免疫荧光双染和细胞化学DAB染色步骤Word版

在同一组织细胞标本上需要同步检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。

(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素抗体(如抗A和抗B)以恰当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合荧光抗体，在荧光显微镜下分别选取两种相应激发滤片观测，即可对两种抗原进行定位和定量。

直接法简便可靠，但敏捷度较低。

(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余第一抗体后，再用两种不同荧光素分别标记第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余第二抗体，后在荧光显微镜下分别选取两种相应激发滤片观测，从而对两种抗原进行定位和定量。

使用此法应注意两种特异性第一抗体必要来源于不同种属，且荧光标记第二抗体种属必要与第一抗体种属相匹配。

免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水解决，封闭和一抗孵育与其相似。

2、免疫荧光二抗使用不同荧光标记二抗孵育，孵育时间依照抗体工作浓度拟定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观测。

4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。

条件允许，建议购买抗淬灭封片液，使标本可以保存更久。

5、荧光抗体孵育以及后续解决需要避光。

6、荧光抗体染色假阳性也许会多，需要分别设定阳性和阴性对照。

二、注意事项1、荧光染色后普通在1h内完毕观测，或于4℃保存4h，时间过长，也许会使荧光提前衰退。

2、每次实验均需设立如下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

三、免疫荧光双标经验之谈1、选用一抗时，规定来源于两种不同动物，我用是来源于家兔和大鼠抗体，二抗则是不同荧光信号标记，我用是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。

免疫荧光细胞化学双重染色法
原代培养胚胎14天大鼠端脑细胞：在骨发生形态蛋白―{诱导下，乙酰胆碱转移酶(呈绿色荧光)和同源域蛋白Islet―1(呈红色荧光)共存于细胞质内(激光扫描共聚焦显微镜观察)
1．一步双染色法先将两种荧光标{己抗体按适当比例混合(A+B)，按直接法进行染色。

2．二步双染色法先用TRITC标记的A抗体进行免疫荧光染色，再用FITC标记的B抗体染色，根据两种抗体的动物种属不同，可用直接法也可用间接法，结果A抗原呈现橘红色荧光，而B抗原呈现黄绿色荧光。

在应用中，常用的方法是免疫荧光组织化学中间接法和SABC-Cy3法相结合。

例如，在实验设计时，选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种不同的特异性一抗，相匹配的二抗分别为FITC-抗小鼠IgG 和生物素化―抗兔IgG。

进行双重染色时，由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。

孵育结束后洗涤未结合的一抗，滴加二抗时，先加人生物素化―抗兔IgG(二抗)孵育，洗涤后，滴加SABC-Cy3复合物，经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光，再进行FITC―抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片观察。

其结果A抗原呈现绿色荧光，B抗原呈现红色荧光。

此法应注意两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。

换言之，混合后的液体要同时满足两种一抗的工作浓度。

若两种一抗种属来源相同，必须分两次进行双重染色，即先用第一种一抗和第一种荧光二抗对A抗原进行染色，洗涤后，用第二种一抗和第二种荧光二抗对B抗原进行染色，否则会出现交叉反应而使染色无特异性。

