DNA抽提

实验一-DNA提取实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。

本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。

2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。

提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。

DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。

以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。

当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。

当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。

为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。

关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。

DNA的提取的原理和方法DNA的提取的原理和方法一、实验原理DNA是生物体遗传信息的主要载体，它是一种长链的生物高分子，由四种碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶）按照特定的顺序排列组成。

DNA主要存在于细胞的细胞核中，也有一些存在于线粒体和叶绿体中。

DNA提取的原理主要是利用不同物质在特定溶剂中的溶解度不同，通过控制溶剂的种类和条件，将DNA从细胞中分离出来。

在DNA提取过程中，通常需要使用一些化学物质，如苯酚、氯仿等，来破坏细胞膜和核膜，使DNA释放出来。

同时，还需要使用蛋白酶等酶类物质来消化蛋白质，以便更好地分离DNA。

二、实验方法1.材料准备提取DNA的材料可以是动物组织、植物组织、微生物等。

不同的材料需要采用不同的处理方法，以最大限度地获得高质量的DNA。

例如，对于植物组织，可以使用液氮研磨法或CTAB法等方法进行提取。

2.细胞裂解细胞裂解是DNA提取的关键步骤之一，目的是破坏细胞膜和核膜，使DNA释放出来。

常用的裂解方法有机械法、化学法和酶法。

机械法包括研磨、超声波等；化学法使用化学物质如苯酚、氯仿等；酶法使用蛋白酶等酶类物质来消化蛋白质。

3.蛋白质去除在细胞裂解后，蛋白质也会随着DNA一起释放出来。

为了获得纯净的DNA，需要去除蛋白质。

常用的去除蛋白质的方法有苯酚/氯仿抽提法和盐析法。

苯酚/氯仿抽提法利用苯酚和氯仿的特性，将蛋白质和DNA分离开来；盐析法则是利用高浓度的盐溶液使蛋白质沉淀，而DNA则溶解在上清液中。

4.DNA沉淀去除蛋白质后，需要通过一定的方法将DNA沉淀下来。

常用的沉淀方法有乙醇沉淀法和盐析法。

乙醇沉淀法利用乙醇能够使DNA沉淀的特性，将DNA从溶液中分离出来；盐析法则是利用高浓度的盐溶液使DNA沉淀，然后通过离心等方法将DNA 收集起来。

5.DNA洗涤和溶解DNA沉淀后，需要用70%乙醇洗涤数次以去除杂质，然后用适量的TE缓冲液或去离子水溶解DNA。

TE缓冲液是一种常用的维持DNA稳定的缓冲溶液，含有Tris-HCl和EDTA二钠等成分。

提取dna的实验步骤原理DNA提取是一项重要的实验技术，用于从细胞中分离纯净的DNA。

它在生物学、医学、犯罪学等领域具有广泛的应用。

DNA提取的过程可以分为以下几个步骤：样品收集、细胞破碎、蛋白质消化、DNA分离、洗涤、溶解和纯化。

首先，样品收集是DNA提取的第一步。

样品可以来自不同的来源，如血液、唾液、组织样本等。

对于血液样品，静脉采血是最常见的方式。

收集的血液样品需要采用抗凝剂进行预处理，以防止凝血。

细胞破碎是DNA提取的关键步骤之一。

细胞破碎的目的是将细胞膜以及核膜破坏，释放细胞内的DNA。

常用的细胞破碎方法有物理破碎、化学破碎和酶解法。

物理破碎一般采用高速离心仪或超声波处理，通过机械力量破坏细胞结构。

化学破碎使用适当的溶液，如细胞裂解液（例如EDTA、SDS、蛋白酶K等）来分解膜脂质和蛋白质。

酶解法则通过酶的作用来降解膜和核酸。

蛋白质消化是为了去除提取过程中的蛋白质杂质。

