转基因油菜的外源Barstar基因向近缘种的转移研究

转基因甘蓝型油菜向其近缘种的基因漂移研究进展
李俊;张春雷;李光明
【期刊名称】《江西农业学报》
【年(卷),期】2009(021)003
【摘要】从甘蓝型油菜的生活周期出发,概述了甘蓝型油菜及其近缘种的开花习性、甘蓝型油菜与其近缘种的杂交亲和性、杂种及其回交后代的育性和适应性,评价了
在中国环境条件下甘蓝型油菜中的外源基因向其近缘种漂移而导致生态风险的可能性.认为在中国环境条件下,转基因甘蓝型油菜向其野生杂草近缘种的基因漂移风险
较小,而如何防止转基因向白菜型油菜(Brassica rapa)和芥菜型油菜(B.juncea)转移应作为中国转基因甘蓝型油菜基因漂移风险控制的关键.
【总页数】7页(P32-37,40)
【作者】李俊;张春雷;李光明
【作者单位】中国农业科学院,油料作物研究所,湖北,武汉,430062;中国农业科学院,油料作物研究所,湖北,武汉,430062;中国农业科学院,油料作物研究所,湖北,武
汉,430062
【正文语种】中文
【中图分类】S565.402
【相关文献】
1.转基因甘蓝型油菜的小孢子培养及转基因的遗传分析 [J], 肖霞;殷家明;林呐;柴
友荣;李加纳
2.抗草甘膦转基因大豆基因漂移的研究Ⅰ大豆风媒介传粉的基因漂移研究 [J], 刘琦;李希臣;刘昭军;李铁;雷勃钧
3.转基因水稻外源基因向近缘种群漂流和渐渗的研究进展 [J], 汤日圣
4.转基因大豆向野生大豆基因漂移研究进展 [J], 刘标;薛堃;刘来盘;周延;韩娟
5.转基因甘蓝型油菜向其近缘种的基因漂移之研究进展 [J], 李俊;张春雷;李光明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

专利名称：油菜转基因的方法
专利类型：发明专利
发明人：刘胜毅,郭学兰,董彩华,刘越英申请号：CN200610018488.6
申请日：20060307
公开号：CN1821415A
公开日：
20060823
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种油菜转基因的方法。

本方法以原位生殖器官(包含花粉管，受精前后的配子和合子)为转基因受体。

在对油菜授粉后的花柱和子房进行细胞学观察的基础上，确定了该方法的转化时间。

在该时间内，削去柱头，滴加外源DNA溶液，使携带外源基因和草胺膦抗性标记基因的DNA转化生殖细胞，通过生长发育，获得转基因的T1代合子(种子)，在T1代幼苗早期用低浓度的除草剂草胺膦进行喷洒筛选，获得转基因阳性油菜植株。

本发明的转基因效率为2～10％，转化通量高，而且成本低廉，工作量小，不存在基因型依赖，不存在转基因植株种子繁殖中的春化和越夏问题，筛选简便，结实率高。

申请人：中国农业科学院油料作物研究所
地址：430062 湖北省武汉市徐东二路二号
国籍：CN
代理机构：武汉宇晨专利事务所
代理人：王敏锋
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转bar基因抗除草剂冬油菜及其基因流研究本研究主要内容是利用目前应用最广泛的农杆菌介导的植物转化方法,以bar基因为目标基因,获得适合我国种植的转基因抗除草剂冬油菜品系,同时对转基因油菜与中国不同类型白菜的人工可交配性、天然异交率与生存适合度进行研究,评价转基因油菜与白菜类亚种及变种的基因流。

以油菜子叶柄和下胚轴为外植体,以双低抗病冬油菜品种“中双7号”为转化受体,转化3批约500个子叶柄和600个下胚轴,获得了46株转基因油菜,其中转化阳性植株为35株,阳性率为76%,转化效率为3.2%。

对抗除草剂油菜后代的不同株系进行拷贝数、表达水平与外源基因整合位置等因素的分析,选取6个包含单拷贝、双拷贝和多拷贝的家系对叶片、茎杆、花、根和种子5个组织进行表达量测定,结果表明拷贝数对表达量没有明显影响,而在不同组织中,叶片和茎中表达较高,种子和根中表达很低；同时全面考察了转基因油菜品系的生长势与生育期、产量相关性状、抗逆性、种子品质性状、种子生活力等方面的特性。

经过对转基因家系T4代的考察,转基因品系在农艺性状、品质及生活力上没有明显改变,生育期和抗逆性方面也变化不大。

通过综合比较最终选取Z7B10、Z7B16和Z7B22三个家系作为环境释放阶段候选品系。

为了获得转基因环境释放阶段品系的特异性检测方法,采用基因组步移PCR方法研究了转基因抗除草剂油菜Z7B10、Z7B16和Z7B22的外源基因插入位点序列特征,并根据此特征建立了这三个品系的转化事件特异性检测方法。

从Z7B10、Z7B16和Z7B22的DNA分别分离到外源基因插入位点的左边界旁侧序列677bp、1100bp和964bp的左边界序列,同时从Z7B22基因组DNA中分离到右边界旁侧序列718bp。

序列检索分析显示以上序列均包含载体序列和基因组序列,表明为真实旁侧序列。

根据分离的三个品系的左右边界旁侧序列,建立了这三个转基因抗除草剂油菜品系的事件特异性定性检测方法,扩增片断大小分别为314bp、259bp和384bp。

转基因油菜研究进展摘要油菜的遗传转化研究已日趋成熟，用于转化的目的基因趋于多样化，如品质改良、抗病、抗逆、不育基因等;较常用的筛选标记基因是新霉素磷酸转移酶基因(NPT Ⅱ);目前用于油菜基因转化的方法有根癌农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、激光微束穿刺法、显微注射法和花粉介导法等。

