微生物检验实验室致病性大肠埃希菌标准操作规程

范围成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。

责任微生物限度检验人员内容本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。

微生物计数法一、计数方法1、微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。

3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。

供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。

4、菌种及菌液的制备试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。

计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验。

菌液制备按规定培养各试验菌株。

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含%（ml/ml）聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含%（ml/ml）聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。

阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。

培养基适用性检查按照表规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。

每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。

同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。

控制菌（大肠埃希菌）检查操作规程1.目的建立一个控制菌大肠埃希菌控制菌大肠埃希菌检查标准工作程序，规范QC控制菌大肠埃希菌检查人员的控制菌大肠埃希菌检查的操作。

2.范围适用于本公司的口服制剂完成内包后外包前的中间体和局部给药制剂产品的内包装材料的控制菌大肠埃希菌的检测。

3.责任者QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部4.内容4.1检测准备4.1.1 QC人员接到控制菌大肠埃希菌检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定控制菌大肠埃希菌检查所需容器具、试液、培养基等项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行控制菌大肠埃希菌检查前的准备工作。

4.1.2 为了保证被检品在取样后规定的时间内完成检验，取样前应准备好检验需要的各种器皿（清洗→干燥→包裹）、培养基和稀释剂等（配制→分装→包裹），并灭菌备用。

4.2 供试液的制备4.2.1 供试液供试液是指按照供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法将供试品制成供试验用的均匀液体。

4.2.2 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物需特性，采取适宜的方法制备供试液。

如果使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。

4.2.2.1 可溶性液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。

可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。

4.2.2.2 非水溶性液体供试品油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m，混匀，作为供试液。

4.2.2.3 水溶性固体、半固体或黏稠性供试品称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀，作为1：10供试液。

必要时可加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

4.2.2.4 非水溶性供试品取供试品5g(5m1)，加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使其充分乳化，作为1:20供试液。

更改历史微生物限度检查操作规程1.0 目的建立微生物限度检查标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确2.0 范围适用于本公司采用微生物限度检查法测定的供试品。

3.0 职责质量部负责按本规程的要求执行微生物限度检查操作。

4.0 工作程序4.1 洁净区间的确认微生物计数检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全部过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品（即待检样品、产品）中微生物的检出。

4.2 培养基4.2.1 应使用按中国药典处方及规定的方法制备的培养基。

4.2.2 所用培养基可按中国药典规定的处方及制备方法自行配制，也可使用按中国药典规定的处方生产的脱水培养基进行配制；或购买商品化的预制培养基。

4.2.3 配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

制备好的培养基若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2~25℃、避光的环境下保存。

4.2.4 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。

4.2.5 供试品微生物计数、控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。

4.2.6 供试品的微生物计数方法、控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数或控制菌检查。

4.3 菌种及菌液制备检查所用的菌种及菌液制备见附件 1 微生物计数培养基的适用性检查和附件3 控制菌检查培养基的适用性检查。

稀释剂、冲洗液及其制备的要求见附件1 微生物计数培养基的适用性检查。

4.4 培养基的适用性检查供试品微生物计数、控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。

微生物限度检查所用的培养基每批均应进行适用性检查，检查可在供试品检查前或与供试品检查同时进行。

具体要求见附件1 微生物计数培养基的适用性检查和附件3 控制菌检查培养基的适用性检查。

4.5 方法适用性试验供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。

微生物限度检查标准操作规程⏹ 1. 目的：建立微生物限度检查的基本操作，为微生物检查人员提供正确的操作规程。

⏹ 2. 依据：《中华人民共和国药典》2010年版二部。

中华人民共和国卫生部《药品卫生检验方法》⏹ 3. 范围：本标准适用于QC化验室的微生物限度检查。

⏹ 4. 职责：QC微生物检验员对本标准的实施负责。

⏹ 5. 程序：⏹ 5.1. 定义：微生物限度检查法：微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。