蛋白质会干扰DNA的纯化和测定。

在蛋白质消化过程中，常用的方法是加入蛋白酶K或肾脏酸性蛋白酶等蛋白水解酶，通过其酶解作用将蛋白质降解。

DNA分离是将DNA与其他细胞组分分离的过程。

DNA在细胞破碎后呈现为线性或环状的形态。

为了分离DNA，一般采用盐溶液和有机溶剂共同作用的方案，如添加高浓度的盐类（如NaCl）和异丙醇。

这些溶剂会沉淀细胞残渣和蛋白质，而DNA则溶于水相中。

洗涤过程是为了去除残留的蛋白质和盐类。

洗涤液一般为酒精溶液，如酒精和醋酸盐。

洗涤时，将沉淀的DNA加入洗涤液中，通过离心使DNA沉淀，然后去除上清液。

此过程重复一至三次可以有效去除杂质。

溶解是将沉淀的DNA重新溶解于缓冲液中，以便于后续的操作。

溶解液可以是Tris-EDTA缓冲液、无菌纯水等。

在加入缓冲液后，将溶液置于水浴中进行搅拌和温度控制，使DNA彻底溶解。

纯化是最后一步，目的是去除DNA提取过程中的杂质，获得纯净的DNA。

常见的纯化方法有酚-氯仿抽提法和硅胶纯化法。

组织样DNA的提取方法：1．取黄豆大小组织样，用70%酒精棉球擦干净，尽量剪碎，置于2 ml离心管中。

（剪刀、镊子每次都擦干净）2．每管中加裂解液800ul，蛋白酶K 30ul。

3．55℃水裕14-20小时至管中无组织块为止（加封口膜防水）4．每管加等体积（800ul）饱和酚，摇匀器上摇出10-15分钟，10000转4℃离心10-15分钟5．取上清，置于另一管中，加500ul饱和酚，500ul氯仿（氯仿：异戊醇=24：1），混摇10-15分钟，10000转4℃离心10-15分钟6．取上清置于另一管中，加800ul氯仿，混摇10-15分钟，10000转4℃离心10-15分钟7．取上清，加800ul无水乙醇，室温混摇15-20分钟，10000转4℃离心7-8分钟8．倒掉管中液体（小心DNA 团块），再用70%乙醇轻洗，吸干乙醇，通风橱内风干加灭菌水溶解，4℃放置几个小时重要仪器、设备和试剂●UV-754型紫外线分光广度计●PCR扩增仪●DYYⅢ－12型电脑恒功率多功能电泳仪●TGL－16G高速台式离心机●DF110电子天平●HY-1型自动旋转式混匀仪●H-1微型混合器●蛋白酶K：MERCK公司产品●三羟基氨基甲烷（Tris）●十二烷基磺酸钠（SDS）●Tris饱和酚●琼脂糖●丙稀酰胺●N,N’-亚甲基双丙烯酰胺●TaqDNA聚合酶●4dNTP●PBR332 DNA/MSPI Markers: 华美生物工程公司●微卫星引物溶液配制(1) 10%十二烷基硫酸钠SDSSDS 10g溶于100 mL双蒸水中，30℃以上贮存。

(2) 组织样裂解液Tris.Cl（pH=8.0）50mM乙二胺四乙酸二钠（EDTA）100mM氯化钠（NaCl）100mMSDS 0.5%(3) 蛋白酶K：20mg/mL贮存液，-20℃保存(4) 1M Tris·Cl（pH 8.0，高压灭菌，NaOH调pH值）Tris 12.11g浓HCl 4.2ml加双蒸水定容至100ml(5) 0.5M EDTA（pH 8.0，高压灭菌，NaOH调pH值）EDTA 18.61g；加双蒸水定容至100ml(6) 1M NaCl（分装高压灭菌）NaCl0.5g；加双蒸水定容至50ml(7) 氯仿：异戊醇（24:1）氯仿480ml+异戊醇20ml(8) TE缓冲液（pH8.0）1M Tris.Cl 1 mL （Tris: 12.11g）0.5M EDTA 0.2 mL（EDTA: 18.61g）加蒸馏水定容至100ml（1） 10％SDS: SDS 10.0g溶于双蒸水中。

各种DNA提取方法提取方法提取方法提取方法一，基因组DNA提取方法制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。

在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。

主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。

2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。

根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等试验步骤：1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。