主要从油菜筛选标记及转化方法方面进行综述，并对油菜转基因上存在的问题及前景进行了探讨和展望。

关键词油菜;转化基因;筛选标记;转化方法AbstractHeredity transform research of rape is more and more matcher.Transgenics are tending to persify，as follows:quality reformation，resistant to disease，pests and adverse etc.Selection marker used is NPTⅡ.At present，there are several methods of transformation in rape，including tumefaciens-medidated genetic etc，particle gun，PEG untake，vialaser microbeam puncture and microinjection.The foundation of rape selection marker and transformation methods were mainly summarizes in the paper. The present status of rapeseed genetic transformation were reviewed and the problems and envision for further study were discussed.Key wordsBrassica napus;transgene selection marker;transformation method油菜是世界四大油料作物之一，属十字花科(cruciferae)芸墓属(Brassica)，主要包括甘蓝型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.Juncea)和白菜型油菜(B.rapa)3个栽培种。

bar基因的目的及作用是什么？我国的转基因农作物综述报告]转基因作物(Genetically Modified Organism Crops，以下简称GMO作物)是现代农业生物技术的产物，是指以分子生物学技术导入基因或基因嵌合体的作物。

它克服了传统育种技术的不确定性，突破不同物种之间的生殖隔离，根据人们的需要，赋予农作物新的特性。

1983年首例GMO作物在美国问世。

1994年，世界上第一种转基因食品——转基因晚熟西红柿正式投放美国市场，开创了GMO作物商业应用的先河。

如今，转基因作物已经成为世界上许多国家研究和争议的热点议题。

各国在加大研究力度的同时，又开展了广泛的争议。

赞同者认为转基因作物在解决目前人类所面临的粮食安全问题上正发挥着巨大作用，是农业生产的一次新革命；而畏惧它的人则认为转基因作物的出现会带来难以预想的食品安全性和生态危机。

但是，不可否认的是，转基因作物已成为普及应用速度最快的农作物改良手段。

笔者将从转基因作物产业化现状、研究进展及存在问题等方面进行简单综述。

1 转基因作物产业化现状自1983年第一例转基因植株问世以来，植物转基因研究迅速发展，各国政府及跨国公司均投入巨额资金从事基因克隆、植物转基因和转基因产品开发研究工作。

特别是近十多年来，国际上获得转基因植株的植物已有超过35个科120多个种，它们主要集中在七大类农作物上，即：大豆、玉米、棉花、油菜、马铃薯、南瓜、西葫芦和木瓜，2004年，转基因大豆种植面积量大，占总面积的60％。

从改良作物的目的性状来看，第一代的转基因作物，主要集中在培育抗除草剂或抗虫作物；第二代的转基因作物，主要集中在培育多抗转基因作物、抗性及品质优良的综合型转基因作物，也即将有相关转基因作物上市。

据美国农业生物技术国际服务组织（ISAAA)提供的最新数据表明，从1996年转基因作物实现商业化种植以来，转基因作物种植面积连续8年保持两位数的百分增长率，转基因作物全球种植面积在1996年(170万hm2)--2004年(8100万hm2)的8年期间增加了47倍。