免疫荧光染色(多标)步骤一、免疫荧光染色的多标技术简介免疫荧光染色的多标技术是通过同时使用多个荧光染料，标记不同的抗体，从而实现对多个目标分子的检测。

该技术广泛应用于生物医学研究、免疫组化和细胞生物学等领域，可以提供更全面的信息和更准确的结果。

二、免疫荧光染色的多标步骤免疫荧光染色的多标步骤主要包括标本处理、抗原修复、非特异性结合阻断、一级抗体处理、荧光二抗处理和显微镜观察等。

1. 标本处理将待检样品制备成组织切片或细胞涂片，并固定在载玻片上。

可以使用多种组织固定剂，如乙醛、甲醛等。

固定后，需进行脱水、透明化处理，以便后续步骤的进行。

2. 抗原修复组织样本经过固定处理后，可能导致抗原的空间结构发生改变，影响后续的抗原-抗体结合。

因此，需要进行抗原修复处理，如热解、酶解等方法，以恢复抗原的免疫原性。

3. 非特异性结合阻断为减少假阳性结果的产生，需要对标本进行非特异性结合阻断。

可使用一些蛋白质，如牛血清蛋白、鱼胶蛋白等，与标本中的非特异性结合位点结合，阻断后续试剂的非特异性结合。

4. 一级抗体处理将标本与一级抗体一起孵育，使一级抗体与目标抗原结合。

一级抗体通常是由小鼠、兔子等动物制备的，可以识别与特定抗原结合的抗体。

一级抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

5. 荧光二抗处理将与一级抗体不同动物来源的荧光标记的二级抗体与标本一起孵育。

荧光二抗能与一级抗体特异性结合，从而实现对目标抗原的荧光标记。

不同荧光染料的荧光二抗可以同时使用，以实现多标的目的。

6. 显微镜观察将处理好的标本放置在显微镜下观察，可使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等设备进行观察。

通过不同的荧光染料，可以同时检测多个目标分子的位置和表达水平。

三、免疫荧光染色的多标技术应用免疫荧光染色的多标技术广泛应用于生物医学研究中，如疾病诊断、蛋白质定位和分析、细胞信号通路研究等。

通过同时检测多个目标分子，可以提供更全面的信息，有助于深入了解生物过程的机制。

免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法（1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡（2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。

（3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min（4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。

注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。

（6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。

（7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。

（8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。

（9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。

（10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。

（11）次日取出切片，室温下复温 30min。

（12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。

（13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。

（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。

（15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。

（17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。

（18）使用荧光显微镜进行观察拍照。

贴壁细胞免疫荧光法（1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min（2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min（3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。

（4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min（5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。