试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/%SDS)混匀。

4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。

加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。

7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。

加入等体积的异丙醇。

室温10min。

2500rpm离心10min。

弃上清。

8、加入倍体积3mol/L乙酸钠与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。

-20℃20min。

9、12000r/min室温离心5min。

弃上清。

将DNA 溶于适量TE中。

二，外周血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法：试验步骤：1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm 离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80℃冻存。

酚氯仿抽提dna原理
酚氯仿（Phenol-Chloroform）抽提DNA是一种常用的DNA 提取方法。

其原理是基于酚在酸性条件下具有与DNA高度亲和性的特点，可以将DNA从细胞溶液中抽提出来。

具体的步骤如下：
1. 细胞溶解：首先将待提取DNA的细胞样品加入适量的细胞裂解缓冲液中，通过机械或化学方法使细胞壁破裂，释放出细胞内的DNA。

2. 酚抽提：加入相同体积的酚溶液，并进行充分混合。

酚能与DNA形成复合物，并与其他细胞组分（如蛋白质和脂质）发生分层，形成一个DNA上层和一个下层。

3. 脱水：将抽提产物转移至新管中，加入酒精或异丙醇，通过离心将DNA沉淀下来。

脱水过程可以去除溶液中的多余酚，提高DNA沉淀的纯度。

4. 酯化：将DNA沉淀物溶解在适量的TE缓冲液（含有EDTA和Tris）中，经过一定的时间酯化，使DNA变得更为稳定。

5. 沉淀：通过低温离心将DNA沉淀下来，去除上清液。

6. 洗涤：用70%的乙醇洗涤并去除残余的盐、酚和脏物质。

洗涤过程中，可以多次进行离心和上清液倒掉操作。

7. 干燥：最后，将DNA输送液置于干燥器中或者自然风干，以去除溶剂中的残留物质，得到纯度较高的DNA。

通过酚氯仿抽提DNA的方法，可以从复杂的细胞中提取出高质量、高纯度的DNA，以供后续分子生物学研究使用。

基因组DNA抽提操作流程1.样本选择：选择适合抽提基因组DNA的样本类型，如细胞、组织或血液。

确保样本保存在合适的条件下，以保持DNA的完整性。

2.细胞破碎：对于细胞样本，首先需要将细胞破碎以释放DNA。

可以使用物理方法，如机械剪切或超声波处理，或者使用化学方法，如洗涤溶解和细胞裂解酶处理。

3.DNA溶解：将细胞裂解提取物加入DNA溶解缓冲液中，以彻底溶解DNA。

通常，添加蛋白酶K来去除蛋白质的干扰，增加DNA产量。

4.蛋白质去除：使用蛋白酶K等酶来去除样品中的蛋白质。

酶处理后，样品经过酚/氯仿萃取，即加入等体积的酚/氯仿混合物混合，离心分离水相和有机相。

DNA会在水相中，而蛋白质会在有机相中。

5.DNA沉淀：将水相中的DNA通过加入盐和冷乙醇来沉淀下来。

经过高速离心后，形成DNA沉淀，此时可以看到白色的DNA沉淀，即可将上清去掉。

6.DNA洗涤：将DNA沉淀用70%乙醇洗涤，去除盐、蛋白质和杂质。

洗涤过程中，可以使用离心将DNA沉淀到底，倒掉上清，重复洗涤2-3次。

7. DNA溶解：将洗涤后的DNA沉淀用TE缓冲液（含EDTA和Tris-HCl）等来溶解，使其在后续的分析和储存中稳定。

此时可以使用紫外可见光谱仪检测DNA的浓度和纯度。

8.DNA质量检测：可以通过琼脂糖凝胶电泳、分光光度计或荧光检测等方法对提取的DNA进行质量检测。

目的是确定DNA的完整性、浓度和纯度。

注意事项：-操作中严格遵守无菌操作，以防止DNA污染。

-样本处理前最好进行冰浴，以保持DNA稳定。

-减少DNA的损伤和降解，所有的操作和试剂都必须在冷冻或低温环境下进行。

- 防止RNase的污染，因为RNase会降解RNA，进而影响DNA的测定。

-严格按照实验操作要求进行步骤，以确保DNA提取的高纯度和高质量。

dna的粗提取与鉴定DNA的粗提取与鉴定一、粗提取粗提取的方法是通过物理和化学方法从一个或多个生物样品中提取DNA样品，通常是为了进行DNA分子生物学分析、基因组学以及其他科学研究。