油菜遗传转化方法的研究进展涂世伟;郭万里;蒋立希;潘建伟【摘要】It was reviewed the rapeseed explant types, selection markers, transformation methods, the influence factors of regeneration systems and its applications in rapeseed breeding were discussed. It was also mentioned the problems and development in the future of rapeseed transformation. It was found that there were still limitations in the transformation of rapeseeds through the published papers and establishment of transformation system of rapeseeds. Firstly, the process of receptor regeneration was a long period and the frequency of gene transformation was low. Secondly, the introduced gene might be silent and the expression of transferred gene would unstable in the progeny. Thirdly, the scientific evaluation should be made about the bad influence of transgenic rapeseed to human heath and the natural environment. Moreover, more complete law and rule should be made to supervise the environment release of transgenic plants. At the same time, it should meet the needs of people by modifying the trait of rapeseeds. Furthermore, there would be a wide foreground to produce the substitute of energy source by introducing special gene into rapeseed plants.%主要对油菜外植体类型、筛选标记、转化方法、作物改良及其成果进行了综述,并对转基因油菜存在的问题和前景进行了探讨.研究发现,现阶段油菜转基因仍存在局限性,主要表现在:1)转化受体再生周期长,转化过程繁琐,转化效率低;2)外源基因表达不确定,遗传不稳定,基因沉默现象有待解决;3)转基因油菜对人类健康和生态环境可能存在不利影响及不确定性的风险,应进行科学评估,且需建立更完善的相关法律法规.同时,应继续发展及利用油菜转基因以满足人们的需求,特别是利用油菜生产能源替代品——生物柴油,前景广阔.【期刊名称】《浙江师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(035)003【总页数】8页(P338-345)【关键词】油菜;遗传转化;外植体;筛选标记;转化方法【作者】涂世伟;郭万里;蒋立希;潘建伟【作者单位】浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004;浙江大学农业与生物技术学院作物科学研究所,浙江杭州310012;浙江大学农业与生物技术学院作物科学研究所,浙江杭州310012;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004【正文语种】中文【中图分类】Q78;S565.4外植体是用来进行遗传转化的离体受体组织.外植体的选取是实现遗传转化的首要条件之一，适宜的外植体应具备取材方便、再生能力强、遗传稳定等特点.不同的外植体对于油菜遗传转化体系的建立具有很大的差异.1989年，Moloney等［2］首次以子叶柄为外植体成功地将NPTⅡ导入油菜中，发现甘蓝型油菜子叶柄末端切口处的薄壁细胞不但再生能力强(80%)，且易被农杆菌感染和转化，其转化率为55%.近些年，国内外以油菜子叶柄为外植体进行遗传转化已有大量的报道.Maheshwari等［3］优化了子叶柄的转化体系，使其适用于多个油菜品种，得到了较高的转化率.下胚轴也是常用的外植体.文献［4］以油菜下胚轴为外植体，在愈伤诱导期增加7 d的预培养，使再生芽出芽期提前7 d，且芽的再生率高达96.67%.Fry等［5］建立了茎段遗传转化体系.Burbulis等［6］分别以茎段和下胚轴为外植体，研究了不同油菜品种的再生，发现一些品种茎段再生率较下胚轴高25.78% ～85.11%.Dutta 等［7］以油菜叶片为外植体，成功建立了5个油菜栽培品种的基因转化体系.段英姿等［8］认为：以子叶柄、下胚轴为受体，具有操作简单、快速且转化率高(1.5%～55%)等优点，但再生植株易为嵌合体，基因型也可能是杂合的;以原生质体为受体则能得到高度纯合体，但存在原生质体制备复杂、分化难、再生和转化率低等缺点.本实验室选用子叶柄和下胚轴为外植体建立了油菜的遗传转化体系，发现3～5 d苗龄子叶柄和4～6 d下胚轴再生能力最强，取材方便，易分化，下胚轴再生芽的数量比子叶柄多，但下胚轴外植体易褐化且再生苗假阳性高，而子叶柄转化率高，再生时间更短.自Licther［9］首次报道在甘蓝型油菜中进行游离小孢子培养获得再生植株后，小孢子培养技术被广泛应用于油菜转基因.Abdollahi等［10］利用基因枪技术及小孢子培养技术进行油菜基因转化，获得大量的转化苗.由于小孢子本身具有单细胞性和单倍性的双重特点，用它作为转化受体进行外源基因导入，不仅有利于基因表达，还可以加速转基因材料的纯合，从而大大缩短育种年限.至今，通过小孢子培养获得转基因油菜的技术日益成熟，该技术在法国、加拿大等油菜主产国已成为一种常规育种技术.筛选标记的选择在油菜遗传转化中非常重要，使用频率最高的是新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)、潮霉素磷酸转移酶基因(HPTⅡ)、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、乙酰基转移酶基因(Bar)和链霉素磷酸转移酶基因(Spt).Schroder等［11］研究了 4种选择标记基因(NPTⅡ，aadA，Bar和Spt)在甘蓝型油菜转化过程中的筛选效果，发现用aadA(介导对链霉素和壮观霉素的抗性)作为筛选标记的效果最好.文献［12］以aroA-M1突变基因为筛选标记，在含草甘膦的培养基中筛选到转基因苗.Wallbraun等［13］以磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)为筛选标记，证明甘露糖能有效筛选转基因植株.本实验室使用潮霉素与卡那霉素作为筛选标记，发现潮霉素筛选对外植体再生影响不大，筛选效果很好，而卡那霉素则容易使再生苗发白，很难得到抗性苗.随着转基因技术的发展，用于外源基因的遗传转化方法越来越多，大体可分成2类：一是农杆菌介导遗传转化法;另一是外源基因直接导入法，如基因枪法、PEG介导法、电击法、激光微束穿刺法、显微注射法和花粉管通道法.农杆菌(Agrobacterium)是一种革兰氏阴性土壤杆菌，有根癌农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizobium)，能够在植物的受伤部位侵染植物细胞，将T-DNA转入植物细胞并整合进植物的基因组，并在植物体内表达外源基因.目前，农杆菌介导法在转基因技术中使用频率最高，是最普遍的油菜转化方法.因为农杆菌介导的转基因方法具备以下优点：不需要专门仪器;宿主范围广，包括大多数双子叶植物和单子叶植物;插入外源基因的片段较大，可达50 kb以上;转化率明显高于其他直接转化方法;外源基因整合到植物基因组上的拷贝数较少，多为单拷贝;整合的外源基因变异小，后代的分离也遵循孟德尔遗传定律.