（6）1%BSA室温封闭30min（7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。

dab染色方法DAB 染色方法啊，这可是个很有意思的玩意儿呢！你知道吗，它就像是一位神奇的魔法师，能让那些隐藏在细胞里的秘密一点点地显现出来。

咱先来说说 DAB 染色到底是咋回事儿。

简单来讲，它就是一种能让特定的物质显色的方法。

就好比你在黑夜里拿着手电筒，一下子就把你想找的东西给照亮了。

细胞里有那么多复杂的结构和成分，DAB染色就像是专门为我们打开这扇神秘大门的钥匙。

要进行 DAB 染色，那可得精心准备一番。

就像你要去参加一个重要的聚会，得好好打扮一下自己一样。

得准备好各种试剂，每个试剂都有它独特的作用，少了谁都不行呢。

然后就是一系列的操作步骤，可不能马虎，一步错步步错呀。

你想想看，把细胞样本放在那里，就像是把一个小宝贝放在摇篮里，然后我们小心翼翼地给它加上各种试剂，就像是给小宝贝盖上温暖的小毯子，喂它好吃的。

这过程多有趣呀！等完成了这些步骤，嘿，奇迹就出现了，那些原本看不见的东西一下子就出现在眼前了，是不是很神奇？DAB 染色的应用那可广泛了去了。

在医学研究里，它能帮医生们更好地了解疾病的发生和发展；在生物学研究中，它能让科学家们对生物的结构和功能有更深入的认识。

这就好像是给我们配上了一副超级厉害的眼镜，让我们能看清那些以前看不到的细微之处。

不过，可别以为 DAB 染色就是随随便便就能做好的哦。

这可得有耐心，有细心，还得有技术。

就像做饭一样，火候、调料都得掌握得恰到好处，不然做出来的菜可就不好吃啦。

要是不小心弄错了一步，那可能就前功尽弃啦，多可惜呀！而且啊，在进行 DAB 染色的时候，还得注意安全呢。

那些试剂可不能随便乱碰，不然可能会给自己带来麻烦哦。

这就像是走在路上要注意交通安全一样，可不能马虎大意。

总之呢，DAB 染色方法就是这样一个神奇又重要的技术。

它能让我们看到细胞世界里的精彩，能帮助我们解开一个又一个的谜团。

所以呀，如果你对生物学或者医学感兴趣，那可一定要好好了解一下DAB 染色方法哦，说不定你就会被它的魅力所吸引呢！难道不是吗？。

免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测特定抗原在细胞或组织中的表达和定位。

以下是免疫荧光染色的基本步骤：
1. 取得标本：获取需要检测的组织或细胞样本，可以是固定的组织切片或涂片，或者是固定的细胞。

2. 抗原解发：如果样本中的抗原被掩盖或结合得过于紧密，需要进行抗原解发。

可以使用酶解方法或热解方法来解发抗原。

3. 阻断非特异性结合：使用非特异性结合抑制剂，如动物血清、牛血清白蛋白或BSA，来阻止未特异性抗体结合到样本上。

4. 抗体染色：加入特异性一抗，即针对目标抗原的初级抗体。

留样本在4°C或室温下与一抗孵育一段时间，充分结合。

5. 洗涤：用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合的初
级抗体。

6. 加入荧光标记的二抗：使用经荧光标记的二抗，即反应在初级抗体上的特异性抗体。

留样本在4°C或室温下与二抗孵育
一段时间，充分结合。

7. 洗涤：再次用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合
的二抗。

8. 盖玻片和封片：将样本转移到载玻片上并加盖玻片，可以加入抗褪色剂来保护荧光信号。

9. 观察与记录：使用荧光显微镜观察标本，并记录所观察到的荧光信号的位置和强度。

以上是免疫荧光染色的基本步骤，具体步骤可能会因实验目的和设备的不同而有所变化。

免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。

zo—1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%—100％时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2％Triton X-100透化2—5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5％BSA室温封闭30分钟8、加一抗（用1%BSA稀释）放在湿盒里,4度过夜9、1×PBS洗3次,每次10分钟10、加二抗(用1％BSA稀释)30分钟，闭光！！！11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95％甘油封片注：4%甲醛,0.2%Triton，5％BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1。

取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里,PBS洗三遍。

注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。

洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3。

0.2%Triton X-100通透10分钟,PBS洗三遍。

4。

与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5。

一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好,PBS洗三遍。

6。

二抗室温2小时(避光),或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7。

最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

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1. 切片脱蜡和水化。

用二甲苯脱蜡三次，每次 5 分钟。

免疫荧光双染集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。

冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。

将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。

（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。

去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

免疫组织化学技术：染色步骤免疫组织化学技术:染色步骤一、免疫荧光法１．直接法（1）冰冻切片、涂片、印片或单层细胞培养物按要求进行固定，石蜡切片常规脱蜡后用酶消化处理，然后水化，用0.01mol/L PH7.2---7.4PBS洗5分钟，冷风吹干，放入湿盒中。

（2）滴加经稀释的荧光抗体，37℃ 30-60分钟或4℃过夜（3）PBS 洗2次，蒸馏水洗1次（4）50%甘油缓冲液封片（5）荧光显微镜下检查（6）对照染色①阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阳性。

②阴性对照，用确知不存在靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阴性。

③空白对照，用免去特异性抗体或用PBS替代特异性抗体，结果应为阴性。

④抑制试验，将标记抗体(例荧光抗体)和未标记的抗体或血清等量混合后，按上述步骤处理切片，结果应为阴性（一步法）。

或将待检切片两张，一张加未标记特异性血清，另一张加未标记同种正常血清，孵育后冲洗，再加入标记的特异性血清（例如特异性荧光标记抗体），加了未标记特异性血清的切片因抗原抗休已结合，故染色被抑制，呈阴性结果，而加同种正常血清的切片则呈阳性反应（二步法）。

