读书报告
标题：Intrinsic transition of embryonic stem-cell differentiation into neural progenitors （胚胎干细胞分化为神经前体细胞的本征跃迁）
杂志：Nature （类型：Article）
发表日期：2011年2月24 日
通讯作者：Yoshiki Sasai（笹井芳树）
作者简介：笹井芳树*（1962-2014），干细胞生物学家，日本神户市理化研究所（RIKEN）发育生物学中心（CDB）副主任，再生医学领域世界级学者，使用ES细胞、诱导多功能干细胞（iPS细胞）治疗眼部疾病的日本国家级项目负责人。
文章核心：
发现锌指核蛋白Zfp521是驱动小鼠ESCs本征神经分化的重要分子。
主要内容：
哺乳动物中，胚胎干细胞本征分化形成神经系细胞的机制一直不清楚。本文研究发现锌指核蛋白Zfp521是驱动小鼠ESCs本征神经分化的重要分子。在缺少神经分化抑制分子BMP4情况下，Zfp521在不同的分化的ESCs中强烈的表达。而且强制表达Zfp521能够让ESCs在BMP4存在的情况下仍然发生神经转变。相反，在差异化培养下，Zfp521的ESCs没有进行神经转化，而是倾向于停留在外胚层的状态。Zfp521 通过与辅激活子p300作用直接激活早期的神经的基因。因此，ESCs分化的跃迁从上胚层状态到神经外胚层前体细胞特异地依赖于细胞本征的表达和激活子Zfp521的功能。
一、研究背景及意义：
①神经化命运通常被认为是胚胎干细胞（ESCs）分化的本征方向决定的，但是在缺少外在诱导信号情况下让非分化细胞接受这样的神经化命运的细胞内
机制尚不清楚。
②之前的研究报道：对于脊椎动物（特别是对两栖类的研究）从一个未指定的胚胎外胚层细胞进行神经分化是通过一个细胞本征的机制及缺少相应的神经分化抑制信号分子（比如BMP4），但是这个本征机制的最初步骤的细节，特别是在哺乳动物中，了解的很少。
③本研究对哺乳动物从ESCs到胚胎外胚层细胞进行的神经分化这一细胞本征的机制进行探索，并对相应的参与神经分化过程的信号分子进行寻找，为哺乳动物胚胎干细胞本征分化形成神经系细胞的机制提供了科学的解释和合理的模型。
④本研究的实验思路、实验设计和实验结果的分析和实验方法的采用都很有想法，可以作为以后相关领域研究的参考。
二、研究基础：
①ESCs的体外培养技术已经很成熟，它为研究哺乳动物发育的初级调控步骤提供了一个通用的实验系统，为寻找神经命运过程中的信号分子提供了可行性。
②之前的研究已经建立了小鼠和人的ESCs的体外神经分化的有效研究平台，能实现生长因子最小化的悬浮培养（即SFEB培养）
三、研究方案及内容：
（1）Zfp521诱导神经转变
①筛选基因（GeneChip-based法）
用基于表达谱的多重样本比较算法和之前的研究，初步筛选出与诱导神经分化相关的基因，共104个基因→进一步筛出29个基因cDNA克隆，脂质转染到mESCs, 在含有FCS（抑制剂）条件下培养→最终找到1个基因表现出最强的诱导效应，即Zfp521.
实验表现：Zfp521的表达在SFEB培养的前5天里增加了60倍。
问题：在过量的FCS和BMP4条件下Zfp521的表达显著下降。
②Zfp521的强制表达
表现：在SFEB 培养条件下，Zfp521的强制表达增强了Ncad 的表达，然而，
加入BMP4抑制了Ncad 的表达。
推论：Zfp521的神经化活动可能覆盖了BMP4的抑制效应。
③原位杂交分析
表现：在小鼠的早期胚胎中没有检测到Zfp521的大量表达，但在原肠胚形
成以后，检测到其强烈的表达信号。
推论：Zfp521是一个能强烈促进神经分化的早期的神经核蛋白。
提出问题
实验设计
结果表现
推 论
图一 Zfp521诱导神经转变实验设计的思路
（2）本征分化的需求
①shRNA 实验
提出问题：是否Zfp521对mESCsde 神经分化产生作用？
已有知识：Zfp521的shRNA 不仅能强烈抑制Zfp521的作用，而且还能抑制筛基因 SFEB 培养 原位杂交 如何得到相关
基因 Zfp521的表达如何 Zfp521的神经化活动可能覆盖了BMP4的抑制效应 Zfp521是一个能强烈促进神经分化的早期的神经核蛋白
初步筛出104
个基因
→20个基因
→Zfp521 Zfp521可能是神经分化过程中的诱导因子 Zfp521的表达在SFEB 培养的前5天里增加了60倍 Zfp521的强制表达增强了Ncad 的表达，加入BMP4抑制了
Ncad 的表达 Zfp521可能是诱导分化的激活因子 Zfp521、BMP4有什么关系 强制表达 Zfp521在什么发育阶段起作用 在小鼠的早期胚胎中没有检测到Zfp521的大量表达，但在原肠胚形成以后，检测
到其强烈的表达
其他早期其他信号分子，如Sox3、Ncad等。
实验设计：ESCs 的SFEB培养（对照组和带有Zfp521的shRNA实验组）、共聚合培养及相关的rescue实验。（用qPCR和流式细胞技术验证）。
结果及推论：对于mESCs的神经转变，Zfp521的表达是必要而且足够的。
②囊胚注射实验
用对照组和Zfp521敲除的ESCs做囊胚注射实验
实验表现：对照组：子代表现出大量的神经胚胎组织
实验组：没有发现任何喙状的神经管组织。
推论：进一步说明了Zfp521对于个体的神经组织形成是至关重要的。
（3）从外胚层到神经外胚层的转变
存在矛盾：Zfp521的过表达没有在抑制剂SU5412下发挥诱导作用。
提出问题：Zfp521既然不是唯一的神经分化激活分子，那么它主要是作用在分化过程的哪一步呢？
实验设计：分析Zfp521缺失后，对每一步表达的影响（标记，免疫染色）。
结果及推论：缺少Zfp521使得MESCs只能分化到类外胚层细胞，而不能继续分化为神经外胚层细胞。
继续提出问题：mESCs缺少像Zfp521这样的因子后是否会向会想非神经世系转变？
实验设计：qPCR分析，免疫染色等等。
总的结论：在神经外胚层的分化不同阶段，Zfp521是选择性的被使用的。
（4）Zfp521对早期神经基因的反式激活
提出问题：现在需要了解Zfp521功能的分子模型。Zfp521是通过优先地与神经基因位点结合发挥功能，还是与非神经的作用发挥功能？
实验设计：用ChIP assay 检测SFEB培养表达带有标记的Zfp521的mESCs。
结果及推论：Zfp521蛋白优先地与神经基因位点结合发挥功能，而不是与非神经的基因位点。
进一步推论：Zfp521通过促进早期的神经外胚层基因促进神经分化，而不