缺点是受宿主范围和菌株特异性等因素的限制［14］.根癌农杆菌和发根农杆菌均已成功用于转化油菜.Metz等［15］和Henzi等［16］用发根农杆菌介导白菜型油菜的转化，发现得到的转化苗出现不正常的表型，如顶端优势下降、叶片起皱、花畸形和可育性下降.根癌农杆菌是现在最理想的遗传转化媒介，但仍有以发根农杆菌介导油菜品质改良的报道.Higgins等［17］利用发根农根菌成功地将1-氨基环丙烷基-1-羧酸(ACC)合成酶基因及氧化酶基因导入油菜，转基因植株表型正常.农杆菌介导的花序浸泡(Floral-dip)转化方法是近年发展起来的一种简便、快速、高效、重复性好、稳定性高的非组织培养转基因体系，它是由真空渗透(Vacuum Infiltration in Planta)转化法简化而来，只需将植株的花序浸泡在农杆菌转化液中几min，然后等种子成熟后即可通过筛选得到转基因的种子.付绍红等［18］用花序浸泡法处理甘蓝型油菜得到了103株卡那霉素抗性植株.文献［19］将此方法进行了改良，在转基因植株收到种子后，用100 mg/L潮霉素浸泡种子24～36 h，再种于蛭石中，一周后即可筛选出转基因植株.文献［20］报道通过花絮浸泡法将拟南芥中克隆的赤霉素2-氧化酶基因(AtGA2ox8)导入甘蓝型油菜，转基因植株表型矮小、主枝增多、荚果变多，且转化株的逆境耐性增强.农杆菌介导的花序浸泡转基因法比农杆菌介导的组培法具有新的优势：1)不需建立烦琐费时的组织培养再生体系，大大简化实验操作，并且可使没有建立再生体系的植物实现外源基因的导入;2)不需要依赖精密仪器和昂贵药品，在人力、物力、财力上投入更小;3)在短期内可以得到大量的转基因植株，且减少变异株的发生机率［21］.然而，该方法的作用机理目前还不是很清楚，并且还只局限于少数植物，其应用的有效性有待于进一步深入研究.文献［22］利用超声波辅助含目的基因的农杆菌转化油菜萌发种子，通过β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色实验和巢式PCR验证，获得转基因植株.对该方法的报道较少，有待进一步重复实验.3.2.1 基因枪法基因枪法是继农杆菌介导转化法之后又一应用十分广泛的遗传转化技术，它是通过高压将包被外源DNA的微小金粒或钨粒高速射入受体细胞或组织，使外源DNA进入植物细胞并整合到植物染色体组中，从而达到稳定遗传和表达的目的.基因枪法最早是由Sanford等［23］提出的，目前在水稻、小麦、玉米、油菜等十几种植物中均有应用.在国内，侯丙凯等［24］通过基因枪法将苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因(Bt)转入油菜，在国际上首次实现了抗虫基因对油菜叶绿体基因组的定点整合.文献［25］利用基因枪法转化油菜子叶柄叶绿体基因组，对T1代转基因植株分析发现，整合的叶绿体基因组其遗传率约为8%，表明油菜可能是一种适合叶绿体遗传转化的作物.文献［10］也有关于基因枪技术用于油菜遗传转化的报道. 3.2.2 PEG 介导法聚乙二醇(PEG)介导法由 Krens等［26］首先建立，其主要原理是借助细胞融合剂诱导原生质体摄取外源DNA.PEG介导法操作简单、处理量大、融合频率高，且不影响再生，基本上已克服了再生植株嵌合体的发生，也不需要昂贵的仪器设备.但是，这种方法需要进行长时间的原生质体培养和处理，无法把握其处理效果，常常形成多元原生质体融合体.Rasmussen等［27］通过PEG介导法将GUS基因导入油菜的原生质体，认为PEG的浓度是影响转化效率的关键因素.Parihar等［28］研究了热击和紫外线对PEG介导的新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)导入甘蓝型油菜的影响，认为低剂量的紫外线可以提高DNA的摄入和外源基因的表达.近年来也有运用这种方法转化油菜原生质体的报道.Nugent等［29］报道用 PEG介导油菜原生质体和细胞核的转化，并对其转化进行了比较.3.2.3 电激法电激法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电击穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄入.此法最早用于动物细胞的转化，现在植物遗传转化中也广泛使用.电激法是植物遗传转化的一种有效方法，已在悬浮培养细胞、原生质体、组织、花粉、植物胚胎等材料中导入外源基因获得瞬间或稳定表达［30］.Fromm 等［31］首次报道了将电激法应用于植物的转基因.电激法具备操作简单、转化效率高等优点，但需依赖昂贵的仪器，较易造成原生质体的损伤，原生质体的分离和再生较困难，近年来对此方法的报道较少.3.2.4 显微注射法显微注射法是利用显微注射仪将外源基因直接注入到生物的生殖细胞中，从而获得转基因再生植株的一种方法.显微注射法最初主要用于动物细胞外源DNA的导入.Neuhaus等［32］首次报道了利用显微注射法将NPTⅡ基因注入甘蓝型油菜的花粉胚细胞中.但是该方法必须以精细的显微操作技术和细胞低密度培养为基础，并且必须建立固定植物细胞或原生质体的技术，从而导致整个实验过程非常复杂、技术难度大，因此使用率不高.3.2.5 激光微束穿刺法激光微束穿刺法是利用聚焦到微米级的激光微束对组织进行穿刺，引起细胞膜的可逆性穿孔，进而导入外源 DNA的方法.Weber等［33］首先用激光微束穿刺法将荧光酶素基因导入离体油菜的叶绿体中，此后又进一步证实了激光微束可定向地穿透细胞壁和质膜，将外源基因导入细胞和细胞器中.王兰岚等［34］经过多年的探索建立了一套用激光微束向植物细胞导入外源DNA的体系，并在世界上率先得到有分子证据的稳定转化植株.激光微束穿刺法操作简单、受体材料广泛、重复性好、靶向性极强、对细胞损伤小，但转化效率不高、设备复杂、费用较高.3.2.6 花粉管通道法花粉管通道法是利用生殖细胞(花粉)作为载体，结合超声波处理介导外源基因转化的方法.该方法由文献［35］建立并发展起来，成功应用在棉花、高粱、烟草等作物上.杜春芳［36］通过花粉管通道法将GUS基因导入油菜花粉，并证明GUS基因已整合到油菜基因组中.文献［37］利用此方法转化芥菜型油菜得到了抗草甘磷的植株.柴国华等［38］利用花粉管通道法将一个与含油量相关的转录因子WR1的反义序列导入甘蓝型油菜中，经PCR和Southern blot分析，获得了3株转基因植株，通过半定量PCR得出WR1的反义基因成功抑制油菜本身的BnWR1的表达.到目前为止，用于转化油菜的目的基因非常多，其赋予油菜的性质各异.经统计分析，油菜的转化育种主要集中在油菜品质改良、抗性育种和杂交体系中不育系的建立等几个方面.4.1.1 脂肪酸组分的改良油菜脂肪酸主要成分是芥酸、油酸、亚油酸和亚麻酸.近年来对油菜脂肪酸改良的报道主要有：文献［39-40］将脂肪酸延长酶1基因(BnFAE 1)反义表达载体导入油菜，T3代转基因油菜种子芥酸含量下降60.8% ～90.1%，油酸含量大量增加，总脂肪酸含量不变;并利用RNA干扰技术使油菜FAD2基因转录水平显著下降，从而导致转基因油菜 T3代种子中油酸含量增加13.90%～32.20%.Taylor等［41］从小豆蒄中克隆到 3-酮类酰基辅酶合成酶基因(KCS)，在油菜中异源表达，使芥酸含量下降，神经酸含量高达30%，应用于医药及工业生产.Bondaruk等［42］用“猫爪”棕榈酰酰基运送蛋白基因(ACP)转化甘蓝型油菜，使油菜种子中不饱和脂肪和硬脂酸含量增加.芥酸及其衍生物是塑料膜生产行业中重要的可再生原料.Katavic等［43］将拟南芥的FAE1基因和酵母的SLC1-1基因导入甘蓝型油菜，使芥酸含量提高.4.1.2 种子贮藏蛋白的遗传改良通常情况下，油菜种子中油脂和蛋白质占有量分别为40%和20%，种子中的贮藏蛋白主要是napin和cruciferin，分别占种子总蛋白的20%和40% ～50%.文献［44］将编码napin蛋白的反义基因导入油菜品种Westar中，导致其种子中napin含量下降、crucifein含量增加，但蛋白质总量没有变化.Poulsen等［45］将反义 cruciferin基因导入油菜，使cruciferin含量下降、napin含量增加，且赖氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸的含量也增加，从而使蛋白品质大大提高.