1. 用拆解液拆解细胞使用拆解液拆解细胞是最常用的粗提取DNA技术。

主要使用的拆解液有Tris-EDTA（TE buffer）、Cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB）、Sarkosyl（SDS）和NaOH溶液等。

各种拆解液的比例和温度可以根据每个实验的要求进行调整。

2. 用磁珠或磁性分选器抽提也可以使用磁珠或磁性分选器来抽提DNA样品。

这种方法可以从多种生物样品中提取DNA，如血清、血浆、细胞粗提物以及血液细胞等。

磁珠抽提的原理是利用磁性珠子来吸附DNA样品，而磁性分选器则是利用磁场将DNA分离出来。

磁珠抽提的优点是简单快捷，缺点是提取的DNA质量不够高。

3. 改良的拆解方式一些改良的拆解方式可以用来考察某一特定细胞类型。

这些方法包括冷冻破碎、湿热破裂、极限温度破裂和化学破裂等。

这些技术可以有效地提高蛋白质和DNA的提取效率，但缺点是需要较高的技术要求，而且操作步骤较多，比较耗时。

二、DNA的鉴定DNA的鉴定是指用特定的方法和技术，明确某个DNA样品的鉴定。

常见的DNA鉴定技术有定性分析、定量分析和活性检测等。

1. 定性分析定性分析是指对DNA样品进行定性鉴定，识别出它们是哪种DNA，以确定其基本性质。

常用的定性分析方法有紫外光检测和酶切检测等。

紫外光检测是将DNA浓度调整至1μg/ml，然后放置在紫外光228纳米的紫外灯管（UV lamp）下，通过分析紫外光吸收光谱来鉴定DNA 样品。

酶切检测是将DNA样品与特定的酶进行反应，用来分析DNA的特征。

常用的酶有限制性内切酶（restriction enzymes），例如EcoRI、BamHI、PstI和HindIII等。

2. 定量分析定量分析是指对某一DNA样品的浓度和数量进行测量，以了解其容量。

1. 处理材料：取植物新鲜组织100 mg或干重组织20 mg，加入液氮充分碾磨。

加入400uL 缓冲液LP1和6uL RNase A(10 mg/ml)，旋涡振荡1 min，室温放置10 min。

2. 加入130uL缓冲液LP2，充分混匀，旋涡振荡1 min。

3. 12000 rpm离心5 min，将上清移至新的离心管中。

4. 加入1.5倍体积的缓冲液LP3，立即充分振荡混匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀。

5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12000 rpm离心30 sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

6. 向吸附柱CB3中加入600uL漂洗液PW，12,000 rpm离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

注意：如果吸附柱膜呈现绿色，向吸附柱CB3中加入500uL无水乙醇，12000 rpm离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7. 重复操作步骤6.
8. 将吸附柱CB3放回收集管中，12000 rpm离心2 min，倒掉废液。

将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

9. 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200uL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12000 rpm离心2 min，将溶液收集到离心管中。

