碘化钠法提取牦牛基因组DNA的研究

成粉末 状 ，并在 样品 经裂解液处理后 先 离心除去 其 中尚未完全溶解 的纤维，然后进行 Ｐ Ｃ Ｒ 扩 增是 比较有 利 的，完全 能够得到 满
足Ｐ Ｃ Ｒ 扩增要求 的Ｄ Ｎ Ａ 样品。 ［ 关键词］牦牛绒 Ｄ Ｎ Ａ 提取方法 ห้องสมุดไป่ตู้证
ａ Ｋ ａ Ｒ ａ Ｍｉ ｎ ｉ Ｂ Ｅ Ｓ Ｔ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ａ ｌ Ｇ ｅ ｎ ｏ ｍ ｉ ｃ Ｄ Ｎ Ａ Ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｋ ｉ ｔ 牦牛是高寒地带的特有畜种，主要生活在海拔３ ０ ０ ０ ｍ以上 。 取 试 剂盒 Ｔ ｒ ． ５ ． ０（Ｔ ａ Ｋａ Ｒａ Ｃ ｏ ｄ ｅ ． ９ ７ ６ ５），Ｐ ｒ ｅ ｍｉ ｘ Ｅ ｘ Ｔａ ｑ （ Ｐ ｒ ｏ ｂ ｅ ｑ Ｐ Ｃ Ｒ） 我 国具 有 非 常 丰富 的牦 牛 毛纤 维 资 源 ］ 。牦 牛 绒 主要 作 为 纺 织用 Ｖｅ 高 档 纤维 原 料 ；牦 牛 毛作 为 毡 制 品 、绳 索 等 低 附加 值产 品原 料 ， （ Ｔ ａ Ｋ ａ Ｒ ａ Ｃ ｏ ｄ ｅ ． Ｒ Ｒ ３ ９ ０ Ａ），１ ０ ０ ％乙醇 ，Ｄ Ｎ Ａ Ｌ ａ ｄ ｄ ａ ｒ Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ 。
中国畜牧兽 医文摘
２ ０ １ ５ 年
３ １ 卷
第２ 期
基 础 科 学
牦牛绒Ｄ Ｎ Ａ 的提 取及验证
王 玫 任 亮 子 Ｌ平 肇慧君 颜怀 玉 杨春光
（ 辽宁 出入境检验检疫局 ，辽宁大连 １ １ ６ ０ ０ １ ）
［ 摘 要］ 提取Ｄ Ｎ Ａ 是 利用Ｐ ｅ Ｒ 技 术检 测纤维 的关键技 术难点 。对 牦牛绒Ｄ Ｎ Ａ ＠提取方法进行 了试验 ，通过Ｐ Ｃ Ｒ 扩增 的方 法进 行验证 。结果表 明：使用Ｔ ａ Ｋ ａ Ｒ ａ Ｍ ｉ ｎ ｉ Ｂ Ｅ Ｓ Ｔ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ａ １ Ｇ ｅ ｎ ｏ ｍ ｉ ｃ Ｄ Ｎ Ａ Ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｋ ｉ ｔ Ｖ ｅ ｒ ． ５ ． ０试剂盒 ，将 纤维样 品尽量 处理

品 的ＤＮＡ样 品（分 别 取２００ｎｇ）， 用ＥｃｏＲ Ｉ和Ｍｓｅ Ｉ两 种 限 制 性 内 切 酶 进 行 双 酶 切 ， 然 后 加ＥｃｏＲ Ｉ和Ｍｓｅ Ｉ接 头进行连接， 再用ＥｃｏＲ Ｉ＋Ａ和Ｍｓｅ Ｉ＋Ｃ两 条引物进行 ＰＣＲ预扩增（反应体系采用９４℃预变性２ｍｉｎ、９４℃ ３０ｓ、 ５６℃ ３０ｓ、７２℃ ６０ｓ， 最后７２℃延伸５ｍｉｎ， 循环数２０）， 预扩增产物在１％的琼脂糖凝胶 电泳上进行 检 测 ， 在 紫 外 灯 上 进 行 观 察 ［１０］。
近年来， 随着疯牛病、羊瘙痒病、口蹄疫、禽流 感等一些疾病在欧洲及世界各国的流行， 以及一些 动物源食品掺假造假现象的普遍产生， 对食品、药 品， 以及饲料产品成分进行动物源性鉴定， 已经成 为一个备受关注的问题［１］。随着生物技术 的发展， 以 ＤＮＡ为 基 础 的 ＰＣＲ技 术 广 泛 被 用 来 鉴 定 食 品 中 的 动 物 源性， 由于ＰＣＲ方法比较简便， 特异性和灵敏度都很 高， 国内外已经运用该技术和其他技术结合建立了 多种鉴定食品动物源性成分的方法， 如常规ＰＣＲ、多 重 ＰＣＲ、 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ、 定 量 竞 争 ＰＣＲ、 ＲＡＰＤ－ ＰＣＲ和ＡＦＬＰ－ ＰＣＲ等 ［２－７］。而高质量、高纯度的基因组 ＤＮＡ的 获 得 则 是 开 展 该 方 面 研 究 工 作 的 前 提 。 目 前 ， 有 关 动 物 肉 制 品 基 因 组 ＤＮＡ提 取 方 法 的 报 道 较 少 ，
本试验以猪肉、牛肉和羊肉３种动物的生鲜肉为原 料， 利用改进的ＳＤＳ方法， 建立了一种有效的动物源 食品基因组ＤＮＡ的提取方法。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料 新鲜猪肉、牛肉、羊肉： 市售。
１．２ 试验仪器 Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ， Ｓｙｓｔｅｍ ２７００： Ｓｉｎｇａｐｏｒｔ； ３Ｋ１８