文献［46］以油菜子叶柄为外植体，通过农杆菌介导，将赖氨酸富含蛋白基因(LRP)导入甘蓝型油菜，油菜种子中赖氨酸含量提高了16.7%.文献［47］将一个裂殖子表面蛋白-1基因(MSP-1)和一个环孢子蛋白基因(CSP)拼接成一个新基因，命名为MLC，在甘蓝型油菜中表达，得到一种约25 kDa的蛋白，经验证重组蛋白可用作医疗诊断的抗原和抗疟疾用疫苗.4.2.1 抗除草剂基因目前用于转化的基因主要为2种：抗草甘磷基因和抗草丁磷基因.草甘磷是目前普遍使用的非选择性除草剂，可控制世界上大多数有害杂草，对动植物无毒性，会很快被土壤微生物分解.美国Monsanto公司将抗草甘磷的EPSP合成酶基因导入油菜，得到抗草甘磷除草剂的油菜，并实现商业化.草丁磷是一种谷酰胺合成酶的抑制剂，抗性基因有2个：一个是克隆自土壤细菌Streptomyces hygrocopicus的BAR基因;另一个是Ghufosinate抗性基因 PAT，来自 S.viridochromogenes，2个基因表达产物有相似的催化能力.加拿大等国已育成了带BAR基因的抗草丁磷油菜新品种，并已开始田间实验［48］.Miki等［49］在拟南芥中克隆出Ahyclroxyacid合成酶基因(AHAS)突变体，将其导入油菜，使油菜具有咪唑基除草剂的抗性.4.2.2 抗病虫害基因近年来对于提高油菜抗病虫害的研究较多.文献［50］将孢子囊和几丁质酶基因导入油菜中，得到的转基因油菜具有很强的抗小菜蛾和核盘菌能力.郑巨云等［51］将苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白基因(Bt)和反枝觅菜凝集素基因(ARA)构建成双价基因表达载体，并将其转化至油菜中，得到抗性小植株.蓝海燕等［52］将β-1，3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因导入油菜，获得转基因油菜植株的抗菌核病的能力明显强于对照.另外，抗黑胫病基因、抗根肿病基因、抗黑腐病基因、抗黑斑病基因等都已得到转基因植株［8］.4.2.3 抗非生物逆境干旱、高低温、重金属、高盐碱、强紫外线等非生物逆境的存在，使植物面临着很大的生存压力，于是人们通过基因改造来使植物具有逆境抗性.文献［53］将拟南芥的液泡Na+/H+反向运输蛋白基因导入油菜中，获得可以在高盐条件下正常生长的转基因油菜，其产量与质量变化不大.文献［54-55］分别将冷诱导基因的转录因子CBF1和抗旱基因COX转入油菜，得到抗寒性和抗旱性提高的转基因材料.Gasic等［56］将拟南芥的植物络合素基因导入到芥菜型油菜中，得到稳定表达的转化株，油菜对镉和锌的抗性增强.文献［57］在油菜中异源表达肌醇多磷酸化激酶基因(ThIPK2)，转基因植株表现为具有较强的抗盐、抗干旱、抗氧化等能力. 通过杂种优势进行油菜育种一直是油菜生产国所重视的.传统的途径是通过细胞质“三系”杂种、细胞核不育杂种、化学杀雄杂种和自交不亲和杂种进行育种.然而，它们都存在一定的局限性.随着分子生物学的迅速发展，通过基因工程技术培育新的杂种生产体系成为了可能.Mariani等［58］首先提出了创造不育系、恢复系及保持系的思路，将编码核糖核酸酶基因barnase置于烟草花药绒毡层特异表达的启动子TA29后，并与BAR基因形成嵌合基因，然后转化油菜，得到雄性不育系;之后又在Bacillus amyloliquefaciens细胞中发现一种核糖核酸酶抑制蛋白BARSTAR，能与BARNASE蛋白高效结合形成稳定的复合物，从而抑制BARNASE的活性，植株可以正常发育成熟的花粉粒，恢复油菜育性，保持系为原来未转基因油菜植株.该杂交生产模式已在加拿大应用于生产.Gupta等［59］将一个α-tubulin：rolB 基因导入油菜，转基因油菜表现为雄性不育.至今，油菜转基因及其应用已取得了长足的进展，油菜转基因体系日臻成熟，但仍存在较多的缺陷和有待解决的问题：1)提高油菜转化体系的稳定性及转化率近年来伴随着转基因技术的快速发展，作为经济作物的油菜，其研究受到关注.研究表明，油菜遗传转化体系的建立主要受以下因素的影响：基因型、受体材料、苗龄、湿度、光照等环境因子及植物激素、抗生素和Ag+离子等.随着对油菜基因转化研究的不断深入，已有越来越多的油菜栽培品种应用于基因的改良，特别是对于油菜转化体系的优化，使油菜遗传转化体系趋向于稳定，特别是农杆菌介导的花絮浸泡方法，不受品种的限制，前景更开阔.2)提高转基因油菜外源基因的表达调控及其遗传稳定性目前导入的外源基因整合到油菜基因组中是随机的，其表达水平、表达部位、表达时间等都存在不确定性.另外，由于外源基因是随机插入的，其在油菜基因组中的拷贝数是不确定的，并且常常会出现外源基因的沉默，或转基因植株为嵌合体(chimera).因此，转基因植株应尽量避免外源基因的沉默和嵌合体的形成.为了更好地优化油菜遗传转化体系，我们仍需对油菜的生长发育分子机理进行深入的研究，使用其本身特定的启动子、优化转化方法等策略来避免这些问题，并提高其遗传稳定性.3)转基因油菜的安全性问题随着基因工程改良作物的增加及其国际性产业化趋势的扩大，转基因作物的安全性已成为全球性的热门话题.首先，转基因油菜环境释放后是否会对其他生物造成危害或影响，如：抗病虫害基因是否也会毒杀一些有益的昆虫和动物?抗除草剂基因是否会使得一些杂草经过环境选择后变成超级杂草或它自身也可能杂草化?其次，转基因油菜环境释放后，由于遗传物质的横向传递，对一些野生物种可能会造成污染，特别是亲源关系很近的植物.浦惠明等［60］研究了转基因抗除草剂油菜对近缘作物的基因漂流，发现对芸苔属黑芥、埃芥、芥菜型油菜、白菜型油菜、甘蓝型油菜的漂移率为0.02% ～3.00%.李键等［61］研究发现转基因油菜的外源Barstar基因向周围非转基因油菜和新疆野生油菜进行转移.宋小玲等［62］研究发现抗草丁磷油菜和抗草甘磷油菜与野芥菜田间隔行种植分别产生0.020%和0.014%的携带抗性基因的F1杂种.Gressel［63］就转基因油菜种子特性表达基因的漂流问题进行了报道.最后，转基因油菜在食用方面是否是安全的?这一系列的问题都需要去解答.总之，自人类获得第一株转基因植物至今20余年时间里，植物基因工程的研究与应用已取得了重大的进展.转基因油菜的研究与生产备受瞩目，特别是随着世界能源和粮食危机愈演愈烈，科学家在努力寻找石油的替代品，生物柴油成为解决这些问题的关键途径之一，而油菜作为最重要的油料作物之一成为制造生物柴油的最佳选择.另外，据中国油粮信息网数据显示，2009年我国油菜籽的播种面积预计为3 070万hm2，产量约占世界总产量的22.5%，提供的菜籽油占全国食用油的40%～45%，油菜在我国国民经济中的地位举足轻重.因此，培育优质高产的油菜新品种势在必行.特别是近年分子生物技术应用于油菜育种，大大加速了油菜育种的进程，在我国已有很多实验室成功建立了油菜遗传转化体系.我们在正确认识和解决油菜转基因问题的同时，要很好地利用转基因油菜的发展潜力.【相关文献】［1］Horsch R，Fry J，Hoffmann N，et al.A simple and general method for transferring genes into plants［J］.Science，1985，227(4691)：1229-1231.［2］Moloney M M，Walker J M，Sharma K K.High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors［J］.Plant Cell Reports，1989，8(4)：238-242.［3］Maheshwari P，Selvaraj G，Kovalchuk I.Optimization of Brassicanapus(canola)explant regeneration for genetic transformation［J］.New 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专利名称：转基因油菜Ms1事件外源插入载体旁侧序列及其应用
专利类型：发明专利
发明人：卢长明,吴刚,武玉花,肖玲
申请号：CN200710051360.4
申请日：20070124
公开号：CN101020910A
公开日：
20070822
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种转基因油菜Ms1事件外源插入载体旁侧序列及其应用，涉及生物工程技术领域中转基因油菜的检测。

