几丁质酶在植物抗真菌病害中的作用

几丁质酶在植物病害生物防治中的应用摘要主要对几丁质酶的特性、功能及其在植物真菌病害防治中的应用进行了综合论述。

在此基础上,对几丁质酶在植物病害生物防治中的应用前景进行了展望。

关键词几丁质酶;生物防治;植物病害;应用ApplicationofChitinasesonBiocontrolofPlantDiseasesXU Meng-qiuZHONG Zeng-mingGONG YanXIE Xiang-ming *(College of Life Science and Technology,Beijing Forestry University,Beijing 100083)AbstractIn this paper,characteristic,function and prevent plant diseases of chitinase were summarized. On this basis,the prospects of chitinase applications in biocontrol of plant disease were promised.Key wordschitinase;biocontrol;plant diseases;application几丁质酶广泛存在于各种植物、动物及微生物细胞和组织中,参与多种生理过程[1]。

几丁质酶可以有效降解几丁质,在自然界的物质循环中起着不可替代的作用。

几丁质是构成大多数真菌细胞壁的主要成分,在自然界中存在数量巨大,它能在几丁质酶系作用下被分解成N-乙酰氨基葡萄单糖(NAG)。

在环境保护、医药、食品和基础生命科学研究中具有巨大的潜在应用价值[1]。

在目前的研究中,将细菌及植物几丁质酶基因转入烟草、番茄、大豆、马铃薯、莴苣和甜菜等植物中,获得的转基因植物高效表达几丁质酶的生物活性,可显著抵抗真菌病害[2],此外将几丁质酶基因转入生防真菌中,也能显著提高生防真菌拮抗植物病害的能力[3]。

生物防治几丁质、壳聚糖在植物保护 中的研究与应用进展赵 蕾 汪天虹(山东省科学院生物研究所 济南 250014) (山东大学微生物技术国家重点实验室)几丁质(chitin),又称甲壳素,广泛分布于于虾蟹壳、软体动物的外壳与内骨骼,节肢动物的外骨骼及真菌、酵母菌等微生物细胞壁中。

与植物的纤维素一样,具有保护及支持生物体的作用。

壳聚糖(chitosan),又称几丁聚糖,是几丁质经脱乙酰作用而得到的一种氨基多糖,存在于某些生物体内,特别是真菌的细胞壁上。

近年来,对这类在自然界含量仅次于纤维素的几丁质和壳聚糖的研究与应用日益扩大,本文介绍其在植物保护中的应用潜力。

1 几丁质与壳聚糖的特性几丁质是一种构造类似于纤维素的直链聚合物,约由1000~3000个N -乙酰葡萄糖胺单体以B -1,4键构成的高分子糖类聚合物,其中约每6个N -乙酰葡萄糖胺连接一个葡萄糖胺[1]。

几丁质在生物体中以对称同向或反向非平行的糖链以氢键结合而成。

由于氢键结构十分强固,使得几丁质在物理性质和化学性质上较其它多糖类具有更高的稳定性。

对一般溶剂抗性大,只溶于强无机酸、氟化醇及含有5%氯化锂的N,N .-二甲基乙酰胺中。

壳聚糖为几丁质经去乙酰作用后失去乙酰基产物的总称,去乙酰程度为65%~99%,一般以70%~80%最常见。

分子特性为可生物分解,溶于10%的己二酸、醋酸、甲酸、乳酸、苹果酸、丙酸和琥珀酸等。

其中以甲酸为最好溶剂,在无机酸中的溶解度则相当有限。

几丁质与壳聚糖的化学结构式见图1。

2 几丁质与壳聚糖诱发植物防御机理分析几丁质与壳聚糖在植物保护中的作用正在引起有关方面的重视。

其诱发植物防御系统的机理是,病原菌入侵植物时,植物本身即有辨认系统,能识别病菌入侵。

而病菌细胞壁上的几丁质即扮演被辨认的角色,使被侵染植株中原本低量而具活性的几丁质酶大大提高,以分解入侵病菌细胞壁上的几丁质。

植株内产生的几丁质寡糖活化植物细胞膜上的蛋白质激发酶,使细胞内的酶产生磷酸化反应提高酶的活性,启动植物的防御系统并产生植物干扰素、酚类复合物等抗病物质,对病原菌产生抑制作用,这些反应均在数小时内完成。