⏹ 5.2. 实验用具：⏹电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75%酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。

⏹ 5.3. 培养基：⏹ 5.3.1. 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、麦康凯琼脂培养基、枸橼酸盐培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、蛋白胨水培养基、4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸（MUG）培养基。

⏹ 5.3.2. 培养基的管理、配置应符合检定菌、培养基管理规程、培养基配置规程。

⏹ 5.4. 试液：甲基红试液、а-奈酚乙醇试液、40%氢氧化钾溶液、靛基质试液。

⏹ 5.5. 稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液、PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

⏹ 5.6. 供试品溶液的制备：取供试品（供试品如为固体，置研钵中研磨成细粉）放入试管中，加入适量的稀释剂制成1：10浓度的供试品溶液。

⏹ 5.7. 对照用菌液：控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验，对照菌株为大肠杆菌[CMCC（B）44102]。

⏹ 5.8. 检查法：⏹除另有规定外，细菌的培养温度为30-35℃，霉菌的培养温度为23-28℃，控制菌的培养温度为35-37℃。

⏹ 5.8.1. 细菌、霉菌计数：⏹ 5.8.1.1. 平皿法⏹采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。

⏹取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。

20版药典大肠埃希菌检查操作规程以下是一份20版药典大肠埃希菌检查操作规程的示例：1. 实验室准备a. 确保实验室设备、试剂和培养基的准备充足。

b. 检查培养基的质量和有效期限。

c. 清洗和消毒实验台面和工具。

2. 样品准备a. 收集待检样品，如食品、水源等。

b. 如果样品体积较大，将样品切割成适当大小的块。

c. 样品处理前，使用无菌容器收集样品。

3. 样品处理a. 杀菌样品以杀灭大肠埃希菌以外的其他微生物。

可以使用高温杀菌、化学杀菌等方法。

b. 对于液体样品，使用无菌技术将样品转移到含有适当培养基的试管中。

c. 对于固体样品，将一定重量的样品转移到含有适当培养基的培养皿中。

4. 培养与孵育a. 在适当温度下，将培养皿或试管放入培养箱孵育。

大肠埃希菌通常在37℃下生长。

b. 确保培养基含有抑菌物质（如抗生素），以防止其他非大肠埃希菌的生长。

5. 结果解读a. 在孵育一定时间后，观察培养基上是否有典型的大肠埃希菌菌落。

b. 大肠埃希菌菌落通常呈现金黄色、粘液状，有时也可能呈现其他形态。

c. 使用适当的显微镜技术，观察和鉴定菌落形态，并进行进一步的确认。

6. 结果记录和报告a. 记录培养结果和菌落形态的详细描述。

b. 如需要，进一步进行相关确认试验。

c. 根据操作结果，撰写实验报告，并将结果报告给相关人员或部门。

注意事项：- 确保操作过程中的无菌技术和消毒措施。

- 操作过程中遵循安全操作规范，注意个人防护。

- 严格遵守实验室操作流程，减少污染和误差的可能性。

- 如发现培养出大肠埃希菌，及时采取相应的措施，以避免传播和扩散。

大肠埃希菌检查法Escherichia Coli Test Method1.目的建立大肠埃希菌检查法的标准操作程序。

2.范围适用于大肠埃希菌检查的操作。

3.责任者QC化验员。

4.程序：4.1.简述4.1.1. 大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠埃希菌，为肠埃希菌科埃希菌属的模式种。

埃希菌属除大肠埃希菌外，新近发现有非脱羧埃希氏菌等5个种。

大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。

在药品中检出大肠埃希菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。

大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。

为保证人体健康，口服药品必须检查大肠埃希菌。

4.1.2. 用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG)和靛基质(Indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术，其检验步骤为：增菌培养后，转种MUG-蛋白胨培养基培养，多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌，如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。

4.1.3. 原理：利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物，产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。