对照染色非常重要，开始试验时应做全面对照，每次试验时应做阳性和阴性对照。

2．间接法（1）标本处理同直接法。

（2）滴加适当稀释的特异性抗体于标本上，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟或４℃过夜。

（3）滴加适当稀释的间接荧光抗体，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟。

（５）ＰＢＳ洗２次，双蒸水洗１次。

（６）甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察。

（７）对照染色：可用空白对照和阴性对照等。

３．补体法（１）标本处理同直接法。

（２）滴加适当稀释的特异性抗体及补体的等量混合液，置湿盒中，３７℃３０分钟，ＰＢＳ洗３次。

（３）滴加适当稀释的抗补体荧光抗体，置理盒中，３７℃３０分钟。

ＰＢＳ洗２次，蒸馏水洗１次。

（４）甘油缓冲液封片。

（５）对照染色，可作正常血清替代，灭活补体对照即经５６℃３０分钟灭活处理后，将灭活的补体与特异性抗体等量混合，进行染色，结果均应阴性。

免疫荧光染色(多标)步骤免疫荧光染色(多标)是一种常用的实验技术，用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。

该技术利用抗体的高度特异性与宿主细胞或组织中的抗原相结合，并通过荧光标记的二抗进行可视化。

本文将详细介绍免疫荧光染色(多标)的步骤。

一、制备标本需要从细胞培养物或动物组织中制备标本。

对于细胞培养物，可以使用离心将细胞沉淀，然后用PBS洗涤细胞沉淀。

对于动物组织，需要将组织切片并固定。

二、抗原解剖将标本进行抗原解剖，即使得细胞或组织中的抗原能够与抗体结合。

抗原解剖的方法包括共价交联、乙醛固定和冷冻解剖等。

三、非特异性结合抑制为了减少非特异性结合，需要对标本进行非特异性结合抑制。

可以使用一些蛋白质，如牛血清白蛋白(BSA)或胎牛血清(TBS)，将标本进行封闭。

四、第一次抗体孵育将具有特异性的原抗体（第一抗体）加入到标本中，使其与抗原结合。

第一抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

五、洗涤将标本进行洗涤，去除没有结合的第一抗体。

洗涤液可以使用PBS 或TBS缓冲液。

洗涤的次数取决于实验的要求，一般需要洗涤3-5次。

六、第二次抗体孵育加入与第一抗体来源不同物种的荧光标记的二抗（第二抗体），使其与第一抗体结合。

第二抗体可以选择不同的荧光染料，如荧光素或罗丹明。

七、洗涤将标本进行再次洗涤，去除没有结合的二抗。

同样使用PBS或TBS 缓冲液进行洗涤。

八、核染色为了观察细胞核的位置，可以使用荧光标记的DNA染料，如4',6-二硫化羟喜树碱(DAPI)进行核染色。

九、封片将标本封装在载玻片上，使用适当的封片剂固定标本。

同时，可以加入抗褪色剂以保持荧光的稳定性。

十、观察与分析使用荧光显微镜观察标本，并进行图像采集和分析。

可以使用图像处理软件对采集到的图像进行进一步的定量分析。

免疫荧光染色(多标)是一种重要的实验技术，在生物医学研究中有着广泛的应用。

通过该技术，可以对细胞或组织中的特定抗原进行定位和表达分析，为研究细胞功能和疾病机制提供关键信息。

dab染色方法流程英文回答：Dab staining is a common method used in molecular biology and immunohistochemistry to detect specific molecules or proteins in tissues or cells. It involves the use of a chromogenic substrate that produces a visible color reaction when it reacts with an enzyme linked to the target molecule.The general process of dab staining can be divided into several steps:1. Sample preparation: This step involves fixing the tissue or cells onto a slide and ensuring that they are properly preserved for staining. Different fixation methods can be used depending on the nature of the sample.2. Blocking: Before applying the primary antibody, itis important to block any non-specific binding sites on thesample to reduce background staining. This is typically done by incubating the sample with a blocking agent such as bovine serum albumin (BSA) or non-fat milk.3. Primary antibody incubation: The primary antibody, which specifically recognizes the