1.3基因工程的应用基础巩固1转基因动物是指( )A.提供基因的动物B.基因组成中转入了外源基因的动物C.能产生白蛋白的动物D.能表达基因遗传信息的动物2若利用基因工程技术培育能固氮的水稻新品种,其在环境保护上的重要意义是( )A.减少氮肥使用量,降低生产成本B.减少氮肥生产量,节约能源C.避免因施用氮肥过多引起的环境污染D.改良土壤的群落结构、海华水”,化引起淡水“赤洋,污染环境。

利用现象”“潮基因工程技术培育能固氮的水稻新品种,可减少氮肥施用量,避免水体富营养化,保护环境。

3下列哪项不是植物基因工程技术的主要应用?( )A.提高农作物的抗逆性B.生产某些天然药物C.改良农作物的品质D.作器官移植的供体项为动物基因工程技术的重要应用。

4基因治疗是指( )A.把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中,达到治疗疾病的目的B.对有基因缺陷的细胞进行修复,从而使其恢复正常,达到治疗疾病的目的C.运用人工诱变的方法,使有基因缺陷的细胞发生基因突变后恢复正常D.运用基因工程技术,把有缺陷的基因切除,达到治疗疾病的目的疗,其基本方法都是把相应的正常基因导入有基因缺陷的相关细胞中,从而使病人恢复正常。

5科学家运用转基因技术,将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因转到大白菜细胞中,培育出抗虫效果很好的优质大白菜,减少了农药的使用量,保护了环境。

下列说法正确的是( )A.抗虫基因中含有终止密码子B.抗虫基因能在大白菜细胞中正常表达C.转基因技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体D.限制酶识别的序列一定是GAATTC于终止密码子存在,子mRN不同的限制酶识别的序A,上。

载体不是酶。

限制酶有多种列大都不相同。

6以下关于抗病转基因植物成功表达抗病毒基因后的说法,正确的是( )A.可以抵抗所有病毒B.对病毒的抗性具有局限性或特异性C.可以抵抗害虫D.可以稳定遗传,不会变异,毒并不是所有病,也不可以抗虫。

抗病毒基因也会发生变异。

毒7下列不属于利用基因工程技术制取药物的是( )A.从大肠杆菌体内获取白细胞介素B.从酵母菌体内获得干扰素C.利用青霉菌获取青霉素D.从大肠杆菌体内获得胰岛素等如大肠杆菌、酵母菌(胞)中并使,该基因得到高效表达以产生药物,然后通过培养微生物来获得药物的一种技术。

Food Science And Technology And Economy粮食科技与经济2023 年4月第48卷 第2期Apr. 2023Vol.48, No.4随着世界人口的日益增长，粮食的需求量随之上升，导致农作物在全球的种植面积需求越来越大，而农作物病虫害的发生是造成农作物产量和质量降低的最主要因素，每年因病虫害造成粮食（农作物）减产20％～40％，直接损失超过2 000亿美元[1]。

目前在病虫害防治方面，主要还是依靠化学防治的方式和手段[2]，然而过度依赖化学防治方式会造成环境生态污染。

为了生态环境的可持续发展，降低化学试剂对土壤环境的影响，生物技术在农业建设过程中的应用逐渐被重视。

将生物技术应用于农业病虫害防治中，能够有效减少传统的化学农药防治方法给环境带来的负面影响，推动绿色农业的可持续发展[3]，而几丁质酶在农作物生物防治方面具有巨大的潜在应用价值。

几丁质酶（Chitinase, EC 3.2.1.14）是水解几丁质的酶，能够催化几丁质的β-1,4-糖苷键，将其降解成N -乙酰葡糖胺（N -actyl glucosamine, NAG ），并能由各种微生物，包括病毒、细菌和真菌，以及昆虫、高等植物和动物合成[4]。