实验证明，96％的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUD)，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。

MUG被GUD水解，产生荧光，由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG 鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。

单一的MUG 鉴别大肠埃希菌其漏检率达6％，鉴于98％的大肠埃希菌其靛基质试验为阳性，故将MUG与靛基质试验结合，比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。

如MUG与Indole试验的反应不一致时，则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。

该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98％。

控制菌（大肠埃希菌）检查操作规程1.目的建立一个控制菌大肠埃希菌控制菌大肠埃希菌检查标准工作程序，规范QC控制菌大肠埃希菌检查人员的控制菌大肠埃希菌检查的操作。

2.范围适用于本公司的口服制剂完成内包后外包前的中间体和局部给药制剂产品的内包装材料的控制菌大肠埃希菌的检测。

3.责任者QC控制菌大肠埃希菌检查人员；质量管理部4.内容4.1检测准备4.1.1 QC人员接到控制菌大肠埃希菌检查的《工作进程计划单》后，核对《取样指令》，确定控制菌大肠埃希菌检查所需容器具、试液、培养基等项目和数量，执行微生物检查准备工作操作程序和培养基配制操作规程，进行控制菌大肠埃希菌检查前的准备工作。

4.1.2 为了保证被检品在取样后规定的时间内完成检验，取样前应准备好检验需要的各种器皿（清洗→干燥→包裹）、培养基和稀释剂等（配制→分装→包裹），并灭菌备用。

4.2 供试液的制备4.2.1 供试液供试液是指按照供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法将供试品制成供试验用的均匀液体。

4.2.2 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物需特性，采取适宜的方法制备供试液。

如果使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。

4.2.2.1 可溶性液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。

可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。

4.2.2.2 非水溶性液体供试品油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m，混匀，作为供试液。

4.2.2.3 水溶性固体、半固体或黏稠性供试品称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀，作为1：10供试液。

必要时可加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

4.2.2.4 非水溶性供试品取供试品5g(5m1)，加入含溶化的（温度不超过45℃）5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使其充分乳化，作为1:20供试液。

目的建立微生物限度检查法标准操作规程，规操作，保证结果的准确性。

围成品、辅料、包装袋及纯化水的检验。

责任微生物限度检验人员容本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。

微生物计数法一、计数方法1、微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。

3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。

供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。

4、菌种及菌液的制备4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。

计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验。

4.2菌液制备按规定培养各试验菌株。

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时使用；若保存在2-8℃，可在24小时使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期使用。

4.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。

4.4培养基适用性检查按照表规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。

一目的建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。

二范围本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。

三内容1.1 试验菌株大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941]黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001]1.1.1 标准菌株1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。

1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。

1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。

1.1.2 工作菌株1.1.2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。

1.1.2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。

因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。

1.2 菌种确认试验的主要内容1.2.1 菌种的纯度确认1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。

1.2.1.2 试验内容①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。

②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。

微生物限度检测方法验证操作规程1 目的确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。

2 依据《中国药典》2015版。

3 范围所有需进行微生物限度检测的产品。

4 责任4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。

4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。

5 程序5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。

5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。

6 内容6.1 概述通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。

根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。

若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。

6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证6.2.1 验证用菌株铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]黑曲霉[CMCC（F）98 003]白色念珠菌[CMCC（F）98 001]6.2.2 验证用菌液制备6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。

取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。

6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。

微生物限度检查标准操作规程1.目的：建立一个微生物限度检验标准操作规程。

2.范围：本公司的药品、原辅料、器具设备、工艺流程、生产环境和操作人员。

3.职责：微生物限度检验人员对实施本程序负责。

4.规程：4.1取样：按各《取样标准操作程序》，应随机抽取不少于检验用量（两个以上最少包装单位）的3倍量供试品。

每份供试品最低应取2个以上最少包装单位，膜剂不得少于4片。

4.2 培养基的制备：按“培养基制备标准操作规程”。

4.3 稀释剂的制备：称取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液14.63g，置1000ml三角瓶中，加纯化水1000ml，摇匀，加热溶解,于121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