工业上常用稀碱和浓盐酸法提RNA，用这 ， 工业上常用稀碱和浓盐酸法提 两种方法提取的核酸均为变性RNA。主要 两种方法提取的核酸均为变性 。 用于制备核苷酸的原料。其工艺较简单， 用于制备核苷酸的原料。其工艺较简单， 浓盐法是用10％氯化钠的溶液， 浓盐法是用 ％氯化钠的溶液，在90摄氏 摄氏 度提取3—4小时，冷却，离心，上清液乙 度提取 小时，冷却，离心， 小时 醇沉淀RNA。稀碱法用 醇沉淀 。稀碱法用0.2％氢氧化钠是 ％ 酵母裂解，然后酸中和，除蛋白和菌体， 酵母裂解，然后酸中和，除蛋白和菌体， 上清液乙醇沉淀的RNA ,或调核酸等电点 上清液乙醇沉淀的 或调核酸等电点 PI2.5沉淀。 沉淀。 沉淀
DNA含量的测定 含量的测定
原理：
强酸、加热条件下，可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核 糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核 苷酸。其中 2ˊ脱氧核糖在酸性环境中成为ω― 羟基 ―γ― 酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm 处有最大吸收。DNA在40-400µg范围内光密度与DNA浓度 成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其 他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量RNA时不影响 测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与 二 苯 胺 形 成 各 种 有 色 物 质 ， 干 扰 测 定 。
思考题
二苯胺法测定DNA，为什么加乙醛，作用是什 么？ 除杂质常用那些方法？
经常采用三种方法去除蛋白
用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材 料中提取DNA 苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、 DNA 离心蛋白变性，因而抑制了核酸酶活性，并且操 作过程比较缓和，可以得到较好的DNA制品 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化， 离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层， 可将DNA沉淀出来

３ ． 犍 为县 畜牧 局 ，四 川 犍 为 ６ １ ４ ４ ０ ０ ）
摘
要 ：根据 Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ检 索到的普通 牛的 Ｉ Ｎ ＨＢ Ａ 基 因序 列设计一对特异性 引物，以牦牛卵 巢组织总 Ｒ Ｎ Ａ 为模板 ， 通
过Ｒ Ｔ － Ｐ ＣＲ 技 术对牦牛 Ｉ Ｎ ＨＢ Ａ ｅ ＤＮ Ａ进行克隆测序和序列分析．结果表 明： 扩增 片段 Ｉ ３ ６ ０ ｂ ｐ ，包含 １ ２ ７ ７ ｂ ｐ的编码 区．编
制素的水平能反映出发情周期中卵泡生长的数量， 是决定动物排卵的关键调节激素¨ ． 牦牛是青藏高原的一个特有畜种， 分布于海拔 ３ ０ ０ ０ ｍ 以上， 能适应高寒、低氧等极端生态条件¨ ‘ ’ 。 ， 是青藏 高原畜牧业的支柱， 在遗传资源上是一个极为宝贵的基 因库¨ ． 然而牦牛的繁殖性能相对低下， 在如何提高牦 牛繁殖形状的课题上，国内外进行 了大量的科学研究． 本研究对牦牛 Ｉ Ｎ Ｈ Ｂ Ａ基 因编码区进行克隆分析， 并通过
抑制素是一种主要由雄性睾丸支持细胞… 和雌性 卵巢颗粒细胞分泌 的二聚体糖蛋白激素． 抑制素属于转 化 生长因子 １ ３ （ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍ ｉ ｎ ｇ ｇ ｒ ｏ ｗ ｔ ｈ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ － Ｊ ３ ， Ｔ Ｇ Ｆ ． Ｄ ） 超家族成员， 该家族成员主要参与体 内各种影响细胞生长和分 化的功能 ｊ ． 抑制素主要有 Ｉ Ｎ Ｈ Ａ 、 Ｉ Ｎ Ｈ Ｂ Ａ和 Ｉ Ｎ Ｈ Ｂ Ｂ三种类型的亚基． Ｉ Ｎ Ｈ Ａ亚基上具有糖基化位点， Ｉ Ｎ Ｈ Ａ亚基 分别与 Ｉ Ｎ Ｈ Ｂ Ａ和 Ｉ Ｎ Ｈ Ｂ Ｂ亚基之间通过二硫键连接而成异质二聚体 Ｊ ， 即抑制素 Ａ （ ｃ ｚ ｌ Ｂ Ａ ） 和抑制素 Ｂ （ ａ ｌ ３ Ｂ ） ． 许多 动物实验研究证实抑制素可 以抑制 ｒ 在垂体中的分泌 ， 是哺乳动物 Ｆ Ｓ Ｈ 分泌的主要负反馈调节因子． 抑

