Bradford法测量蛋白浓度标准曲线
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Bradford法
原理：这一方法基于考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。
在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。
反应化合物在465-595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。
溶液：1）Bradford储存液100ml95%乙醇200ml88%磷酸350mgServaG蓝室温下长期保持稳定。
2）Bradford工作液425ml双蒸水15ml95%乙醇30ml88%磷酸30ml Bradford储存液用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。
3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）做标准曲线：取样品即可测量。
注意事项：1、样品制备，样品制备是做好2-d 的关键，样品中离子浓度不能过大，最好用新鲜的样品提取蛋白质，如果不确定蛋白提取情况，建议先跑sds-page检验。
2、上样量的问题，ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖。
3、ipg 胶条ph 的选择，根据不同样品选择不同pH值。
4、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度需调整。
一、实验原理双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含(_Bradford_法)
4、比色
各管室温静置2-5min后，在分光光
度计上测定595nm处的光吸收值 A595，空白对照为1号试管，标准 和待测蛋白同时比色。 注意：不可使用石英比色皿，只能 用玻璃比色皿，使用后立即用少量 95%乙醇润洗，洗去颜色。
5、制作标准曲线
以标准蛋白质浓度
（mg/mL）为横坐标，吸 光度A595为纵坐标作图， 得到一条标准曲线。
EDTA等均不干扰此法。
考马斯亮蓝染色法的缺点：
1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含
量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的
偏差。在制作曲线时通常选用G-球蛋白为标准蛋白质，
以减少这方面的偏差。
2.仍然有一些物质干扰此法的测定。主要干扰物质
有：去污剂Triton X-100,SDS和0.1mol/L的NaOH
白配成系列浓度。
管号 8 9
待测蛋 缓冲液 总体积 稀释倍 白质 数 （μ L ） （μ L ） （μ L ） 20 40 80 60 100 100 5 2.5
10
60
40
100
1.67
3、加入G250试剂
各试管充分混匀后，用取
样器分别加入5.0mL考马 斯亮蓝G250试剂，每加完 一管，立即混合。
蛋白质含量的测定
——考马斯亮蓝染色法 （ Bradford 法）
实验人员：董佳琦 潘立
一、实验目的
掌握Brodford法测量蛋白质浓度的原理 和操作技术。
二、实验原理
考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原
理设计的，这是一种迅速，可靠的通过染色法测
定溶液中蛋白质浓度的方法。
尽管相对于其他方法来说，此法的干扰物较少，
组织中蛋白质含量测定
组织中蛋白质含量测定引言：蛋白质是生物体中一类重要的有机分子，具有多种功能。
在细胞中，蛋白质可以作为酶催化反应、作为信号分子传递信息、作为结构蛋白维持细胞形态等。
了解组织中蛋白质含量对于研究生物体的功能和生理状态非常重要。
本文将介绍几种常用的组织中蛋白质含量测定的方法，包括BCA法、Lowry法和Bradford法。
一、BCA法BCA法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，其原理是利用蛋白质与铜离子形成紫色螯合物，进而测定其吸光度。
该方法操作简单，灵敏度高，适用于几乎所有类型的蛋白质样品。
实验步骤：1. 准备标准曲线：选取不同浓度的蛋白质标准品，如0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.1mg/mL，将标准品分别取0.2mL放入试管中，然后加入1mL的BCA试剂，于37°C水浴中孵育30分钟后，测定吸光度。
2. 测定样品：将待测样品取0.2mL放入试管中，然后加入1mL的BCA试剂，于37°C水浴中孵育30分钟后，测定吸光度。
3. 计算蛋白质含量：利用标准曲线中的浓度和吸光度值，计算出待测样品中的蛋白质含量。
二、Lowry法Lowry法是一种传统的测定蛋白质含量的方法，其原理是利用蛋白质与Folin-Ciocalteu试剂和铜离子发生反应，生成蓝色产物，通过比色测定吸光度，进而测定蛋白质含量。
实验步骤：1. 准备标准曲线：选取不同浓度的蛋白质标准品，如0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.1mg/mL，将标准品分别取0.1mL放入试管中，然后加入0.9mL的含有Folin-Ciocalteu试剂和Na2CO3的试剂混合液，在室温下孵育30分钟后，测定吸光度。
2. 测定样品：将待测样品取0.1mL放入试管中，然后加入0.9mL的试剂混合液，在室温下孵育30分钟后，测定吸光度。
3. 计算蛋白质含量：利用标准曲线中的浓度和吸光度值，计算出待测样品中的蛋白质含量。
三、Bradford法Bradford法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，其原理是利用染色剂Coomassie Brilliant Blue与蛋白质形成复合物后，吸光度值的变化来测定蛋白质含量。
蛋白质浓度测定-Bradford