DNA提取步骤范文1.样本采集：根据具体的研究目的，选择合适的样本进行采集。

常用的样本包括血液、组织、唾液、尿液等。

采集过程应确保样本的完整性和纯度，并保持样本的新鲜度。

2.细胞破碎：将采集到的样本中的细胞破碎，以释放细胞内的DNA。

常用的方法有物理破碎法和化学破碎法。

物理破碎法可以用搅拌器或超声波将细胞破碎，而化学破碎法则是通过加入特定的溶解剂或酶来破坏细胞壁和细胞膜。

3.DNA溶解：将破碎后的细胞溶解，使DNA从细胞核膜和蛋白质中释放出来。

常用的溶解方法是加入含有高浓度盐和洗涤剂的缓冲液，这使得DNA能够与水相混溶，并与洗涤剂形成复合物。

4.蛋白质去除：将溶解后的混合液中的蛋白质去除，以纯化DNA。

常用的方法包括酚/氯仿萃取法和蛋白酶处理法。

酚/氯仿萃取法通过加入酚和氯仿，使混合液分为上层DNA-酚相和下层蛋白质-氯仿相，然后分离上层DNA相。

蛋白酶处理法则是通过加入蛋白酶，将蛋白质降解，然后通过离心使DNA沉淀。

5.DNA沉淀和洗涤：通过加入适量的酒精和高浓度盐，使DNA沉淀到管壁上，并洗掉杂质。

一般情况下，DNA会在低温下沉淀。

之后，将上清液倒掉，并使用酒精洗涤DNA沉淀，去除可能残留的盐、碱、酸和其他杂质。

6.DNA溶解及保存：将洗涤后的DNA沉淀用适当的溶液溶解，以便后续的实验操作或长期储存。

常用的溶解液是低盐浓度的TE缓冲液。

在DNA的溶解过程中，温度、离子浓度和pH值都必须适当，并避免RNA酶和DNA酶的污染。

总之，DNA提取的步骤是多个步骤的组合，旨在从生物样本中分离纯化DNA。

每个步骤都是为了达到高纯度、高产量和高质量的DNA产物。

准确且可靠的DNA提取过程对于后续分子生物学实验和遗传学研究至关重要。

在实际操作中，不同样本和研究的不同要求可能需要适当调整DNA提取步骤的顺序和条件。

因此，在进行DNA提取前，研究者应该仔细根据实验目的和具体样本的特性选择合适的DNA提取方法，并根据实际情况进行优化和调整。

DNA提取的几种方法DNA提取的几种方法(1).浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。

在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.(2).阴离子去污剂法：用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.(3).苯酚抽提法：苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。

离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。

此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。

此法的特点是使提取的DNA保持天然状态.(4).水抽提法：利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%&#1632；80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS.提取DNA主要有SDS和CTAB法，其实提取效果的好坏主要看提取的对象是什么样的材料，在提取之前一定要好好分析材料的特性，然后在设计实验步骤。

DNA抽提DNA抽提1、DNA抽提Protocol：(1)取样（放在1.5ml EP管，加入500μl DNA抽提Buffer，置于冰上；(2)研磨，再加入200μl抽提Buffer冲洗；(3)加入20mg/ml ProteinaseK 75ml，混匀，50℃温育2h以上；(4)加入等体积Tris-酚（注意吸取下层），轻摇10min，15000rpm 4℃离心10min；(5)取上清，加入1/2体积的Tris-酚，轻摇10min，15000rpm 4℃离心10min；(6)取上清，加入等体积氯仿，15000rpm 4℃离心10min；(7)取上清，加入1/10体积NaAc（3mol/L）（也可不加，加后可提高产量），2倍体积无水冰乙醇（-20℃预冷），轻摇10min，15000rpm 4℃离心10min；(8)倒去上清，加入75%冰乙醇（500μl），轻摇10min，15000rpm 4℃离心10min；(9)TE（pH8.0）溶解。

2、DNA抽提（宫廷秘方，相辉提供）：(1)样品用液氮研磨成粉末。

加入2ml抽提Buffer，使其在Buffer中融化。

稍有融化后，用研杵慢慢研，使其充分融化，约600μl/管分装至离心管中；(2)每管中加入6μl蛋白酶K，置于55℃加热器中，6h以上，中间摇晃一次；(3)样品从加热器中取出，稍微冷却至室温，每管加入2μl RNase，37℃放置50min；(4)加入等体积酚，颠倒混匀5min，13000rpm离心20min；(5)取上清，加入等体积酚:氯仿，颠倒混匀，13000rpm离心20min；(6)取上清，加入等体积氯仿，颠倒混匀，13000rpm离心10min；(7)取上清，加入等体积异丙醇，-20℃放置1h以上；(8)13000rpm离心15min；(9)弃上清，加入300μl左右的-20℃预冷的75%乙醇，颠倒数次洗涤，12000rpm离心10min（最好4℃）；(10)弃上清（小心不要将沉淀倒出，必要时小心地吸走乙醇），在吸水纸上控干，37℃晾25min左右；(11)每管加入30μl TE（实际用量视情况而定，也可增加到50μl），用枪轻轻吹打，如需要，放在65℃静置20min，充分溶解；(12)测浓度，计算总量。