target molecule, is applied to the sample and allowed to bind to its target. The incubation time and temperature can vary depending on the specific antibody and target.4. Washing: After the primary antibody incubation, the sample is washed to remove any unbound antibody and reduce background staining. This is typically done using a buffer solution such as phosphate-buffered saline (PBS).5. Secondary antibody incubation: A secondary antibody, which is conjugated to an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), is applied to the sample. The secondary antibody recognizes and binds to the primary antibody, allowing for the amplification of the signal.6. Washing: Similar to the previous step, the sample iswashed to remove any unbound secondary antibody.7. Dab substrate application: The dab substrate, which is a chromogenic substrate, is applied to the sample. The substrate reacts with the enzyme linked to the secondary antibody, resulting in the formation of a visible color reaction.8. Stopping the reaction: The color reaction can be stopped by washing the sample with distilled water or a stop solution. This prevents overdevelopment of the color reaction.9. Mounting and observation: Finally, the stained sample is mounted with a mounting medium and observed under a microscope. The presence of the target molecule is indicated by the presence of the color reaction.中文回答：Dab染色是分子生物学和免疫组化中常用的一种方法，用于检测组织或细胞中特定分子或蛋白质。

免疫荧光染色流程嗨，朋友！今天我要和你唠唠免疫荧光染色这个超酷的实验流程。

这就像是一场微观世界里的奇妙旅程，咱们一起去探秘吧。

免疫荧光染色啊，那可是细胞生物学和病理学研究中的一个厉害的技术手段呢。

想象一下，我们要把细胞当成一个个小小的星球，而我们要做的就是给这些星球上特定的“小居民”（也就是抗原）穿上会发光的衣服（荧光标记的抗体），这样我们就能在显微镜下清楚地看到它们啦。

首先呢，咱们得准备好材料。

这就好比要去打仗，得把武器装备都备齐喽。

咱们需要细胞样本，这个细胞样本可以来自很多地方，像培养的细胞系啊，或者是从组织里分离出来的细胞。

这时候，实验室里的小伙伴就会凑过来问：“嘿，你这细胞状态看着咋样啊？”我就会仔细瞅瞅，要是细胞长得稀稀拉拉，那可不行，得是那种活力满满的状态才好。

有了细胞样本，还得有抗体。

抗体就像是专门识别特定目标的小侦探。

选择抗体可不能马虎，就像挑鞋子得合脚一样，得选对适合自己研究目标的抗体。

我曾经就因为选错了抗体，那真是愁得头发都快掉光了。

接下来就是正式的染色流程啦。

第一步，固定细胞。

这就像是把那些小星球给固定在一个位置上，不让它们乱跑。

我们常用的固定剂有甲醛之类的。

把固定剂轻轻加到细胞上的时候，我就感觉自己像是一个小魔法师，正在施展一个定身咒。

旁边的师兄还打趣说：“嘿，你可别把细胞给吓着喽。

”固定好细胞之后，就是通透处理啦。

细胞就像一个小城堡，外面有城墙（细胞膜）保护着。

我们要让抗体这个小侦探能进入城堡里找到目标，就得在城墙上开几个小通道，这就是通透处理的意义。

这时候要是有人问：“为啥要通透啊？”我就会拍拍他的肩膀说：“哎呀，你想啊，要是门都进不去，咋找里面的东西呀？”然后就是封闭啦。

封闭就像是给那些不是我们目标的地方盖上一层布，这样抗体小侦探就不会被那些无关的东西干扰啦。

我们用一些蛋白质溶液来进行封闭，就像给那些小星球上不必要的地方蒙上一层保护膜。

接着就到了关键的抗体孵育步骤喽。

免疫荧光染色实验步骤1.细胞处理：将需要进行染色的细胞培养于培养皿中，通常使用生理盐水或PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞，以去除培养基或其它细胞残留物。

