第14章 基因重组和基因工程

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细菌
噬菌体 感染 重组
溶源菌生长途径
3. 转导作用 （transduction）
溶菌生长途径(lysis pathway)： 噬菌体感染宿主时，噬菌 体DNA在宿主内迅速增殖，产生 新的病毒颗粒，溶解细菌，释 放出新生噬菌体。
(lysogenic pathway)： 噬菌体感染宿主 时，噬菌体DNA整合进 宿主染色上，随宿主 复制而复制。 当遇到DNA损伤时， 噬菌体（原噬菌体）从 宿主菌（溶原菌）染色 体上脱下来，进入溶菌 生长途径。
自然界的基因转移和重组
•同源重组 (homologous recombination) •特异位点重组 (site-specific recombination) •转座重组 (transposition recombination)
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（一）同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，它通过链的断裂和 再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链 或双链片段的交换，又称为基本重组。 是最基本的DNA重组方式: 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制。
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Ⅲ型酶 Ⅱ型酶
限制性核酸内切酶命名
Hind Ⅲ
属 种 株
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株或型； 用罗马数字表示发现的先后次序。
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限制性核酸内切酶
（三）转座重组(transposition recombination)
定义：由插入序列(insertion sequences,IS）和转座子 (transposons)介导的基因转移或重组。 （1）IS转座
IS特征：IS两侧有二个分离的反向重复序列(inverted repeats, IR)
一个转座酶（transposase)编码基因
CACAGTG(12/23)ACAAAAACC GTGTCAC TGTTTTTGG
切割位点(RAG2)
RAG1位点
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免 疫 球 蛋 白 基 因 重 排 过 程
间插DNA V片段 RSS
单链切开 OH
RSS
RAG1 RAG2
J片段
OH
分子内转酯反应
单链切开 转移核苷酸 修复、连接
V片段
J片段
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目录
第十四章
基因重组和基因工程
Genetic Recombination and Genetic
Engineering
Xiu-feng Gao West China School of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University
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主要内容
3´ 5´ 5´ 3´
DNA 连接酶
5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´ 3´
Holiday中间体
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A 5´ 3´ B 3´ 5´
3´C 5´ 5´D 3´
3´ 5´
5´ 3´
5´ 3´ 3´ 5´ A
Holiday中间体
内切酶 (RuvC)
A 5´ 3´
B 5´ 3´ 3´
内切酶 (RuvC)
IR Transposase Gene 有用基因 IR
ห้องสมุดไป่ตู้
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第二节 重组DNA技术
重组DNA技术是对携带遗传信息分子进行 设计和改造的分子工程，包括基因重组、克 隆和表达。也就是人工操作基因的过程。 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称 基因工程，又称重组DNA工艺学。
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一、重组DNA技术相关概念
P hix
H2
rH1
P
H1
H1 鞭毛蛋白
P
沙门氏菌H片段倒位导致鞭毛相转变 导致H1抗原和H2抗原的交替表达
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H片段倒位导致鞭毛相转变要点
• H片段有两个特异重组位点（hix） 为反向重复序列 • H片段上有两个启动子P 其一驱动hin基因表达 H片段可在Hin和Fis控制下进行特异位点 重组(倒位)。 另一正向时驱动H2和rH1基因表达 rH1为H1的阻遏蛋白基因。 • H片段反向(倒位)时H2和rH1不表达，H1表达。
目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白）
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（二）工具酶
工具酶
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
功
识别特异序列，切割DNA
能
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3´末端
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5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´
3´
3´ 5´ 5´ 3´
5´ 内切酶 3´ 3´ (RecBCD) 5´
3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´
DNA侵扰 (RecA)
分支迁移 (RecA)
5´ 3´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ 3´
5´ 3´ 3´ 5´
内切酶 (RecBCD)
5´ 3´ 3´ 3´
(restriction endonuclease, RE) 定义：是识别DNA的特异序列, 并在识别位 点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
作用特点：识别序列有特异性； 大多数识别位点具有回文结构 酶解后产生特征性切口
GGATCC CCTAGG AT GC GC CG CG TA
平端切口 5′末端突出粘性末端切口 3′末端突出粘性末端切口
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3. 转导作用（transduction） 当病毒从被感染的（供体）细胞释 放出来、再次感染另一（供体）细胞时， 发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转 移及基因重组即为转导作用。
细菌 感染 溶菌 感染 重组
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二、 DNA重组 ( DNA recombination)
定义：不同DNA分子间发生的共价连接或DNA 分子内较大片段的交换称为重组或重排。
整合酶(intergrase, Int)： 是λ噬菌体DNA编码的产物，是一种DNA结合蛋白， 对噬菌体的的重组位点attP有强的结合力，催化attP和细 菌重组位点attB之间的重组。 整合宿主因子(intergration host factor, IHF):细菌编码的 产物。 切离酶(Xis): λ噬菌DNA编码的产物.
3´ 5´ 3´ 3´ D 5´
C
C 5´
3´D 5´
5´ B 3´
5´
DNA 连接酶
5´ 3´
3´
5´
5´
5´3´ 3´
拼 接 重 组 体
片 5´ 3´ 段 重 组 体 5´ 3´
DNA 连接酶 3´
5´
3´ 5´
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同源重组关键步骤
① ② ③ ④ 同源联会的两个DNA分子的任意一个DNA出现单链切口； 两个单链对接，形成半交叉； 半交叉分支移动(branch migration)产生异源双链DNA； 形成Holliday中间体，Holliday中间体的变构和拆分。
靶位点粘性末端切割
TACGT
ATGCA TACGT
IS和靶位点 共价连接 复制修复缺 口形成DR
DR IR
ATGCA TACGT
IR DR
ATGCA TACGT
IS保守性转座
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插 入 序 列 的 复 制 性 转 座
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（2）转座子转座
可从一个染色体位点转移到另一位点的分 散重复序列。 转座子组成：反向重复序列 转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因
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反转录酶
多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
限制性核酸内切酶
(restriction endonuclease, RE) 功能：能特异水解双链DNA的磷酸二酯键。
Ⅰ型酶
识别位点与切割位点不一致； 没有固定的切割位点； 不产生特异性片段； 有特异切割位点； 切割位点在识别位点以外； 识别位点是特异的； 切割位点位于识别位点中或附近； 产生特异性片段； 是最常用的工具酶。
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形成特征性切口
SmaⅠ
平端切口
CCCGGG GGGCCC 3′ 5′ 5′ 3′ CCC + GGG CCC GGG 3′ 5′
5′ 3′
Bam HⅠ 5′ GGATCC CCTAGG 3′ PstⅠ 5′ CTGCAG GACGTC 3′
一、自然界的基因转移和重组：接合作用，转化、 转导作用，噬菌体DNA的整合, 细菌的特异位点重 组，转座重组，同源重组，插入序列的结构特点， 转座子的结构特点。 二、重组DNA技术 • 相关概念： 克隆，基因工程,工具酶,目的基因,基因载体 • 基本原理和过程： 目的基因的获取,克隆载体的选择和构建,外源 基因与载体的连接,重组DNA的导入,重组体的筛 选,克隆基因的表达。
质粒 —细菌染色体外的小型环状双链DNA分子
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F+
F+
F-
接合
转移
F+
F-
F+
F+
F factor: 含有细菌性鞭毛蛋白的编码基因.
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2 转化作用（transformation）
通过自动获取或人为地供给外源DNA， 使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型， 称为转化作用。
溶菌 摄取 重组
例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。 技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）