0.8 体积预冷的异丙酶，沉淀 DNA; 12000r/min 重温离，t，\5min ，奔上清 液;用 70%Z.醇洗沉淀两次，晾芋， 使用 50μL TE 缓冲液溶解 DNA 汩淀， 待测或于 -20.C保存备用。
2.1.3 试剂盒法
参照说明书。 2.2 实时荧光 PCR 1J法检测
2.2.1 实时荧光 PCR 方法 [!HD]
高速离心机、核酸蛋白分析仪、荧 光定量 PCR~地 CTAB(生工)、 EDTA(暑 云天)、 50S (主工)、 DNA 提取
试剂盒(天根)、 2XTaqMan Fast qPCR Master Mix (生工)。 2 实验万法 2.1 火锅底料申 DNA 的提取后法研究
2.1.1 改良 CTAB 法同
次; 12000 r/min 商，~5min，取上清
液 700队，加入等体积的氯仿-异成
醇 (24 : 1) ，轻缓颠倒 15s 后室温 静置 1 min; 120∞ r/min 室温下离心 10 min; 转移上清液于一新的1.5 ml
离心售中，加入 0.8 倍体积预冷的异
丙醇，颠倒混匀后于 -20.C静置 1-2 h 沉淀 DNA; 12 000 r/min 重温离，心 10 min ，奔去上清液，用 70% Z.醇洗
涤沉淀两次。晾干，使用 50μL TE 缓 冲液溶解 DNA 沉淀，待测或子 -20.C 保存备用。
2.1.2 改良 505 法问 在 2 mL 离心管申加入 100 mg 样 晶，加入 1 mL20%SD5 混匀，臼。C 水浴 30 min ，期间颠倒数次;加入
200μL 3 moljL NaAC 溶液混匀， 4.C 15000 r/min 离心 10 min; 取上清液 加等体积氯仿-异成醇 (24 : 1) 温匀， 12000 r/min 室温离心 2min ，加入

RNA含量（本次试验）
地衣酚 (orcinol)，又称“3，5-二羟基甲苯”、“5-甲基间苯二酚”、“苔黑酚”。化学 式C7H8O2.H2O。
原理：当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛，后者与地衣 酚反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰， RNA浓度在20 ~ 200μg/mL范围内，光吸收与RNA浓度成正比。
等
思考题
RNA 提取方法有几种？有什么优 缺点？ RNA 提取过程中应注意什么？
DNA的提取及含量测定
在动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子，植物种子的胚 中都含有丰富的DNA； 微 生 物 中 ， 面 包 酵 母 含 4% ， 啤 酒 酵 母 含 6% ， 大 肠 肝 菌 含 9%~10%。 本实验：将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸 钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使 其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质， 也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。
• 除杂质：加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟， 8000 r/min离心7分钟，取上 层液量好体积，倒入烧杯中（离心管）（现象？），加同体积的氯仿-异戊醇混合液， 重复上次操作（现象？）。直至界面不出现蛋白凝胶为止；
• 沉淀：准确量取上清液体积， (1/10体积3mol/L NaAC溶液), 加2倍体积95％冷乙醇，搅 拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分 钟，得白色沉淀（质量？）；
生物化学实验II
动物基因组DNA、总RN 的提取及含量测定
目的要求
• 学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技 术；