本发明以转基因油菜品种Ms1Rf1为材料，获得Ms1事件外源插入载体旁侧序列，序列为SEQ NO.1。

其中第1－330位碱基与插入载体序列相同，第331－2446位碱基与插入载体无同源性，为油菜基因组序列。

本发明建立了转基因油菜外源基因整合事件Ms1的事件特异性定性、定量检测方法，用于建立转基因油菜Ms1Rf1和Ms1Rf2的其他事件特异性PCR检测方法研究。

申请人：中国农业科学院油料作物研究所
地址：430062 湖北省武汉市武昌区徐东二路2号
国籍：CN
代理机构：武汉宇晨专利事务所
代理人：黄瑞棠
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转基因抗除草剂油菜与十字花科植物间的基因流研究
近年来,转基因抗除草剂作物在全球范围内大量种植。

与此同时,也带来了一定的生态风险,主要风险之一是抗性转基因通过花粉漂流转移到野生近缘植物,导致这些植物产生抗性,从而形成“超级杂草”。

因此,在转基因作物商品化生产之前,对转基因作物与近缘植物间潜在的基因流进行评估是完全必要的。

油菜是世界四大油料作物之一,属十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)作物。

十字花科植物种类繁多,许多植物表现为异花授粉并具有较高的种间杂交亲和性,这些生殖特性喻示着外源基因在该科植物间存在潜在的逃逸风险。

本试验通过苯胺蓝荧光法观察、人工杂交、混合花粉蒙导授粉并结合人工授粉后代的分子鉴定,研究了甘蓝型抗草甘膦油菜Q3与15种十字花科植物(包括芸薹属油料作物的3个种、5种蔬菜作物和7种野生杂草,共16个材料)间的杂交亲和性、自然授粉条件下Q3与这些材料间的基因流频率以及抗除草剂基因在污染植株中的遗传传递能力,以期为转基因抗除草剂油菜的生态安全性评价提供科学依据。