4.4检验量：除另有规定外，每份供试品最低应取2个以上最小包装单位，膜剂不得少于4片。

一般供试品的检验量为10g或10ml；中药膜剂为100cm2。

要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml 用于阳性对照试验）。

4.5 试验前的准备：4.5.1将所有已灭菌的平皿，三角瓶、吸管、量杯、研钵、稀释剂及供试品等移至无菌室的传递窗内，打开紫外灯消毒15min，风淋10s。

4.5.2开启无菌室紫外线灭菌灯20分钟。

4.5.3关闭紫外线灭菌灯，进入缓冲一室，用肥皂洗手，换工作鞋，除外衣；进入缓冲二室，穿戴无菌衣、帽、口罩，用消毒剂消毒双手，戴上手套，进入操作间。

4.5.4开启工作台，用乙醇棉球擦手及供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀将供试品启封。

4.6操作:4.6.1供试液的制备:4.6.1.1固体、半固体或黏稠性供试品: 取供试品10g,置灭菌研钵中,以100ml稀释剂分次加入研磨,混匀使成1:10供试液。

4.6.1.2液体供试品：取供试品10ml，置灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，充分摇匀，即为1:10供试液，也可取原液作为供试液。

4.6.1.3胶囊剂和空心胶囊供试品：取供试品10g，分离囊帽与囊身，同置灭菌锥形瓶中，加100ml稀释剂。

1目的规范微生物限度检验操作，确保检验结果准确、可靠。

2依据《中国药典》2015版。

3范围本标准适用于微生物限度检验。

4责任中心化验室负责人：对本规程的实施负责。

中心化验室检验人员：严格按照本规程执行检验操作。

5程序5.1执行标准：《中国药典》2015版。

5.2抽样：照《取样标准操作规程》进行。

6内容6.1需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN法）。

检查时，按已验证的计数方法进行供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。

6.1.1设备、仪器及用具6.1.1.1设备微生物限度检测室、净化工作台、生化培养箱（30〜35£）、生化培养箱（20〜25£）、电热恒温水浴锅、烘箱、脉动真空灭菌柜、紫外灯等。

6.1.1.2仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、移液枪及吸头、薄膜过滤器等。

6.1.1.3用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。

6.1.2试液6.1.2.1消毒液A.0.1%新洁尔灭溶液B.75%乙醇溶液6.1.2.2稀释液、试剂及配制A. pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g,加纯化水1000ml，微温溶解，滤清，分装，1210C灭菌15分钟。

B.聚山梨酯80C.无菌十四烷酸异丙酯D. pH6.8无菌磷酸盐缓冲液6.1.3培养基胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基6.1.4操作方法6.1.4.1试验前准备6.1.4.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、移液枪吸头（1ml、10ml）、量筒、稀释液、培养基等移至传递窗内。

每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。

6.1.4.1.2开启微生物检测室紫外灯和空调净化系统，并使其工作不低于30min。

一、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。

二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)三、目录1．微生物限度标准2．设备、仪器及用具3．消毒液、稀释剂、试液及培养基4．检查总则（通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法，通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）5．微生物计数法检查6．控制菌检查法7．实验技术8. 附件1．微生物限度标准非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准*未做统一规定。

(1)．“—”为不得检出。

(2)．目测霉变者以不合格论。

说明：1．“—”为每100 cm中不得检出。

2．目测霉变者以不合格论。

3．“无”为标准依据或无相应规定。

2．设施、仪器及用具2.1、设施：2.1.1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

2.1.2．其他设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30~35℃）；霉菌培养箱（25~28℃）；电炉（或其他适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300℃）；电冰箱。