2.固定：使用适当的固定剂，如甲醛或乙醛，固定住细胞。

通常在室温下固定细胞10-30分钟，然后用PBS洗涤。

3.渗透化处理：为了增强抗原与抗体的结合，需要使用渗透化剂如BSA（牛血清白蛋白）或胎牛血清等，封闭其它非特异结合位点。

浓度通常为1-5%的BSA，可以根据实验需要调整。

4.预处理：通过预处理，可以增强抗原的可见性。

预处理方法包括煮沸、酶解或蛋白酶处理等。

具体方法应根据需要选择。

5.抗原特异性溶液：将具有特异性的抗体溶液加入到含有细胞的培养皿中，使其与抗原结合。

抗体通常与标记物如荧光染料共价结合，使得标记的抗原能够被荧光显微镜观察。

6.清洗：将细胞用PBS洗涤，以去除未与抗体结合的游离抗体。

7.荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察染色后细胞中的抗原。

荧光显微镜具有特殊的光学透镜和滤光片，可以选择和激发不同荧光染料的发光。

根据需要，可以选择合适的滤光片来检测多个染色的细胞。

8.影像分析：通过图像处理软件对荧光显微镜下观察到的细胞图像进行分析和量化。

常见的分析内容包括抗原的位置、表达强度和相对数量等。

9.结果解读：根据荧光染色的结果来解读细胞中其中一抗原的表达情况。

可以通过比较实验组和对照组的亮度或表达分子的定量来确定差异。

补充说明：2.正、阴对照：在进行抗原染色前，应设置正、阴对照实验。

正对照是指使用已知表达目标抗原的样本，而阴对照是指使用未表达目标抗原的样本。

通过对照实验可以判断染色结果是否可靠。

3.染色条件优化：染色条件如温度、时间、抗体的浓度等都可能影响染色效果。

因此，需要对染色条件进行优化，以确保得到准确的结果。

4.扩展检测：除了直接染色，还可以使用间接染色方法来增强信号。

通过使用辅助抗体，可以将多个标记物同时进行检测，提供更多的信息。

总结起来，免疫荧光染色实验步骤是：细胞处理→固定→渗透化处理→预处理→抗原特异性溶液→清洗→荧光显微镜观察→影像分析→结果解读。

免疫荧光组织染色步骤
嘿，咱今儿就来聊聊免疫荧光组织染色这档子事儿哈！
你可别小瞧这免疫荧光组织染色，它就像是给细胞和组织穿上了一件特别的“荧光衣裳”，让咱能更清楚地看清它们的模样和特点呢！
首先呢，咱得把组织准备好呀，就像要给一个小宝贝打扮，得先把他洗得干干净净的。

这一步可得细心，把组织处理得妥妥当当的。

然后呢，就是固定啦！这就好比给组织安个家，让它稳稳地待在那儿，别乱跑。

固定好了，才能更好地进行接下来的操作呀。

接下来呀，就是切片啦！这就像把一个大蛋糕切成一片片的，得切得薄厚均匀，这样后面观察起来才更方便、更清楚呢。

切好片了，就得让这些小切片去和抗体来个亲密接触啦！抗体就像是小侦探，能找到组织里我们想找的那些东西。

它们一结合，嘿，那就有戏看啦！
再然后呢，就是给这些结合了抗体的切片加上荧光标记啦！这就像是给它们戴上闪闪发光的小饰品，一下子就变得特别显眼啦。

这还没完呢，还得把多余的东西洗掉呀，不然可就乱套啦。

就像咱穿衣服，得把那些不合适的线头啥的剪掉一样。

最后呀，把这些处理好的切片放在显微镜下，哇塞，那美丽的荧光图像就出现啦！就像进入了一个神奇的微观世界，那些细胞和组织都变得那么清晰、那么生动。

你说这免疫荧光组织染色是不是很神奇呀？它能让我们看到平时看不到的东西，帮助我们更好地了解生物体内的奥秘呢！咱可得好好掌握这门技术，说不定哪天就能派上大用场呢！比如说，研究疾病的发生机制呀，或者开发新的治疗方法呀。

所以说呀，别小看这一步步的操作，每一步都很重要呢！要是哪一步出了差错，那可就看不到漂亮的荧光啦！你说是不是这个理儿呀？咱可得认真对待，就像对待一件珍贵的宝贝一样，精心呵护，才能让它绽放出最美的光彩呀！。