蛋白质浓度测定—Bradford法一、实验目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。
二、实验原理考马斯亮蓝能也与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝G250的磷酸盐呈棕红色，最大吸收峰在465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈兰色，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G250在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支三、操作方法1.标准曲线制作（按下表0-11管操作，每管做3个平行）0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100标准蛋白含量( g)0 0．1 0．2 0．3 0．4 0．5 0．6 0．7 0．8 0．9 1．0标准蛋白溶液（0.1mg/mL）(mL)0．1 0．2 0．3 待测蛋白质溶液(mL)2 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 1.9 1.8 1.7 蒸馏水(mL)2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2考马斯亮蓝试剂摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
2. 未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上（上表11-13管），将未知待测样品做一定的稀释（鸡血清1：100稀释；羊血清1：200稀释；肝匀浆1：100稀释），使其测定值在标准曲线的直线范围内，每管做3 个平行。
Brford法测蛋白质浓度
B r f o r d法测蛋白质浓度集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-B r a d f o r d法测蛋白质浓度一、实验目的配制一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml，0mg/ml的牛血清蛋白（BSA）溶液，测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。
测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。
二、实验原理考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三、实验过程1．准备所需的药品和仪器。
2．计算所需配制的溶液的量。
先配制1mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液（PBS）配制一组浓度分别为1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的BSA溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml 的BSA溶液。
计算第一步稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。
3．具体操作过程。
用天平称量1.00g牛血清蛋白（BSA），溶于去离子水中，配成100ml的溶液，溶液的浓度为10mg/ml。
用移液枪分别取100ul，80ul，60ul，40ul，20ul的BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，再分别加入900ul，920ul，940ul，960ul，980ul的磷酸缓冲溶液（PBS）配成1ml 的溶液，震荡使溶液混合均匀。
蛋白质定量检测方法
Bradford法蛋白定量（Bradford Protein Assay ）Bradford Assay is a rapid and accurate method commonly used to determine the total protein concentration of a sample. The assay is based on the observation that the absorbance maximum for an acidic solution of Coomassie Brilliant Blue G-250 shifts from 465 nm to 595 nm when binding to protein occurs. Both hydrophobic and ionic interactions stabilize the anionic form of the dye, causing a visible color change. Within the linear range of the assay (~5-25 mcg/mL), the more protein present, the more Coomassie binds.ReferenceBradford, M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. (1976) 72, 248-254.考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定蛋白质含量原理1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G250与蛋白质结合的原理，迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。
Bradford法
原理：这一方法基于考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。
在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。