主要研究结果如下:(1)荧光显微镜观察结果表明,甘蓝型油菜(B. napus)、白菜型油菜(B. campestris)、芥菜型油菜(B. juncea)、二倍体小白菜(B. chinensis)、四倍体小白菜(B. chinensis)、大白菜(B. pekinensis)、雪里蕻(B. juncea var multiceps)、甘蓝(B.。

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2005,13(3):267~275*基金项目：国家科技部转基因专项(No.04-B-1)和中国农业科学院杰出人才基金资助。

卢长明：男，1959年生，研究员，博士，博士生导师，中国农业科学院杰出人才。

E-mail：<cmlu@>.收稿日期：2004-10-8接受日期：2004-12-28·专家论坛·中国转基因油菜的环境安全性分析*卢长明肖玲武玉花(中国农业科学院油料作物研究所，武汉430062)摘要:根据中国转基因油菜研究和环境释放的现状，对中国环境条件下转基因油菜的生存竞争能力、基因扩散风险以及对生物多样性影响等环境安全问题进行了分析。

分析认为，中国是许多十字花科植物进化起源中心和生物多样性中心，生态环境类型复杂；转基因油菜的外源基因可以通过花粉向油菜()、白菜()和芥菜()类植物扩散；中国转基因油菜的基因扩散风险高于其它作物。

在中国，油菜的转基因技术相当成熟，油菜的转基因实验频次很高，涉及的基因种类繁多，进口的转基因油菜数量巨大，隐患不容忽视。

在中国，转基因油菜的安全性管理和研究相当薄弱，检测和监测手段无法满足安全管理需求，这一现状必将阻碍中国转基因油菜的产业化进程，并对中国环境安全带来隐患。

作者提出，加强转基因油菜的环境安全意识，加强中国转基因油菜的安全管理及其措施的落实，加强转基因油菜检测和监测等技术平台的建设。

关键词：转基因油菜；环境释放；风险评估Ecological Risk Assessment of Transgenic Rapeseed in ChinaLU Chang-Ming XIAO Ling WUYu-Huaview of the current status of research and environmental release of transgenic rapeseed worldwide,the environmental risk was assessed focusing on competitive survival ability,gene dispersal and biodiversity impact of transgenic rapeseed in China. Complicated in ecological conditions,China is the centre of evolutionary origin and biodiversity of many crucifer species.Transgene may transfer from to vegetable and wild species of and.In China genetic transformation techniques of rapeseed()has well been established and genetic transformation experiments are frequent with a variety of genes transferred and without severe management.A large quantity of transgenic rapeseed is imported to China each year.It is concluded that transgenic rapeseed poses higher risk of gene dispersal than other crops do in China.It is appealed that biosafety consciousness of transgenicrapeseed should be strengthened,and a technical platform of GMO detection and monitoring should be properlyestablished.transgenic rapeseed;environmental release;risk assessment随着转基因技术日渐成熟，转基因作物产业化已成为不可阻挡的态势。

两种抗除草剂转基因油菜和野芥菜的回交1代子代的染色体行为研究由于油菜属于常异花授粉作物,且能产生大量的花粉,同时在自然环境中存在许多野生近缘种,因此抗除草剂转基因油菜(Brassica naapus,2n=38=AACC)的抗性基因能否渗入(introgression)到野生近缘种,特别是近缘杂草中倍受关注。

一旦成功渗入,将会对农田生态环境造成很大的威胁。

抗性基因能否成功渗入到野生近缘种除取决于转基因作物能否和近缘种发生初始杂交外,还和以下因素密切相关(1)转基因在杂交和回交后代中的持续传递及表达能力;(2)后代染色体的重组、整合和遗传的稳定性;(3)携带转基因的后代在自然环境中的生存、定植能力。

国内外对转基因油菜的抗性基因向近缘种的漂移频率、抗性基因在后代中的传递规律及后代适合度等方面的研究有较多报道,但对后代染色体的组成和遗传稳定性尚没有连续的跟踪报道。

在我国野芥菜(B.junceavar.gracilis)是与转基因油菜亲缘关系最近的杂草。

本实验室前期对抗草甘膦和草丁膦转基因油菜的抗性基因在后代中的传递规律及后代的适合度进行了研究,发现经除草剂筛选后,抗草甘膦转基因油菜的后代存活率明显高于抗草丁膦转基因油菜的后代,同时发现随着自交代数的增加,携带抗草甘膦基因后代的适合度提高速度快于携带抗草丁膦基因的后代。

但对两种转基因油菜与野芥菜回交后代的染色体组成和稳定过程尚未开展研究。

本文在前人的研究基础上,以抗草甘膦转基因油菜(DS-Roughrider,Roundup Ready,event RT73,抗性基因位于A-染色体组)与野芥菜的正反回交1代子1-4代(BClmFR2-5和BClpFR2-5),以野芥菜为母本的回交称为正向回交,用m表示,以野芥菜为父本的回交称为反向回交,用p表示)和抗草丁膦转基因油菜(Swallow,Liberty Link,event HCN92,抗性基因位于C-染色体组)与野芥菜的正反回交子1-5代(BClmFL2-6和BClpFL2-6)为研究对象,利用传统细胞遗传学方法及荧光原位杂交技术分析了后代染色体数量及组成,并对回交1代子4代植株的减数分裂进行了观察。