免疫荧光双染完整版免疫荧光双染集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。

冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。

将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。

（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。

去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光。

实验步骤如下：1.已转染72h的细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。

2. 细胞半干时，覆盖以4%冷的多聚甲醛固定15分钟，避光。

3.吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。

4. 0.5%Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。

5. 与二抗相同宿主的血清？进口胎牛血清室温封闭30分钟。

6. 配制一抗（SAB2104246-50UG, Sigma, USA）：SAB+FBS=1:200。

7.加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。

次日：8.取出细胞复温至室温约1h。

9.冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。

冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。

10.配制荧光标记二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(H&L) TRITC，用PBS或FBS配制。

浓度1:20011.加入二抗，室温孵育1小时(避光)。

12. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。

冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。

13.DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。

14. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。

冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。

15.加入防荧光淬灭封片剂，避光。

16.上机confocol建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。

2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。

3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。

4.不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。

常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：（注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ 5分钟。

2.切片经二甲苯Ⅱ 5分钟.3。

无水酒精Ⅰ 30秒。

4.无水酒精Ⅱ 30秒。

5.95%酒精Ⅰ 30秒。

6。

95%酒精Ⅱ 30秒。

7。

90％酒精 30秒.8.80%酒精 30秒.9.70％酒精 30秒.10.自来水洗。

（后面的切片脱蜡至水一般都是1—10）11。

0.3%H2O2甲醇处理切片10—20分钟。

12.水洗.13。

抗原修复.14.PBS洗3次，1分钟/次。

15.加入血清孵育20分钟。

16。

摔干血清，加入一抗60分钟。

17.PBS洗3次，2分钟/次.18加入二抗孵育30分钟。

19。

PBS洗3次，2分钟/次。

20.加入ABC复合物，孵育30分钟。

21。

PBS洗3次，2分钟/次。

22。

DAB—H2O2孵育切片5—10分钟.23.PBS洗，水洗。

24。

Harris苏木素染核5—10分钟.25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

(二)、LSAB法。

(SP法)（Labelled streptavidim biotln)1。

切片脱蜡至水。

2.0.3%H2O2甲醇处理切片10—20分钟.3。

水洗。

4。

抗原修复。

5.PBS洗3次，1分钟/次。

6.加入血清孵育10分钟。

7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。

8。

PBS洗3次,每次2分钟。

加入二抗,孵育20分钟。

9.PBS洗3次，每次2分钟。

10。

加入SP复合物孵育20—30分钟。

11.PBS洗3次，每次2分钟。

12。

DAB—H2O2孵育5-10分钟。

13。

PBS洗，水洗。

14。

Harris苏木素染核5—10分钟。

15.水洗,分化，蓝化，脱水，透明并封固。

(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。

2.0。

3％H2O2甲醇真空负压处理5min。

3。

水洗。

4。

如果需要,可进行抗原修复。

5。

PBS洗3次,每次1分钟。

6。

加入正常血清真空负压处理5min。

免疫荧光实验步骤大全(精华版)免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法1.将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1小时，脱蜡。

2.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

3.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。

4.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

注意：步骤3和4用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原可以直接跳过这一步骤。

5.进行抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3分钟，后转成低火15分钟。

6.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

7.在室温下，使用3% H2O2孵育30分钟，目的是灭活内源性过氧化物酶。

8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

9.使用1% BSA进行室温封闭30分钟，用于封闭非特异性抗原表位。

10.按照抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4℃湿盒中静置过夜。

11.次日取出切片，室温下复温30分钟。

12.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

13.选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37℃避光孵育30分钟。

14.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

15.在避光条件下，使用DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。

16.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

17.在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。

18.使用荧光显微镜进行观察和拍照。

贴壁细胞免疫荧光法1.在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3分钟。

2.使用4%多聚甲醛固定细胞爬片15分钟。

3.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

4.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。

5.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

6.使用1% BSA室温封闭30分钟。

7.弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。

8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。