1，贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2，细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。

3，重复2。

4，加入5ml DNA提取缓冲液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混匀。

5，加入25ul 蛋白酶K ,使终浓度达到100ug/ml, 混匀，50℃水浴3h,6，用等体积的酚抽提一次，2500r/min 离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇=25:24:1）混合物抽提一次，2500r/min 离心收集水相。

用等体积的(氯仿，异戊醇=24:1)抽提一次。

7，加入等体积的5mol/L 的LiCL,混匀，冰浴，10min.8， 2500r/min,离心10min. 转上清与一离心管中。

加入等体积的异丙醇。

室温10分钟。

9， 2500r/min,离心10min。

弃上清。

加入0.1倍体积3mol/L 乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。

-20℃ 20分钟。

10， 12000r/min, 室温离心5分钟。

弃上清。

将DNA溶于适量TE中2. 试剂：（1）细胞裂解缓冲液：Tris （pH8.0） 100 mmol/LEDTA （pH 8.0） 500 mmol/LNaCL 20 mmol/LSDS 10%胰RNA酶 20ug/ml（2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，-20℃备用。

（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。

（4）酚，氯仿，异戊醇（25:24:1）。

（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。

三、操作步骤1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。

置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。

在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12-24h，间歇振荡离心管数次。

于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

一DNA的抽提QIAGEN试剂盒。

1 标记1.5mlEP管吸取20ul蛋白酶K加入1.5mlEP管底部。

2 加入200ul血清至1.5mlEP管。

若血清不足200ul可加适量PBS补充。

余血清-20℃保存3 加200ul缓冲液AL至样品管震荡混匀15s。

4 56℃孵育10min。

5 稍微离心将EP管壁上的液体离心下去。

6 加200ul无水乙醇至样品管中震荡混匀15s稍微离心。

7 混合液转移至QIAamp螺旋住置于2ml收集管上小心勿沾湿边缘。

加样器垂直于螺旋住将混合液慢慢加至滤膜中间。

关盖标记8000rpm离心1min。

再将QIAamp螺旋住转移至一个清洁的2ml收集管内弃含滤液的收集管。

8 打开QIAamp 螺旋柱加入500ul缓冲液AW1勿沾湿边缘。

关盖8000rmp离心1min。

再将QIAamp柱转移至一个清洁的2ml收集管内弃含滤液的收集管。

9 打开QIAamp柱加入500ul缓冲液AW2勿沾湿边缘。

关盖全速12000rpm离心3min。

10 标记1.5ml离心管将QIAamp柱置于一个清洁的1.5mlEP管弃含滤液的收集管。

打开QIAamp柱加入50ul缓冲液AE。

室温孵育3min。

12000rpm离心1min。

继续下一步实验操作或-20℃保存。

二目的片段的扩增第一轮PCR 反应体系30ul要有一个阳性对照和一个阴性对照n个标本10×Buffer 3n ul dNTP200ul/ml 3n ul primer 上游引物0.3n ul 下游引物0.3n ul Taq酶0.5n ul H2O 20n ul 模板DNA 3 ul 反应条件94℃1min 94℃20sec 55℃20sec 72℃1min20sec 反应35个循环注意配体系时先配总反应体系混匀分装后再加标本一管一枪头。