几丁质由β-1,4-糖苷键将N -乙酰-D -氨基葡萄糖（Be -ta -1,4-linked Repeating N-acetylaminoglucose Units, GlcNAc ）分子连接而成，以结构多糖的形式存在于真菌细胞壁、节肢动物的外骨骼、甲壳纲动物的外壳以及寄生线虫的外壳中，但尚未在植物体内鉴定出几丁质的存在[5]。

几丁质酶能够通过降解真菌性病毒细胞壁中的几丁质和破坏昆虫及线虫的消化膜等方式达到抗病虫害的效果，且不会对植物体产生伤害。

同时，几丁质酶也是植物防御系统中重要的防卫因子，可以增强植物的防御系统，在抵御病原真菌以及病虫害中发挥着重要作用[6]。

几丁质酶(chitinase)是以几丁质(chitin)为作用底物的水解酶。

几丁质又称甲壳素或甲壳质,存在于节肢动物、线虫和软体动物的体壁、真菌细胞壁(除卵菌)和一些藻类等生物的细胞壁中。

在昆虫中,几丁质是围食膜及体壁的主要组成成分之一,通过几丁质酶对其有规律地降解以保证昆虫正常生长发育。

如果编码该酶的基因在不适当的时候表达或该表达时未表达,都会对昆虫造成伤害。

由于植物中不含几丁质,因此在植物害虫防治中,昆虫几丁质是几丁质酶的一个极具吸引力的作用靶标。

一、昆虫几丁质酶生物化学与生理作用昆虫几丁质酶存在于中肠、蜕皮腺及某些昆虫的毒腺中,是一种糖蛋白,可以水解昆虫体壁和中肠中的几丁质,酶切位点通常随机发生在链中间的任何一个部位,其最终产物是可溶低分子量的GlcNAC寡聚物。

昆虫蜕皮时约有90%的几丁质被降解,几丁质酶和几丁质之间的作用是一种动态过程,包括经过几丁质结合区(CBD)的吸附过程、水解过程、解吸附作用及活性催化区在作用底物表面的配置过程。

昆虫几丁质酶除能降解几丁质外,还担负许多重要生理功能,如昆虫肠道组织中的几丁质酶具有分解肠内和围食膜的几丁质和消化作用。

昆虫几丁质酶分泌到肠道中,以无活性酶原形式存在,在需要时被胰蛋白酶激活而降解围食膜。

蜕皮腺中的几丁质酶可以调节昆虫在生长发育中周期性蜕皮并合成新表皮。

毒腺中的几丁质酶有助于毒腺物质在取食对象的组织中扩散渗透。

二、昆虫几丁质酶分子特征1993年,编码昆虫几丁质酶的cDNA序列首次从烟草天蛾Manduca sexta中克隆出来。

目前已克隆得到烟草天蛾、家蚕Bombyx mori和美国白蛾Hyphantria cunea等十几种昆虫的几丁质酶cDNA序列。

这些克隆的基因主要集中在鳞翅目昆虫中,双翅目、鞘翅目和膜翅目仅有少数几丁质酶基因被克隆的报道。

昆虫几丁质酶分子量在40~85kDa之间,比植物几丁质酶(25~40kDa)和细菌几丁质酶(20~60kDa)大。

几丁质酶活性的测定⑴几丁质酶几丁质是绝大多数真菌细胞壁的主要成份，而在植物中却不存在。

但高等植物普遍存在着几丁质酶，并可通过几丁质酶催化几丁质的水解，使植物具有抵御真菌侵染的能力（Shibuya and Minami, 2001）。

在正常情况下，高等植物的几丁质酶表达水平很低，而当植物体遭受到病原真菌、细菌和病毒侵染，机械创伤或乙烯处理时，其表达活性显著增强。

特别是在β-1,3-葡聚糖酶的协同作用下，可明显抑制真菌的生长（Sela-Buurlage et al., 1993）。

几丁质酶是植物体中与防御有关的一种次生水解酶，是植物广谱防御机制的一个成分（V an Loon and Van Strien, 1999），它能催化真菌细胞壁的重要成分——几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物的抗真菌能力。

