中兽医医药杂志 JTCVM2005年第4期调查研究氮酮促进洛美沙星仔猪皮肤吸收机理的研究王武军,黄一帆,姚金水(福建农林大学动物科学学院,福建福州 350002) 摘 要: 选用10～12日龄同品种仔猪,随机分组,于仔猪腹部皮肤涂搽含氮酮的洛美沙星透皮吸收剂,分别于涂药前、涂药后2、4、6、12、24、48和72h在体取皮,应用透射电镜观察皮肤表皮结构变化,探讨氮酮促进洛美沙星透皮吸收的作用机理。
结果表明,氮酮通过以下途径促进药物透皮吸收:(1)作用于表皮角质层细胞间脂质,使角质层变得疏松,细胞间距增大,外角质层细胞易于脱落,降低了皮肤对药物的屏障作用;(2)氮酮进入角质细胞内,与细胞内基质相作用,引起基底角质层肿胀,增加了角质细胞水化程度和药物存储空间。
研究还发现,氮酮在体对仔猪皮肤的作用可维持72h以上;由氮酮引起皮肤结构的改变是一非损伤可复性过程。
关键词: 透皮吸收;洛美沙星;氮酮;超微结构;仔猪 中图分类号:S85917 文献标识码:A 文章编号:1000-6354(2005)04-009-03 药物经皮肤吸收是最近二十多年发展起来的一种新型给药方式,由于其具有可以维持稳定的血药浓度、避免胃肠道酶解作用和肝脏首过效应、可降低药物毒副作用、使用方便等传统给药方式不具备的优点,现已成为药物新剂型研究的热点领域。
研究透皮吸收机理和转运机制可更有针对性地指导优选药物配方和建立合理有效的给药方案。
关于促渗剂促进药物透皮吸收机理的研究,在国内外医学领域已有报道[1～6],但在兽医学领域鲜见报道。
将药物经皮肤吸收理论应用于动物医药领域,进而开发防治动物疾病的新剂型药物,对于防治家畜疾病和推动兽药工业发展极具理论价值和现实意义。
本课题组十余年来一直致力于兽药透皮吸收制剂研究,在洛美沙星透皮吸收制剂药物动力学、运用光镜和扫描电镜研究该制剂对仔猪皮肤结构影响等有关研究基础上[7,8],本研究以该制剂(含氮酮作为促渗剂)为模型药物、仔猪皮肤为实验材料,选用在体研究方法,运用透射电镜多时段观察氮酮在促进洛美沙星透皮吸收过程中对皮肤角质层作用方式,探讨氮酮促进洛美沙星经仔猪皮肤吸收的机理。
为促进透皮吸收制剂在兽医临床广泛应用提供科学依据。
1 材料与方法1.1 实验药品实验用洛美沙星透皮吸收剂,为本课题组研制。
由洛美沙星原料药、氮酮和有关辅料按照药剂学方法精密配制;对照用同质量浓度的洛美沙星水溶液(不含氮酮)。
1.2 实验动物及分组从同品种母猪体况相似、胎次接近、产仔数接近(9～12头)、产仔时间相差不超过48h的3窝仔猪中各选择体重相近的仔猪4头供试验用,每窝选4头组成一单位组。
实验开始时仔猪10～12日龄,体重3.3～4.3kg,均为杜长大三元杂收稿日期:2004-12-27项目来源:福建省教育厅重点科技项目(JA00169)作者简介:王武军(1974-),男,硕士,从事动物检疫与动物疾病防治研究。
黄一帆为通讯作者。
交品种。
试验分实验组、药物对照组和空白对照组。
除空白对照组外,实验组和实验对照组的皮肤取样时间为涂药后2、4、6、12、24、48、72h。
每组各有三个重复。
1.3 给药方案给药前1d对仔猪腹部皮肤去毛处理,避免造成损伤。
各组仔猪均按照体重大小降序排列;腹部两侧各作为1个实验单元,各组仔猪都以从左到右的顺序记数,依次每组各产生8个实验单元,每1单元分前后两区,分别涂搽试验药物和对照药物。
采用随机单位组设计,按随机抽样法将8组分配到8个实验单元。
每头仔猪腹部两侧皮表均采用倒计时法给药,以保证两侧同时取样。