防止污染。

配置体系要在超净台内操作。

4.第二轮PCR 反应体系50ul取第一轮PCR产物另加一空白管做阴性对照即有二个阴性对照若出现污染可以据此判断是那一轮PCR污染。

DNA和RNA提取方法及原理DNA提取方法：1.酚/氯仿方法：这是最早应用的DNA提取方法之一，适用于绝大多数生物样本。

原理是利用酚酸抽提DNA，酚酸能溶解细胞膜和蛋白质，而DNA在酚相沉淀。

然后用氯仿提取，分离DNA与酚相中的蛋白质和RNA。

最后通过乙醇沉淀纯化DNA。

这种方法可以得到高质量的DNA，但操作过程相对繁琐。

2.硅胶基质法：硅胶基质可吸附DNA，该方法使用硅胶膜或硅胶粉末来固定DNA，通过洗涤去除杂质，最后用洗脱液从硅胶上洗脱DNA。

这种方法具有简便和高纯度的优点，适用于大规模提取DNA。

3.盐酸法：盐酸法以酸性条件下使DNA变为不溶性沉淀物的原理，通过加入盐酸将DNA沉淀下来，然后经过洗涤和乙醇沉淀纯化。

这种方法适用于提取纯度要求不高的DNA。

RNA提取方法：1.酚酸提取法：这是最常用的RNA提取方法之一、原理类似于DNA的酚/氯仿法，通过酚酸将核酸与蛋白质和其他杂质分离。

然后通过氯仿脱脂，去除酚相中的蛋白质，并且获得RNA水相。

最后通过乙醇沉淀纯化RNA。

这种方法适用于大多数样品，得到的RNA纯度较高。

2.硅胶基质法：与DNA提取类似，它也适用于RNA的提取。

通过硅胶膜或硅胶粉末结合RNA并洗脱，用洗脱液分离RNA与杂质。

这种方法适用于大规模提取RNA。

3.氯仿法：这是一种较为简便的RNA提取方法，它通过氯仿脱脂去除脂质和其他杂质，并且能够同时去除DNA。

最后用乙醇沉淀纯化RNA。

这种方法适用于需要较快速提取RNA的情况。

DNA和RNA提取的基本原理都是通过分离和纯化DNA或RNA与其他杂质的物质。

酚酸提取法和硅胶基质法同属于酚酸法，都是通过酚酸和氯仿来分离DNA或RNA与蛋白质和其他杂质。

其中酚酸能溶解细胞膜和蛋白质，并且DNA或RNA在酚相中沉淀，而蛋白质和RNA在氯仿相中溶解。

然后通过洗脱和纯化步骤，从酚酸相中提取DNA或RNA。

盐酸法与酚酸法不同，它是通过酸性条件下使DNA变为不溶性沉淀物来分离DNA与其他杂质。

苯酚-氯仿法小提DNA试剂配制：1：细胞裂解液：0.32 M 的蔗糖；5 mM 的MgCl22：DNA稀释缓冲液：0.375 M的NaCl；12 mM的Tris-HCl [PH 7.5]3：10%的SDS [PH 7.2]4：5 M的NaCl5：苯酚-氯仿混合液V/V = 1:16：无水乙醇和70%的乙醇DNA 抽提：1、收集白细胞:500 μl新鲜/冻存全血(EDTA-2Na抗凝),加入1 ml的细胞裂解液充分混匀后孵育10分钟，,13000 rpm离心15 sec/3min；2、洗涤白细胞:离心后弃去上清液,加入1ml双蒸水重悬沉淀,将沉淀充分吹打使起完全溶解后, 13000 rpm离心1 /5min；3、稀释DNA，去除蛋白:弃离心后上清液，加入80 μl DNA 稀释缓冲液,重悬沉淀，完全溶解后，加入10 μl 10% SDS 和5 M NaCl 100μl，用手摇匀,再加双蒸水240 μl稀释DNA；4、加入300 μl苯酚-氯仿-异戊醇溶液(V/V=25:24:1,PH=7.5).盖紧试管,彻底混合均匀后, 13000 rpm离心12 min;5、取上清相转至另一1.5 ml EP管中，加入上清液体积比的1.5-2倍体积的预冷无水乙醇。