而植物体中尚未发现几丁质酶作用的底物，所以，几丁质酶在植物体中诱导与积累，对于增强植物的抗病能力有重要作用。

几丁质酶主要水解几丁质多聚体β-1,4键，产生N-乙酰葡聚糖胺寡聚体，水解可以是外切作用也可以是内切作用。

⑵试剂的配制①胶状几丁质的制备称取粉末状几丁质（甲壳素，sigma）5.0 g，缓慢加入200 mL （≤4℃）预冷的浓HCl中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，待几丁质粉末均匀分散后，在水浴中轻度搅拌并缓慢加热至37 ℃混合物的粘度迅速增加，几分钟后粘度开始下降，混合物逐渐变得清亮。

当几丁质基本上溶解完毕时，用玻璃棉过滤，将滤液倒入2000 mL预冷（≤4℃）的蒸馏水中，搅拌，几分钟后几丁质沉淀，溶液变得混浊，30分钟后停止搅拌，将悬液置于冰箱(≤4℃)沉淀过夜。

倒掉上清，剩余部分用双层中性滤纸抽滤，沉淀用蒸馏水洗涤数次，待pH达到5以上时，加数滴1 N NaOH使溶液呈中性。

将上述中性沉淀物加到200 mL的蒸馏水中，剧烈搅拌重新悬浮，即为胶体几丁质溶液。

取该溶液5 mL, 105℃烘箱干燥至衡重，测定溶液几丁质的含量（胶体几丁质溶液的几丁质含量为: mg/mL），并将胶体几丁质溶液浓度稀释为1%。

水稻几丁质酶基因定向进化摘要酶的体外定向进化是蛋白质工程的新策略。

在体外模拟自然进化机制（随即突变、重组和自然选择），利用易错PCR，DNA改组等方法，改造酶的基因结构，定向筛选非野生型酶，短期内在实验室中完成在自然界需要几百年的进化过程。

利用易错PCR的方法，扩增几丁质酶基因。

然后将其与表达载体连接，转如大肠杆菌中进行诱导表达，进行平板筛选，SDS-PAGE检测表达蛋白。

包涵体复性即酶活检测复筛，获得酶活较高的突变酶。

关键字：几丁质酶、易错PCR、定向进化、筛选Rice chitin Chitinase gene Optimal conditionsAbstractKey words:1 前言化学农药的大量施用给人类环境造成了极其严重的影响，如何做到环境保护，是农业和林业上必须要面临和解决的一个重点、难点问题。

因此，生物农药替代化学农药防治农林病害就成了关键突破口[1-5]。

几丁质不仅是昆虫的重要结构组分，而且也是昆虫防止机械损伤和生物危害的屏障。

几丁质酶可以降解几丁质为低分子量，可溶或不可溶的寡糖，通过破坏昆虫的几丁质，或抑制几丁质酶的活性，都可以影响昆虫的生长发育[6-7]。

在植物上几丁质酶可以分解真菌细胞壁的几丁质而杀死病原真菌，即几丁质在害虫和植物病原真菌中广泛存在, 而几丁质酶在一定的环境下能够水解几丁质。

因此，几丁质酶在控制植物真菌病害方面具有重要作用。

因此，研究出能分解几丁质的几丁质酶在生产上具有相当可观的发展前景。

1.3 几丁质酶研究历史几丁质酶(EC3.2.1.14)可以作用于几丁质，并使之分解成乙酰氨基葡萄糖。

许多真菌可以产生几丁质酶[12-14]，在1905年，benecke科学家分离一株能够利用几丁质为碳源的微生物，并命名之为容几丁质孢杆菌[15]。

在1921年，folpmers 科学家在几丁质的培养皿上培养出能够利用几丁质的真菌、放线菌，这两种菌能够生长在含有几丁质的培养基上，并能在培养基观察到透明圈现象，也说明了培养物中含有几丁质酶，深入了几丁质酶研究[16]。