表２
１’ａｂＩｅ ２ ＣＴ Ｖａｌｕｅｓ ０ｆ
４种方法提取的ＤＮＡ实时荧光ＰｃＲ扩增ｃＴ值
ｒｅａＩ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｍｐＩｉｎｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ４“ｎｄｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈＯｄｓ
万方数据
第７期
石盼盼，等：４种方法提取牛肉干ＤＮＡ的效果比较
２９２３
ｎｍ是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，Ａ２６０／Ａ２３０比 值表示糖类、盐分等的去除情况，纯度较好的ＤＮＡ溶液此
比值为２．０。若比值小于２．０说明样品中碳水化合物（糖类）、 盐类或有机溶剂含量较高。本实验结果如表１所示，从整 个提取过程耗时来看，０ＭＥＧＡ试剂盒法耗时最长需８～１２
ｐｌｕｓ小型离心机（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；微量紫外分光
ＤＮＡ胁ｍ ｂｅｅｆｊｅｒｂ ｓ砌ｐｌｅ．ＴＡＫＡＲＡ ｋｉｔ
ｆｏｒ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ，ａｎｄ
ｍｅｔｈｏｄ
ｈａｄ ｔｈｅ ｓｈｏｎｅｓｔ ｔｉｍｅ－ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ ｏｆ ０．５ ｈ，ＯＭＥＧＡ ｌ【ｉｔ ｍｅｔｌｌｏｄ ｃｏｕｌｄ ｇｅｔ ｇｏｏｄ ｐｕｒｉｔ），ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ Ａ２６０／Ａ２８０ ｏｆ １．８０， Ｔｉａｎｇｅｎ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｓｍａｌｌｅｓｔ ＣＴ ｖａｌｕｅ ｇｅｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ
＋通讯作者：石盼盼，助理工程师，主要研究方向为食品检验。Ｅ＿ｍａｉｌ：５２３ １５０９２０＠ｑｑ．ｃｏｍ
＋Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＳＨＩ
ＰａＩｌ—Ｐａｎ，Ａｓｓｉｓｔ卸ｔ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒ，ＩＩｌｓｔｉｔＩｌｔｅ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ
Ｑｕａｌ时ＳｕｐｅⅣｉｓｉｏｎ

仪器：低温高速离心机、漩涡振荡器、 核酸/蛋白质定量紫外分光光度计、移液 枪（100ul，200ul,1000ul）
试剂：0.9%NH4Cl 、PH8.0的TE缓冲液 、 生理盐水、氯仿、异戊醇、异丙醇，无 水乙醇，5mol/L碘化钾。

四、实验步骤

(一)DNA的提取 1、取EDTA-K2抗凝血300μL加入到1.5 mL Ep
水相层，转移到新的Ep管中； 7、加入180μL异丙醇于Ep管中，轻轻混匀， 12000r/min低温（4oC）离心5 min，


8、弃上清，加无水乙醇1.0 mL，放置5-
10min，12000 r/min低温（4oC）离心5 min， 弃去无水乙醇，待干燥。

9、加入25μLPH8.0的TE缓冲液溶解DNA。
基因组DNA的分离和纯化
一、实验目的

1、掌握利用漩涡振荡 器、核酸/蛋白质定量紫外分光光度计。

二、实验原理

1.碘化钾法提取DNA的原理：利 用氯化铵形成的低渗环境破坏红细胞， 后经碘化钾短时间破坏白细胞及其核膜， 再通过氯仿/异戊醇等蛋白变性剂沉淀蛋 白质、脂质及残存细胞碎片，最后异丙 醇沉淀基因组DNA，乙醇洗涤并除去异 丙醇，提取的基因组DNA用TE溶解。
五、实验结果观察

1、吸取5ulDNA样品，加PH8.0的TE缓冲液至
100ul，混匀后，装入紫外分光光度计的一次 性比色杯中。

2、用100ul的PH8.0的TE缓冲液为空白管调零。

3、读取仪器显示的A260与A260/A280两个值

4、DNA浓度=A260x20x50/1000（ug/ul） ； DNA纯度=A260/A280。

3) 离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相 中间，而DNA位于上层水相中
4) 用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
三、动物基因组DNA的提取
（2）阴离子去污剂法:
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性, 可以直接从生物材料中 提取DNA。
由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合, 而阴离子 去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。
4）加入8μl的蛋白酶 K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是 37℃效果要好些）。
5）每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以 5500rpm，离心15min。
6）取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇（24：1），摇 匀10min，以5500rpm，离心15min。
微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
2）破碎抽提核酸除去杂质 首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它
（cpDNA），质粒DNA。
RNA（核糖核酸）
存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬 菌 体，其或只含DNA，或只含有RNA。
2、核酸制备的一般原则 核酸的理化性质
在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在 微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂 在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNA溶液粘度很大，RNA的粘度较小