油菜含油量及转基因研究进展姓名童晋学号82101051033 专业作物遗传育种油菜是世界重要的油料作物，是仅次于大豆的第二大植物油脂来源，其种植面积和总产量在主要油料作物中占有相当大的比例。

油菜是中国继稻、麦、玉米、大豆之后的第5大作物，在农业生产上占有重要地位。

系统育种和杂交育种是作物品质改良的基本手段，油菜脂肪酸品质改良的早期工作大多采用这些方法进行，并且取得了卓越成效。

诱变育种方法针对单个目标性状的改良往往是有效的。

植物脂肪酸代谢工程是通过向植物导入新的酶基因，或者促使已有的酶基因的超量表达以及采用反义RNA和共抑制作用等降低内源酶基因的表达水平，从而达到控制脂肪酸合成过程的遗传操作工程。

基于生物化学对脂肪酸代谢途径日益透彻的了解和遗传操作技术不断成熟，使人们通过有目的地调控脂肪酸代谢过程以生产高价值的植物油脂成为现实。

自从1985年获得第1例转基因甘蓝型油菜以来，人们越来越重视通过基因工程的方法改良油菜品种。

油菜基因工程目前研究的重点主要放在转化的目的基因，再生体系的建立和遗传转化的方法(段英姿et al., 2003; 吴晓亮and 陶澜, 2004)。

转化的目的基因主要是品质改良基因和抗性基因。

再生体系的建立，主要有子叶、下胚轴为外植体的再生体系；原生质体再生体系；小孢子再生体系。

转化方法：生物介质介导的遗传转化，目前应用的生物介质主要是根癌农杆菌(Agrobacteritun aunefaciens)和发根农杆菌(Agrobacferium rhizobitun)；PEG法；基因枪法；显微注射法；电激法。

转化的目的基因的研究，是油菜基因工程研究的重点与难点。

选择正确的基因进行正调控或者负调控，从而到达对含油量、脂肪组分、产量、生长性状、抗病、抗虫、抗逆等方面的改变，获得更具经济价值的转基因作物，是当前的热点。

截止2002年，转基因油菜种植面积为300万公顷，占全球油菜种植面积的12％，其中加拿大转基因油菜种植面积已占油菜种植总面积的60％以上。

油菜转基因技术研究进展作者：成日辉匡代勇杨源树唐伟杰邓力超来源：《现代农业科技》2016年第02期摘要随着转基因技术的深入发展，用于转化的目的基因越来越多。

目前转基因技术已运用到油菜研究的各个领域。

本文概述了油菜转基因研究的几个方向以及基因转化方式，并探讨了油菜转基因研究中的一些问题。

关键词油菜；转基因技术；目的基因中图分类号 S565.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）02-0020-03Abstract With the deeper development of transgenic technology，the target genes used in transformation are increasing. Nowadays， transgenic technologies have been applied to various fields of rapeseed researchs. This paper summarized several directions for the transgenic research on rapeseed and gene transformations，and discussed some problems in the transgenic research on rapeseed.Key words rapeseed；transgenic technology；target gene油菜是我国第一大油料作物，常年种植面积超过666.67万hm2，总产量约1 400万t，年产菜籽油约500万t，占自产植物油总量的45%[1-6]。

在我国，油菜的育种和改良工作一直都受到重视。

长期以来传统的常规育种技术在油菜品种选育改良方面取得了一定的成功，选育出了很多具有代表性的新品种，但同时也存在诸如缺乏亲本材料、远缘杂交不亲、选育年限过长等问题。

植物农杆菌介导的外源基因转移技术及其应用近年来，随着生物学和生物技术的不断发展，基因转移技术也得到了重要的突破。

植物农杆菌介导的外源基因转移技术（agrobacterium-mediated transformation）成为了一种非常常见的基因转移方法，被广泛应用于农业、植物生理学、生物技术等领域。

本文将详细介绍这一技术及其应用。

一、植物农杆菌介导的外源基因转移技术原理植物农杆菌是一种生活在土壤中的细菌，广泛存在于自然环境中。

该细菌有着自身特殊的基因转移系统，能够将其自身的T-DNA（转移DNA）序列转移到宿主植物的染色体中。

这一转移系统是由植物农杆菌在与宿主植物接触的过程中产生的，它通常被称为“水平基因转移”。

agrobacterium-mediated transformation技术就是通过利用植物农杆菌的这一转移系统，将人工构建的外源DNA序列转移到宿主植物的DNA中，实现基因转移的过程。

一般而言，该技术可以分为以下几个步骤：1.构建转化载体。

将外源DNA与植物农杆菌的转化载体pTi（T-DNA合成区）组装成转化载体，在该载体上加入适当的激活元件和标记元件，以便对转化结果进行筛选和鉴定。

2.感染宿主植物。

将构建好的转化载体稀释至适当的浓度后，在适当的营养条件下，静置一段时间使之与宿主植物接触，从而实现转移。

3.筛选转化率。

应用适当的筛选方法，对转化结果进行筛选，得到所需的转化率。

二、应用1.基因研究植物农杆菌介导的基因转移技术已被广泛应用于生物学领域中的基因研究。

该技术可以使研究人员将人工合成的DNA序列导入到宿主植物中，从而构建各种生物表型。

利用该技术，可以对特定的基因进行定向研究，解析其特性及功能。

2.品种改良与其他农业生产方法相比，植物农杆菌介导的基因转移技术拥有一些独特的优势。

例如，它可以方便地实现外源基因的稳定表达，并且可以避免其他基因编辑技术可能带来的副作用。

因此，该技术已被广泛应用于植物品种的改良中，使得研究人员可以进行一些关键基因的定向编辑，以实现农业产业的高效生产。