微生物几丁质酶的特性及其应用的研究进展李丽;杨雪松;刘红全【摘要】几丁质酶可以降解几丁质,其降解产物可以用于抗虫、医药、化工、食品等领域.目前已从微生物中获得多种几丁质酶并克隆其几丁质酶基因.本文主要对产几丁质酶微生物的分类及其分布特点、微生物几丁质酶的性质、结构、基因调节及应用等进行综述.【期刊名称】《广西民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(017)001【总页数】5页(P92-96)【关键词】几丁质酶;微生物;分类;特性;应用【作者】李丽;杨雪松;刘红全【作者单位】广西民族大学化学与生态工程学院,广西南宁530006;广西民族大学化学与生态工程学院,广西南宁530006;广西民族大学化学与生态工程学院,广西南宁530006【正文语种】中文【中图分类】Q936几丁质又称为甲壳素，它是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成的长链多聚物[1]，也是自然界中第二丰富的多聚糖[2].每年自然界中产生的几丁质数量极其巨大，几丁质及其降解产物作为重要的有机碳源和氮源参与生态系统的物质交换和能量流动[3].几丁质酶能催化分解几丁质，产生几丁寡糖和几丁二糖.几丁质酶的水解产物低聚糖有抗菌作用，可以调节生物体的免疫力，还可以抑制肿瘤细胞的生长等.几丁质酶对植物真菌病害的防治也有作用.因此，几丁质酶在食品、医药、农业以及化妆品等行业具有独特的使用价值[4].目前，在植物、动物和微生物中都发现了几丁质酶.绝大多数高等植物中都可以产生几丁质酶，几丁质酶主要分布于植物根、茎、叶和愈伤组织中[5]，在感染了真菌的时候，这些部位几丁质酶的含量明显增高，从而避免植物遭受某些真菌或害虫的侵害[6].一些细菌和真菌能够利用几丁质，说明在这些细菌和真菌中存在几丁质酶 [7].近年来，微生物几丁质酶的研究受到人们的重视.Cottrell认为至少10%的海洋可培养细菌能水解几丁质，Wang等认为有25%～50%的土壤链霉菌能产几丁质酶[5].现已从多种微生物中分离出了几丁质酶[8]，对微生物几丁质酶的分布、定位、结构、性质、基因克隆、诱导表达以及调控机制等多方面的研究均取得了一定进展.1 产几丁质酶微生物的分类及其分布特点近年来研究发现，产生几丁质酶的微生物主要有细菌、放线菌、真菌和病毒等[9].细菌主要有杆菌属的环状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蓝黑紫色杆菌、巨大芽孢杆菌、成团肠杆菌；沙雷氏菌属的液化沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌；单胞菌属如嗜水气单胞菌、交替单胞菌属O-7株；弧菌属的哈氏弧菌、弗氏弧菌、创伤弧菌；梭菌属的类腐败梭菌、产气荚膜梭菌、热纤维梭菌；还有蚀几丁质贝内克氏菌、铜绿假单胞、黄单胞菌属、嗜麦芽假单胞菌等.放线菌主要有褶皱链霉菌、灰色链霉菌、天蓝色链霉菌、浅天青链霉菌、热紫链霉菌、浅青紫链霉菌、淡紫灰链霉菌、橄榄绿链霉菌、葱绿毛链霉菌等.真菌主要有白僵菌、构巢曲霉、少孢根霉、木霉属酿酒酵母、白色扁丝霉、白色念珠菌等.病毒类有小球藻病毒PBCV-1、苹果蠹蛾颗粒体病毒(CpGV)、棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)、苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)、杆状病毒等[8].