生化试剂储存箱。

2.2仪器及器皿2.2.1．菌落计数器；显微镜（1500X）；电子天平或药物天平（感量0.1g）；pH系列比色计。

2.2.2．玻璃器皿：锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干）、研钵（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培养皿（∮9 cm）、量筒（100 ml）、试管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10 ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。

2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%~2%盐酸（工业用）液中约2~6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。

用于化学分析的玻璃仪器，需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2~3次，晾干备用。

微生物限度检查法操作规程1．范围本规程适用于微生物限度的检查。

2．设备、仪器及用具、试液、培养基2.1 无菌室：温度18～26℃，相对湿度45～60%，洁净度不应低于10000级。

2.2 其他设备：净化工作台（洁净度为100级）、生化培养箱（23～28℃）、恒温培养箱（30～35℃）、电热恒温水浴锅、高压蒸汽消毒器、电热恒温干燥箱（最高工作温度300℃）、冰箱。

2.3 托盘天平、显微镜。

2.4 玻璃器皿2.4.1 锥形瓶、吸管、试管、培养皿90mm、量筒、烧杯、研钵、载玻片、盖玻片。

2.4.2 洗涤：吸管、锥形瓶、培养皿、烧杯等用清洁液浸泡，用清水冲洗干净再用蒸馏水冲洗2～3遍，晾干。

使用过后如与细菌接触，应121℃湿热灭菌20分钟，倒出内容物，然后清洗、晾干。

2.5 酒精灯、灭菌剪刀、接种环、灭菌镊子、大小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并定期用70～75%乙醇溶液浸泡）、记号笔。

2.6 无菌衣、帽、口罩（用牛皮纸包严）灭菌，备用。

2.7 试液2.7.1消毒液：0.1%新洁尔灭或络合碘、75%乙醇溶液、5%来苏溶液。

2.7.2 稀释剂： PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装于锥形瓶或试管内，每瓶100ml或每管9ml，加塞，121℃灭菌20分钟备用。

2.7.3 靛基质试液（柯凡克试剂或欧-波氏试剂）、结晶紫染液、碘液、95%乙醇、溴麝香草酚蓝指示剂、酸性品红指示剂、沙黄染液、甲基红指示液、α-萘酚乙醇试液、40%氢氧化钾。

2.8 培养基2.8.1 选择：营养琼脂培养基（细菌计数用）；玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌及酵母菌计数用）；胆盐乳糖培养基；MUG培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）、麦康凯琼脂培养基、乳糖培养基、枸橼酸盐培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、蛋白胨水培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基、胆盐硫乳琼脂（DHL）。

《微生物与实验技术》食品中大肠埃希菌的检验实验一、实验目的1.熟悉大肠埃希菌的检验原理2.熟悉大肠埃希菌检验的基本操作二、实验原理1.大肠杆菌，又叫大肠埃希氏菌是条件致病菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染。

因此，检查食品中是否存在治病大肠埃希氏菌具有实际意义。

2. 在TSI琼脂中,典型菌株为斜面与底层均呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢(H2S)。

置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察,MUG阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生,MUG阴性的应无荧光产生，大肠埃希氏菌O157:H7/NM为MUG试验阴性,无荧光。

三、试剂及器材1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤：2 EC肉汤（E.coli broth）：3 蛋白胨水：4磷酸盐缓冲液：5伊红美蓝（EMB）琼脂：6 营养琼脂斜面：7结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：8革兰氏染色液：9无菌1mol/LNaOH：10无菌1mol/LHCl：四、操作方法样品的稀释1. 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min，制成1:10的样品匀液或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min制成1:10的样品匀液。

2.液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1.10的样品匀液。

3. 样品匀液的pH值应在6.5~7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl 调节。

4 .用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL 磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面）振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。

大肠埃希菌的微生物检验方法与临床分析发表时间：2019-05-15T11:44:10.180Z 来源：《中国结合医学杂志》2019年3期作者：唐友凤[导读] 结论：临床上在检验大肠埃希菌时，按照《中国药典》2015年版中的相关要求，能够使准确性提高。

