的是什么部位？
限制酶切割后有两种结果：黏性末 端或平末端。恢复它们的连接时， 所用DNA连接酶是否可以不加选择？
”
一、限制酶——”分子手术刀 “
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利用图解限制酶的识别序列由 6 个核苷酸组成，例
如EcoRI、Sma I限制酶的识别序列，也有少数限
制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。 2 ．限制酶都是切割识别特定的核苷酸序列的两 个核苷酸之间的磷酸二酯键。
3．限制酶切出的黏性末端和平末端的区别：
例1 (2011年雅礼中学高二检测)基因工程中，须使
用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和
筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是－
G↓GATCC －，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是－
↓GATC－。根据图示判断下列操作正确的是(
)
A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割 B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割 C ．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ
思考感悟
限制酶和DNA连接酶作用的位点相同吗？
【提示】
相同。都是磷酸二酯键。
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1载体 的种类 ①质粒：是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核 DNA之外，并具有自我复制 _________能力的双链环状DNA 分子 ②λ噬菌体的衍生物 ③动植物病毒
2．DNA连接酶——“分子缝合针” (1)作用：将双链DNA片段缝合起来，恢复被限制酶 磷酸二酯键 。 切开的两个核苷酸之间的___________ (2)种类
黏性 ①E.coliDNA 连接酶：只能缝合双链 DNA 的 ______
末端 。 _______ ②T4DNA连接酶：既可缝合双链DNA的黏性末端， 平末端 。 又可缝合双链DNA的________
哪种类型的末端？
【提示】
黏性末端。
(1)限制性核酸内切酶是一类酶而不
【易误警示】
是一种酶。
(2)限制性核酸内切酶作用的化学键为磷酸二酯键， 而不是氢键。 (3)不同种类的限制性核酸内切酶识别与切割的位点 不同，这与酶的专一性是一致的。
与DNA有关的各种酶比较
名称 作用 参与生理 作用位 过程应用 点(如图) a
DNA复制及 转录 逆转录、基 因工程
b
特别提醒
①DNA 连接酶和 DNA 聚合酶都是形成
磷酸二酯键，而不是氢键，氢键是分子间的静电
吸引力，不需通过酶催化形成。②DNA 连接酶只
能在两个 DNA 片段间形成磷酸二酯键，而 DNA 聚 合酶只能将单个核苷酸加到已有 DNA 片段上，且 需要以一条 DNA链为模板。③目前发现的 DNA 连 接酶不具有连接单链DNA的能力。
因构成与人类相似 ) 进行了一系列
实验。为了了解外源基因是否可
以安全地移植到猫科动物的基因序列中，该研究
中心利用基因工程技术培育出美国首只转基因夜
光猫。紫外线灯光下夜光猫的眼睛、牙床和舌头
会发出鲜艳的橙黄色的荧光。夜光猫的培育施工 是在DNA分子水平上进行的，在微小的DNA分 子上进行的操作，需要专门的工具。这些工具是 什么？各自的作用是什么？让我们一起来了解一
例2
【解析】
在 DNA 重组技术中，两个 DNA 片段间
必须有相同的黏性末端才能互补配对，进行结合；
具有相同黏性末端的 DNA 分子连接时， DNA 连接 酶的作用是催化脱氧核苷酸链的脱氧核糖与磷酸之 间磷酸二酯键的形成，即把“梯子”的“扶手”缝 合起来。
1．1 DNA重组技术的基本工具
课标领航 1．了解限制酶及DNA连接酶的来源。 2．掌握限制酶及DNA连接酶的作用。
3．理解载体需具备的条件。
【重点】 三种工具的作用。
【难点】
黏性末端和平末端；载体的特点。
情景导航
转基因夜光猫
美国新奥尔良奥德班濒危物种研
究中心为探索一些人类疾病的治
疗方法，以猫为实验对象 ( 猫的基
切割
D ．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ
切割
【尝试解答】 D
【解析】
首先把目的基因切下来要用到限制酶
Ⅱ；如果再用限制酶Ⅱ切割质粒，则 2 个标记基因
都被切开，标记基因将失去作用。而用限制酶Ⅰ切
割质粒可保留一个标记基因，而产生的黏性末端和
限制酶Ⅱ切割下来的目的基因可以互补配对。
【互动探究】 上题中限制酶Ⅰ切开化学键后产生
2质粒 载体的 特点 ①能够在细胞内自我复制 限制酶切割位点 ，便于供外源DNA ②具有一个或多个__________________ 插入 ③具有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择 (3)质粒载体的处理：真正用作载体的质粒，都必须在细胞外 经人工改造。
核心要点突破
DNA连 连接两个DNA片段 接酶 限制性 切割某种特定的脱 内切酶 氧核苷酸序列 在脱氧核苷酸链上 DNA聚 添加单个脱氧核苷 合酶 酸
基因工程 a
DNA复制 a
名称
作用
参与生理过 作用位点 (如图) 程应用 转录 a
在核苷酸链上 RNA聚 添加单个核苷 合酶 酸
使碱基间氢键 解旋酶 断裂形成单脱 氧核苷酸链 逆转 录酶 以RNA为模板 合成DNA
(2011年北大附中高二检测)下列关于DNA连 接酶的叙述正确的是( ) ①催化相同黏性末端的DNA片段之间的连接 ②催化不同黏性末端的DNA片段之间的连接 ③催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成 ④催化 DNA分子两条链的脱氧核糖与磷酸之间磷 酸二酯键的形成 A．①③ B．②④ C．②③ D．①④ 【尝试解答】 D
6．结果：人类需要的新的生物类型和生物产品。
1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
原核 生物。 (1)主要来源：______ 核苷酸序列 ①能够识别DNA特定的____________ (2)特点： 磷酸二酯键 ②切开两个核苷酸之间的____________
(3)DNA 末端：限制性核酸内切酶切割 DNA 产生的 黏性末端 和平末端 DNA 末端有两种形式为__________ _______。
下吧！
1． 1 基础自主梳理 DNA 重 组 技 术 的 基 本 工
核心要点突破
知能过关演练
基础自主梳理
一、基因工程的概念 1．基因工程的别名：DNA重组技术。
2．操作环境：生物体外。
基因 。 3．操作对象：______ DNA分子水平 。 4．操作水平：_______________
剪切→拼接→导入→表达 。 5．基本过程：________________________