微生物产生几丁质酶的形式并不是单一的，已发现的几丁质酶产生细菌都可以同时产生几种不同的几丁质酶，并且这些几丁质酶的类别、组成和性质等是不同的[10].例如酿酒酵母能产生2种内切几丁质酶cts1和cts2；粘质沙雷氏菌可以产生相对分子质量为21000～57000不等的5种几丁质酶；交替单胞菌属O-7株能产生chiA、chiB、chiC和chiD四种不同的几丁质酶；所以，微生物产生几丁质酶具有多样性的特点，这也使微生物适应环境的能力有所提高.产几丁质酶的微生物分布很广泛.细菌中G+和G-菌中大部分能产生几丁质酶.自然界中，海洋、河流和土壤中都分布着大量几丁质酶产生菌，其中一些滩、海水、盐碱地、盐场、温泉是碱性几丁质酶产生菌理想的分布场所.几丁质酶产生菌分布广泛这一特点，为研究几丁质酶提供了更广阔的空间[7].2 微生物几丁质酶的分类几丁质酶可以依据它的结构和性质进行分类.根据反应的所需的最适pH值，可分为酸性、中性和碱性几丁质酶.根据底物作用部位和产物的不同，可以分为外切几丁质酶和内切几丁质酶.外切几丁质酶的作用部位是底物寡糖链的非还原性末端，将单糖一次切下来；内切几丁质酶的作用部位是底物寡糖的糖苷键，所获得的水解产物是几丁寡糖和几丁二糖.根据分泌性质的不同，可以分为胞外几丁质酶和胞内几丁质酶，相当部分的微生物能够产生胞外酶.按照国际酶学的标准，根据氨基酸序列的同源性，几丁质酶又可以分为18和19两个家族.微生物几丁质酶主要是18家族，19家族主要是指植物几丁质酶.3 微生物几丁质酶的基本性质微生物几丁质酶的分子量大小有很大的差异性，大小一般在20～100 KD之间[11]，通常放线菌产几丁质酶的分子量多在30 KD[12]，而细菌、真菌所产酶分子量变化较大.一种微生物不只产生一种几丁质酶，可以同时产生几种分子大小的几丁质酶，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens )可以同时产生5种分子大小的几丁质酶，分别为21、36、48、52、57 KD[13].大部分微生物几丁质酶是酸性蛋白，等电点一般是3.6～8.6，最适pH值范围一般为3～11.如红霉素链霉菌(S.erythraeus)产几丁质酶的pI为3.7，而烬灰红链霉菌(S.cinerecruber)产几丁质酶的pI为8.6 [12].微生物几丁质酶对热比较稳定，在4℃～60℃之间都具有酶活性，有些酶的活性温度甚至接近于100℃.例如激烈热球菌的几丁质酶在98℃～100℃仍然有活性，地衣芽孢杆菌的几丁质酶在100℃处理10 min后仍有一半多活性[7].大部分微生物几丁质酶的产生需要在相应几丁质的诱导下产生，通常几丁质、脱乙酰几丁质以及几丁质水解产物对几丁质酶的产生均有诱导作用，但几丁单糖没有诱导作用.微生物几丁质酶的活性，还会受一些金属离子的影响.一些金属离子如K+、Na+、Mg2+、Ca2+等对微生物产几丁质酶活力没有抑制作用，而具有激活作用，例如1～40 mmol/L的Mg2+；Fe3+对Bt几丁质酶有一定的抑制作用，在浓度12 mmol/L时可使酶活力降低54.6 %[14].一些重金属离子如Hg2+、Pb2+、Cu2+等对几丁质酶一般有抑制作用，它们可使酶变性而导致失活[9,11].4 微生物几丁质酶的结构不同几丁质酶差异较大，多数微生物几丁质酶的基因以单拷贝形式存在，包括启动子、SD序列、结构基因和终止子，这与原核生物的基因结构相似.在相应的蛋白结构上从N端到C端依次为信号肽、几丁质酶催化区、几丁质酶结合区和一个C端区域.信号肽在该基因结构中占很大比重，因为大多数微生物几丁质酶是胞外分泌酶，所以信号肽起着很大的作用[15].