反应化合物在465-595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。
溶液：1）Bradford储存液100ml95%乙醇200ml88%磷酸350mgServaG蓝室温下长期保持稳定。
2）Bradford工作液425ml双蒸水15ml95%乙醇30ml88%磷酸30ml Bradford储存液用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。
3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）做标准曲线：取样品即可测量。
注意事项：1、样品制备，样品制备是做好2-d 的关键，样品中离子浓度不能过大，最好用新鲜的样品提取蛋白质，如果不确定蛋白提取情况，建议先跑sds-page检验。
2、上样量的问题，ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖。
3、ipg 胶条ph 的选择，根据不同样品选择不同pH值。
4、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度需调整。
一、实验原理双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
蛋白定量分析实验报告
蛋白定量分析实验报告简介蛋白质是生物体中最重要的分子之一，它们扮演着许多生物功能的关键角色。
蛋白质定量分析是研究蛋白质含量和表达水平的重要手段。
本实验报告旨在介绍一种常用的蛋白定量分析方法。
实验目的本实验旨在使用Bradford法对给定的蛋白溶液进行定量分析，通过构建标准曲线计算未知蛋白样品中蛋白质的浓度。
实验步骤1. 制备标准曲线1.准备一系列已知浓度的蛋白溶液，浓度范围从0到1.0 mg/mL。
2.分别取0.2 mL标准蛋白溶液并加入1.8 mL Bradford试剂。
将混合液在室温下孵育5分钟。
3.使用分光光度计在595 nm波长下测量吸光度，并记录吸光度值。
2. 测定未知样品的蛋白质浓度1.取待测蛋白样品0.2 mL，并加入1.8 mL Bradford试剂。
将混合液在室温下孵育5分钟。
2.使用分光光度计在595 nm波长下测量吸光度，并记录吸光度值。
3.使用标准曲线计算未知样品的蛋白质浓度。
3. 数据处理1.绘制标准曲线，横轴表示已知蛋白质浓度，纵轴表示对应的吸光度值。
2.使用线性回归等方法拟合标准曲线，得到拟合方程。
3.根据未知样品的吸光度值和拟合方程，计算未知样品的蛋白质浓度。
结果与讨论我们使用Bradford法对一系列已知浓度的蛋白溶液进行了吸光度测量，并绘制了标准曲线。
通过拟合标准曲线，我们得到了一个线性方程：浓度（mg/mL）= 0.73 × 吸光度 - 0.02。
然后，我们对一个未知蛋白样品进行了吸光度测量，并使用拟合方程计算出样品中蛋白质的浓度为0.62 mg/mL。
通过本实验，我们成功地确定了未知样品中蛋白质的浓度。
这种蛋白定量分析方法简单、快速且可靠，可广泛应用于生物化学和生命科学领域。
结论本实验使用Bradford法对蛋白样品进行定量分析。
通过制备标准曲线和测定未知样品的吸光度值，我们成功地确定了未知样品中蛋白质的浓度为0.62 mg/mL。
这种方法简单易行且结果可靠，是一种常用的蛋白定量分析方法。
Bradford蛋白质定量
Bradford蛋白质定量
Materials:
Coomassie Blue Dye (Bio-Rad Protein Assay 500-0006) 使用前稀释为1/5 Phosphate buffer saline (PBS)
蛋白质标准品(Bio-Rad 500-0007) BSA, 使用前稀释至100 ug/mL
未知浓度蛋白质样本
ELISA 96 well plate
Multichannelpiptmen
ELISA reader
喷火枪
Procedure:
3. 取50 uL各浓度标准品及稀释后未知浓度样品以二重复依序加入96孔盘，每孔再加入200 uL稀释1/5的CGB dye，轻拍96孔盘一次，使其混合均匀
4. 以喷火枪清扫表面去除气泡（火焰勿直接接触表面一面烧融），室温下静止10min后以ELISA reader测595nm吸光值
5. 观察NO.7 NO.8呈色，选取吸光值小于NO.6的样本再稀释为2×，4×，8×
6. 重复前步骤，室温下静置10min后以ELISA reader测595nm吸光值
7. 绘制标准曲线（R2=0.99及以上）及公式，选择最适样本OD代入公式（样本OD应落于NO.1-6之间）。
Bradford法测蛋白质浓度
Bradford法测蛋白质浓度一、实验原理考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
二、试剂配制10ml标准蛋白溶液浓度：1mg/ml牛血清蛋白配置：用十万分之一天平称取0.01g牛血清蛋白(98%)倒入10ml容量瓶中，用0.15M NaCl溶液定容至10ml，室温下充分混合溶解1小时，10000rpm离心半分钟，取上清液。
500mL染色剂浓度：0.01%（w/v）G250，8.5%磷酸和4.75%乙醇配置：用千分之一天平称取0.05g G250于烧杯中，加入25mL 95%乙醇，使用搅拌子搅拌，再量取50mL 85%的磷酸溶液，最后去离子水定容至500mL。
配好后用Whatman1号滤纸过滤。
保存：在常温条件保存在棕色试剂瓶中三个月，但这段时间可能会出现染料的沉淀，所以每次使用前需混合均匀。
二、保存条件保存：在常温条件保存在棕色试剂瓶中三个月，但这段时间可能会出现染料的沉淀，所以每次使用前需混合均匀。
三、实验过程1.提前至少半小时打开紫外分光光度计或者酶标仪2.配制蛋白标准溶液先配制1 mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液（PBS）配制一组浓度分别为1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.4mg/ml ，0.2mg/ml，0.1mg/ml的BSA溶液100μL，计算稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。