反复颠倒数次后,可见有絮状DNA沉淀析出；6、13000 rpm离心5 min,去上清水相。

加入和无水乙醇等量的70%预冷乙醇洗去DNA中的盐后,离心5 min。

用100 μl ddH2O或50 μl TE保存DNA备用。

为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。

加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。

一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。

也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

一些DNA提取方法1、溶菌酶法：收集对数生长期的菌液5ml, 置于10 000 rpm离心5min; 弃上清, 用500μl TE重悬于115ml 离心管中, 加10μl 10mg/ml溶菌酶, 37℃保温20min, 再加215ul 20mg/ml蛋白酶K混匀, 37℃保温1h; 再加等体积的酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1) , 置于10 000 rpm离心5min; 取上清液加2倍体积的无水乙醇和1 /10体积的NaAc (pH = 416) , 于- 20℃下静置10min后于12 000 rpm离心10min; 所得的DNA 沉淀用70%的乙醇洗2 次, 自然风干后溶于40μl 的TE (含20ug/mlRNase) , 55℃处理15min, 于- 20℃保存备用。

2、改良的CTA B法：收集对数生长期的菌液5ml, 置于10000 rpm离心5min; 弃上清, 用500μl TE重悬于115ml离心管中, 加100μl 10% SDS溶液, 215μl 20mg/ml蛋白酶K, 37℃保温1h,再加75μlNaCl和75μl 2 ×CTA B混匀, 65℃保温30min, 再加等体积的酚、氯仿、异戊醇( 25∶24∶1) , 置于10000 rpm离心5min; 以下步骤同溶菌酶法。

3、超声破碎提取法：收集对数生长期的菌液5ml, 置于10 000 rpm离心5min; 弃上清, 用3ml裂解缓冲液(110mol/L NaCl, 50mmol/L EDTA, 50mmol/L Tris·Cl) , 加30μl 10mg/ml溶菌酶冰水浴30min后超声处理, 超声条件: 250W每次工作5 s, 间隙5 s, 重复20次, 再加等体积的酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1) , 置于10 000 rpm 离心5min; 以下步骤同溶菌酶法。

4、（1）破壁、蛋白质和核酸分离：向装有0.05~0.2g 样品的5 mL EP 管中加500~2000 μL 裂解液，充分混匀，立即放入沸水浴中并开始计时5~20 min（细胞壁薄且壁外没有荚膜或多糖的微生物，沸水浴时间一般5~10 min；对于那些细胞壁厚或有特殊胞外结构的微生物及杂质含量高的样品，沸水浴时间一般15~20 min），每隔2~3 min 颠倒EP 管3 次；随后立即转入60 ℃水浴中水浴1 h 或更长，每隔15 min 颠倒EP 管3 次；接着转入72 ℃水浴中水浴1 h 或更长，每隔15 min 颠倒EP 管3 次。

酚氯仿抽提dna原理
酚氯仿抽提DNA原理是一种常用的DNA提取方法，通过该
方法可以从复杂的生物样品中高效地提取纯度较高的DNA样本。

其原理主要包括以下几个步骤：
1. 细胞破碎：首先将待提取的生物样品经过离心等操作，去除无关细胞和组织，然后使用细胞裂解缓冲液将目标细胞破碎，使细胞内部的DNA释放出来。

2. 蛋白酶处理：在细胞裂解的过程中，蛋白酶会释放出来，为了去除其对DNA的影响，可以加入蛋白酶抑制剂来保护DNA。

此步骤的目的是降解蛋白质，同时保持DNA的完整性。

3. 混合酚氯仿：将细胞裂解液与等体积的氯仿混合，产生两相体系。

氯仿主要用来分离DNA和其他细胞成分，如脂质、蛋
白质等。

在混合过程中，DNA溶于水相，而其他成分溶于有
机相。

这样，通过离心使两相分离。

DNA会聚集在水相中。

4. DNA沉淀：将水相转移到新的离心管中，加入冷酒精或异
丙醇，使DNA沉淀出来。

酒精或异丙醇中的离子会中和
DNA上的电荷，从而使DNA不溶于水，形成可见的白色沉淀。

5. 洗涤与溶解：将DNA沉淀用无菌蒸馏水洗涤去除酒精或异
丙醇的残余，并用TE缓冲液溶解DNA，使其得以储存和进
一步应用。

通过酚氯仿抽提DNA，可以将DNA从细胞中高效地提取出
来，纯度较高，适用于许多分子生物学实验和技术的应用，如PCR、酶切、测序等。