信号肽的断裂位点通常在两个Ala之间，但是有些微生物几丁质酶基因的表达体发生变化时，其信号肽的断裂位点会发生变化，断裂位点可能在Ala与另一种氨基酸之间发生.有些微生物信号肽可能会出现表达载体中无法进行分泌表达的现象.信号肽的长短因微生物的不同而不同，如果同源性高那么信号肽的相似性就比较高.有些细菌的几丁质酶基因转移到宿主细胞以后，几丁质酶基因的信号肽的断裂位点会发生改变，可能是由于不同的细菌对蛋白的输出机制不同引起的[5].几丁质酶发挥催化作用的关键部位是催化区，这一部分的同源性很高，它们都含有两个高度保守的区段.有的微生物几丁质酶有两个催化区，这样可以增强酶活性.结合区起到识别并结合相应的底物的作用，它不会增加酶催化的效率.结合区具有保守的6个半胱氨酸的结构，结合区对于酶催化不可溶的几丁质是必需的，而对于可溶的几丁质底物，结合区则不是必需的[16].结合区中的6个半胱氨酸是必需基团，任何一个半胱氨酸的缺失都会导致结合功能的丧失[17].N 端和C端合区的结合速度是不同的，一般N端催化底物结合的速度比C端快.N端表现的是外切酶的活性，C端表现的是内切酶的活性，并且有实验证明其内切活性要比外切活性高.目前对于18家族几丁质酶研究发现，催化区都含有2个Asp和1个Glu，可能是18家族几丁质酶发挥活性的关键氨基酸.位于18家族β3和β4链上的两段氨基酸序列是高度保守的.18家族几丁质酶蛋白质的三级结构是相似的，都具有由α螺旋和β折叠构成的圆桶形结构，中心是由平行的β折叠结构组成的内桶.β1～β8依次由α螺旋结构连接，β折叠和α螺旋由一段无规卷曲连接起来.19家族几丁质酶的三级结构和溶菌酶的三级结构比较相似.18和19家族的水解产物有所不同，18家族的水解产物是β异构体，19家族的水解产物是α异构体，催化水解产物的不同是由催化机理的差异产生的[8].5 微生物几丁质酶基因的表达调控微生物几丁质酶基因的表达调控是抑制物/诱导物的双向调控.几丁质或其降解物对表达起到诱导作用，而一些易被利用的碳源如葡萄糖常起到抑制剂的作用.例如在木霉的培养基中加入几丁质发现有高活性的几丁质酶表达，加入纤维素、壳聚糖则不能增加几丁质酶的合成，反而还会阻遏几丁质酶的合成.在这种抑制物/诱导物体系中，N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖的存在都会抑制几丁质酶的高水平表达，但培养基中仍有少量几丁质酶的表达.还有人发现在高诱导物存在的情况下，即使有抑制物的存在仍有少量几丁质酶表达.因此，有人推测产几丁质酶的微生物中有一部分几丁质酶是组成型表达的[8].有研究发现，微生物几丁质酶基因的调控系统对自身可能有一定保护作用.在所有的培养过程中，壳二糖酶的表达总是伴随着几丁质酶的表达，壳二糖酶的作用是对起抑制作用的几丁质酶降解产物-N-乙酰葡萄糖胺进行有效降解.那么具有这种系统的产几丁质酶微生物可能是为了满足自身营养需要，而抑制物/诱导物系统能够防止几丁质酶过量表达对微生物自身伤害[8].由于几丁质的多样性，所以产生的几丁质酶各异，不同几丁质酶可以同工酶的形式分泌并相互有顺序的进行调节，构成了几丁质酶基因调节的多样性[7].对大多数产几丁质酶的微生物来说，葡萄糖能够抑制几丁质酶的高表达.例如18家族和19家族的几丁质酶有相似与葡萄糖有关的调控系统，他们启动子区有一对相似的直接重复序列同几丁质的诱导及葡萄糖的抑制有关.该调控系统和菌体的能量代谢系统有关，且受分解代谢产物的阻遏.6 微生物几丁质酶的应用6.1 微生物几丁质酶基因在植物抗病方面的研究应用病虫害是植物所面临主要病害之一，生物防治可以有效的减少传统农药在农业病害防治中所带来的环境污染等负面影响[18].