湖南省慈利县疾病预防控制中心湖南张家界 427200【摘要】目的：探讨大肠埃希菌的微生物检验方法与临床价值。

方法：选择某院2017年12月-2018年12月期间送来的检验标本51例为研究对象，按照《中国药典》中的相关要求检验大肠埃希菌，并且分析检验结果。

结果：在本次研究中，共检出31例大肠埃希菌菌落，检出率为60.78%（31/51）；同时，大肠埃希菌在MacA平板上的形态学表现为：①表面光滑、湿润，且边缘整齐；②形状比较扁平，主要为圆形；③菌落颜色主要为鲜桃红色，大多数菌落中心为深桃红色，但是一些为微红色。

结论：临床上在检验大肠埃希菌时，按照《中国药典》2015年版中的相关要求，能够使准确性提高。

【关键词】《中国药典》；微生物检验；大肠埃希菌在人体肠道菌群中，大肠埃希菌是比较重要的一个组成部分，具有复杂的发病机制，一般为人体的抵抗力和免疫力降低后，使大肠埃希菌的寄居条件发生了改变，从而诱发机会感染或二重感染，临床上多见于肠道感染、败血症以及伤口感染等[1]。

有研究发现，通过对大肠埃希菌进行微生物检验，能够明确判断患者病情，在一定程度上有助于临床方案的制定。

因此，本文对大肠埃希菌的微生物检验方法与临床效果进行了探讨，现报道如下。

1.资料和方法1.1一般资料选择2017年12月-2018年12月期间某院送来的51例检验标本为研究对象，并且选择[CMCC（B）44102]大肠埃希菌，提供者为中国食品药品检定研究院。

1.2方法1.2.1试剂和仪器本次研究仪器包括CP-ST200电热恒温培养箱、VITEK2全自动微生物分析仪；而试剂则包括以下3种：①TSB。

微生物检验危急值报告程序
1 目的
对于在血、骨髓、脑脊液等标本中（涂片或培养）发现细菌或真菌，以及发现疑似高致病性病原微生物或国家规定立即上报的法定传染病，第一时间报告给临床医生及医院相关部门，为诊断治疗或隔离防疫赢得时间。

2 适用范围
适用于临床微生物检验的所有血培养、骨髓培养、脑脊液涂片或培养标本，以及可能发现疑似高致病性病原微生物或国家规定立即上报的法定传染病病原体的所有标本。

3 职责
实验室所有经授权工作人员均应执行本程序。

4 程序内容
4.1 微生物检验危急值：
4.1.1 血液、骨髓或脑脊液检出（涂片或培养）病原微生物。

4.1.2 O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、肠出血大肠埃希菌 O157：H7、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、猪链球菌、结核杆菌（或抗酸染色阳性）、生殖道淋病奈瑟菌、布鲁菌、脑膜炎奈瑟菌等传染性较强的微生物及其他国家规定立即上报的法定传染病病原体。

4.2 微生物危急值报告方式和处理。

4.2.1 血培养、骨髓培养、脑脊液培养的危急值报告方式按《微生物检验结果》中的分级报告程序进行，电话通知相应临床科室并及时填写《检验科危急值报告登记表》。

4.2.2 脑脊液涂片发现细菌或真菌，应立即审发涂片结果，电话通知临床并及时填写《检验科危急值报告登记表》。

4.2.3 检出 O1 群霍乱弧菌、O139 群霍乱弧菌、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、肠出血大肠埃希菌 O157：H7、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、猪链球菌、结核杆菌（或抗酸染色阳性）、生殖道淋病奈瑟菌、布鲁菌、脑膜炎奈瑟菌等传染性较强的微生
物或国家规定立即上报的法定传染病病原体，按《疑似高致病性病原微生物标本管理程序》处理。