涂药时,用排刷蘸取药液,在不同的给药时间于腹侧前区涂搽试验药物4mg/kg[7,8],同侧腹部后区涂搽等量对照药物。
每区搽药范围为3c m×3c m,涂搽局部采用同一时间段一次性给药的方法。
1.4 在体取样分别于涂药前、涂药后2、4、6、12、24、48、72h在体取皮。
固定仔猪,用手术刀迅速取皮后,将皮肤样品浸入冷生理盐水中漂洗以除去血污,再放入4℃1.5%多聚甲醛-3%戊二醛固定液中固定。
取皮局部创面经雷佛奴尔消毒后,行外科结节缝合。
1.5 透射电镜样品的制备和观察将皮肤样品制成约2mm×1mm×1mm,固定1周(4℃)。
磷酸盐缓冲液(P BS,pH7.4)清洗,后1%锇酸固定,系列酒精脱水,丙酮置换,环氧树脂定向包埋,超薄切片,醋酸铀-枸橼酸铅染色,Hu-12A型透射电镜观测。
2 结果2.1 空白对照组表皮超微结构角质层含20～30层扁平角质细胞,基底角质层(近颗粒层的角质层)各层细胞间残存桥粒丰富,细胞厚度0.2～0.3μm。
同层相邻角质细胞间为指状镶嵌连接,胞质中角蛋白原纤维呈均质状(见图A)。
颗粒层细胞梭形,核椭圆或不规则,核中异染色质多位于核膜下;胞质中含中等数量高电子密度透明角质颗粒,呈星形或不规则形;线粒体和核蛋白体较少,92005年第4期调查研究 中兽医医药杂志 JTCVM核周有粗面内质网分布;相邻细胞以镶嵌连接和桥粒连接为主。
棘层细胞呈梭形或多边形,染色质疏松,核较大、呈圆形,核内含少量异染色质;胞质中粗面内质网丰富,有许多糖原颗粒散在,丰富的张力微丝树枝状交错分布;细胞紧密排列,相邻细胞棘突间以丰富桥粒相连。
基底层细胞呈矮柱状,核圆形,异染色质散在分布,核仁显著;胞质中含较多线粒体。
基膜面不规则,常有张力微丝终止于基膜的半桥粒上。
2.2 药物对照组(经对照制剂处理)表皮超微结构变化4h组角质层细胞有30层左右,排列规则,基底角质层细胞间残存桥粒丰富,基底角质层细胞厚度与空白对照组相同。
颗粒层胞质内透明角质颗粒数量中等。
棘层和基底层结构与空白对照组相同。
2.3 实验组(经实验制剂处理)表皮超微结构变化2.3.1 2h组 角质层细胞变厚,基底角质层细胞厚度为013～014μm,外层疏松,细胞层间距增大且细胞内角蛋白呈网格样,基底角质层各层细胞连接紧密,近颗粒层的3～4层角质细胞胞质内出现空泡。
颗粒层细胞间排列紧密,胞质内透明角质颗粒体积增大,呈粗大的条索状或斑块状沿核膜分布。
2.3.2 4h组 基底角质层细胞内和细胞间出现大量空泡,角质细胞也有增厚现象,角质层细胞间偶可见包膜状结构,细胞内亦可见类似溶酶体样板层颗粒(见图B),部分区域角质层细胞间距增大,角质细胞形态不规则,细胞突起增多。
颗粒层细胞胞质中透明角质颗粒聚集呈团块状。
2.3.3 6h组 角质层外层结构疏松,中间数层角质层细胞角蛋白结构呈非均质状,基底角质层细胞明显增厚且起伏较大,厚度为0.2～0.8μm,胞质中含有圆形或杆状具膜的空泡0.1～0.5μm或包含物(直径0.4μm),但与4h组相比空泡数量减少。
颗粒层2～3层细胞,细胞内透明角质颗粒相互连接呈带状;部分区域近基底层的棘层细胞间以及棘层与基底层之间间距明显。
基底层细胞的基膜面起伏较大。
个别区域细胞胞质中含溶酶体样空泡,其周边分布有丰富的糖原颗粒。
2.3.4 12h组 角质层外层疏松易脱落,与活性表皮相连的角质层仅有12～14层。
基底角质层细胞起伏非常明显,在细胞内和细胞间出现吞噬泡样结构,基底角质层细胞仍然增厚。