近年，许多科学家开始关注生物防治农业病害，研究出许多具有强抗虫特性的转基因植物，由于几丁质酶的抗虫特性，利用几丁质酶基因防治植物病虫害也成为人们关注的热点[19-22].昆虫的体表以及部分消化系统的成分含有几丁质，几丁质酶将昆虫的几丁质成分水解，昆虫因无法正常的生长发育而死亡，这种方法高效性强.一些科学家将真菌的几丁质酶基因转入植物增加了植物的抗病虫性，已经获得成功的转基因植物包括烟草、马铃薯、矮牵牛、大豆、棉花、水稻和玉米等[23-26].在害虫防治方面，几丁质酶还具有增效作用.比如几丁质酶对苏云金芽孢杆菌制剂有增效作用.主要原因是许多昆虫围食膜的主要成分是几丁质，围食膜是昆虫防止病原细菌或病毒感染的一道天然屏障.少量几丁质水解昆虫幼虫肠中的几丁质后，对于苏云金芽孢杆菌制剂侵染害虫幼虫起到辅助作用.从而加速幼虫患病，提高幼虫死亡率[27,28].6.2 几丁质酶的水解产物可作为生长促进因子几丁质酶的某些水解产物还是促进生长的生长因子.N-乙酰几丁寡糖可促进肠道内有益菌的增殖，同时可以抑制大肠杆菌及肠道内病原菌是生长[28].对于双歧杆菌促进因子(Bifidus factors, BF)的研究结果显示，几丁寡糖和壳寡糖是BF的重要种类，它们可以促进双歧杆菌的生长，调节动物肠道内微生物的代谢活动，改善肠道内微生物的分布.这些水解产物对于提高动物的免疫系统及营养物质的吸收发挥了重要作用.6.3 在调节生命代谢活动中的应用几丁质酶降解几丁质可获得具有生物活性的寡糖片段-氨基寡糖素.氨基寡糖素在调节植物细胞生命代谢活动中起着重要的作用.作为植物功能调节剂，可以调控植物基因的关闭与开放，还可以诱导植物产生抗性酶，调节植物的生长和增强植物对病原真菌的抗性.6.4 其他方面应用的研究进展现在的环境污染问题是全球关注的焦点问题，将产几丁质酶微生物应用于治理环境污染方面的研究进来有所进展.人们的日常生活会产生很多几丁质废弃物，例如一些蟹壳、虾壳等生活废弃物，以及这些废弃物造成水体污染都会带来很大的环境污染问题[29].当然，除了生活污染还有工业带来的污染问题.为了很好的解决这些环境问题，人们开始大量研究用产几丁质酶微生物处理几丁质来解决它所带来的污染问题.产几丁质酶微生物应用前景是相当广泛的，它们的分布和种类优势是进行相关研究的有利条件.同时，还可以进行于生物制剂生产的研究.目前，很多关于产几丁质酶微生物以几丁质作为碳源的研究有了一定进展，这一研究还可以应用于它们的抑菌研究.7 展望随着几丁质酶基础理论和应用研究日益受到重视，几丁质酶研究已成为几丁质科学中的一个重要分支，其应用前景十分广阔，可应用于医药、化工、功能食品、纺织、印染、造纸及环境保护等诸多工业部门和领域.我国对几丁质酶的研究起步较晚，但近年来国内对几丁质酶基因的研究也日益重视，目前已经分离出了多种几丁质降解菌，并已从多种微生物克隆出了几丁质酶基因.目前，虽然对几丁质酶及其基因的研究报道较多，但由于其多样性、调控机理的复杂性，再加上从自然界中分离到的酶活性不是太高，因此距离工业应用的要求还有一定距离.今后应进一步加强对几丁质酶基础理论的研究，并利用现代生物学技术对现有的几丁质酶进行定向改造或筛选出新的活性更强的几丁质酶，以适应工业化生产的需要.[参考文献]【相关文献】[1]Wen-Teish Chang, San-Lang Wang. 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