颗粒层细胞中透明角质颗粒丰富,部分区域张力微丝走向紊乱。
棘层和基底层细胞及细胞间隙未见明显变化。
2.3.5 24h组 角质层外层细胞脱落或游离,内层11～15层细胞与活性表皮相连,角质层细胞间隙增大(图C),基底角质层细胞间的连接较丰富且细胞增厚,细胞内和细胞间均含有少量小空泡。
近基底层的棘层细胞之间间隙增大,并可见已趋化至活性表皮基底层和棘层的炎性细胞(图D)。
2.3.6 48h组 外层角质层脱落,基底角质层变化不明显。
颗粒层含有2层细胞,内层细胞胞质中透明角质颗粒较小,外层细胞中透明角质颗粒丰富,呈星形或大的斑块状。
棘层和颗粒层细胞中微丝束增多且走向紊乱。
基底层亦可见趋化的炎性细胞。
基底层细胞表面突起明显,可见细胞间隙。
2.3.7 72h组 呈游离态的角质层细胞层减少,角质层细胞内角蛋白结构未见异常,基底角质层起伏明显,厚度为0.2～0.5μm(图E);颗粒层细胞中透明角质颗粒丰富。
基底层细胞间隙增大,部分区域细胞间及基膜附近仍可见趋化的炎性细胞。
A.空白对照组(角质层细胞排列规则,角蛋白紧密堆叠,×18000);B.4h实验组(基底角质层细胞内出现大量空泡,并可见板层样结构,×18000);C.24h实验组(角质层细胞间隙增大,部分区域角化细胞角蛋白结构清晰,×10000);D.24h实验组(趋化至活性表皮基底层和棘层的单核样细胞,×7000)E.72h实验组(可见新分化的具有明显增厚的质膜的角质层细胞,×21000)图1 仔猪腹部皮肤表皮超微结构的变化3 讨论3.1 本研究首次报道了借助仔猪在体皮肤通过透射电镜观察氮酮的促渗机制。
动物医学领域,哺乳动物中有相关羊的表皮和毛囊超微结构的报道[9],而有关仔猪皮肤超微水平的研究鲜见报道。
由于猪生理和解剖方面与人相似,使得以与人体皮肤渗透性最为相近的仔猪皮肤进行的研究可以作为预测人体透皮吸收的良好模型[10]。
因此,本研究尚可为人体医学相关研究提供较有价值的借鉴和参考。
此外,本研究以光镜和扫描电镜观察大量样本为基础[8],再应用透射电镜进行深入研究。
这在一定程度上降低了单从超微结构观察因样本面积较小而导致结果不客观的影响。
3.2 表皮的角质层是透皮吸收的主要屏障,故本研究以仔猪皮肤角质层在给药前后变化为观察重点。
洛美沙星透皮肤吸收制剂的药物动力学研究表明[7],仔猪经皮肤给药后4～8h体内血药浓度均维持在较高水平,在6.25h血药浓度达到最高峰。
因此,上述时间段内皮肤结构的变化与氮酮的促渗机制密切相关。
本研究观察到给药后2～6h,外层角质层细胞间距增大,基底角质层出现不同程度的肿胀。
我们认为,角质细胞出现肿胀现象是因氮酮对皮肤的水化作用所致。
这与Sugibayashi K et al[3]发现氮酮能增加皮肤角质层含水量的结果相一致。
此外,本研究观察到表皮角质细胞增厚和角蛋白模式发生改变。
对这些现象的一种解释是,促渗剂使角质层细胞中的角蛋白原纤维断裂成更小的碎片,导致细胞内渗透活性增强[11],这种作用使角质层细胞分布自由容积增大,并降低了角质层的扩散阻力。
推测这种作用使胞质中基质流动性增加,进而提高细胞膜通透性,导致细胞体积增大,成为药物或水分的储库。
3.3 基础研究表明,透明角质颗粒是角蛋白形成的必要条01 中兽医医药杂志 JTCVM2005年第4期调查研究件[12]。
我们发现经皮肤给药后,表皮颗粒层细胞胞质中透明角质颗粒体积增大呈块状或索状,在6h组最为明显,基底角质层细胞中出现大小不等的圆形或椭圆形空泡或吞噬泡,且这些泡样结构的数量在4h组较多。
