乳制品中三聚氰胺的高效液相色谱检测法

高效液相色谱法检测乳制品中的三聚氰胺三聚氰胺（Melamine）是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化工原料，主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革等行业，为白色晶体。

三鹿奶粉事件引发了对三聚氰胺检测的广泛关注，国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会相继发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T22388-2008）和《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（GB/T22400-2008）的国家标准。

本文参考了以上标准并进行配制条件优化，建立了液相色谱检测法，前处理简单，检测限、精密度、重现性以及回收率均符合国家标准。

1 实验部分1.1 仪器与试剂LC1600高效液相色谱仪（含UV1600紫外-可见检测器1台，P1600高压恒流泵1台，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；AT-330色谱柱温箱（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；FA2004分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；TGL-16G-A离心机（上海安亭科学仪器厂）；三聚氰胺标准品(>99%，上海安谱)；辛烷磺酸钠(色谱纯，北京百灵威)；磷酸(分析纯)、乙腈(色谱纯，美国Tedia)、纯净水(杭州娃哈哈)。

1.2 标准品溶液配制精密称取三聚氰胺标准品，溶于50％的甲醇水溶液，配制称1.422mg/ml的标准储备液，于4℃避光保存。

根据实验需要，用流动相逐级稀释成适当浓度的标准工作液。

1.3 样品前处理称取2g酸奶样品与50ml具塞离心管中，加入乙腈：水＝50：50混合溶液15ml，充分混匀后超声提取15min。

取提取液250ul，加入0.1mol/l盐酸750ul，混匀，以12000r/min离心5min，取上清液，0.22um滤膜过滤，作为HPLC 测定溶液。

1.4 色谱条件：色谱柱：Globalsil C18 5μm(ID4.6mm×250mm)流动相：乙腈/缓冲盐=15/85（缓冲盐：10mM辛烷磺酸钠水溶液，含0.1％磷酸）流速：1.0ml/min波长：240nm温度：40℃进样量：20μl2 实验结果2.1 精密度实验取浓度为0.569μg/ml三聚氰胺标准工作液，按上述色谱条件，连续进样5次，以各成分峰面积计算RSD(%)，所得结果如表1所示：保留时间相对标准偏差（RSD）为0.23％，峰面积RSD为0.57％。

高效液相色谱法检测奶制品中的三聚氰胺一、实验目的1、掌握反相离子对色谱法测定奶制品中三聚氰胺的原理和方法。

2、了解复杂样品进行色谱分析时前处理的方法和必要性。

二、实验原理三聚氰胺是一种常见的化工原料，有毒，若人体大量摄入，将引起泌尿系统结石等疾病。

2008年9月，三鹿奶粉事件发生后，三聚氰胺的危害被深入广泛的认识，同时食品安全问题也更加受到重视与关注。

反相高效液相色谱（RP-HPLC ）具有分离效率高，分析速度快，灵敏度高等优点，而且仪器较简单、工作条件要求较低，在有机物的分离与测定中有极为广泛的应用。

但三聚氰胺是强极性物质，在反相色谱柱上保留能力很弱，难以达到分离的目的。

三聚氰胺具有弱碱性，在酸性溶液中能形成阳离子。

若在流动相中加入与具有两亲作用的阴离子，则可与三聚氰胺形成具有疏水作用的离子对，从而使保留能力明显增强，达到与干扰组分分离的目的，这就称作离子对色谱。

测定阳离子一般采用烷基磺酸盐作为离子对试剂，测定阴离子一般采用烷基胺类作为离子对试剂。

奶制品的组成较复杂，一般含有大量的蛋白质和脂肪类物质，若不经过预先的分离处理，不仅干扰三聚氰胺的检出，还会对色谱柱造成一定的损伤，因此对待测样进行分离，纯化等预处理是十分重要的。

加入重金属离子可使蛋白质变性、凝聚，从而沉淀分离。

脂类和高级脂肪酸可在酸性条件下通过乙酸乙酯、乙醚、氯仿等的萃取除去。

反相离子对色谱测定三聚氰胺的定量下限约为0.1mg·L -1。

对于更低浓度的试样，需要使用灵敏度更高的色谱-质谱联用技术。

但由于仪器昂贵，维护较复杂，色谱-质谱联用技术的应用受到了限制。

通过阳离子交换树脂可使溶液中的三聚氰胺得到富集，从而有效的改善检出限。

近年来发展的固相微萃取技术将净化除杂和分离富集等步骤简化合并，使色谱分析试样前处理的效率有了显著的提高。

三、试剂与仪器试剂：PbAc （AR ） 0.2 mol·L -1（乙酸酸化），乙酸乙酯（AR ），乙酸（AR ），甲醇（AR ），氨水（AR ），732型强酸性离子交换树脂（40~60日）色谱流动相：A 、乙腈（色谱纯）；B 、KH 2PO 4（GR ） 0.05 mol·L -1；C 、H 3PO 4（GR ） 0.5 mol·L -1；D 、十二烷基磺酸钠（AR ） 0.2 mol·L -1仪器：P230型高效液相色谱仪，配UV 检测器；ODS C-18 色谱柱标样：三聚氰胺（纯度大于99.5%），用水配制成1.001g L -⋅标准储备液，4℃保存。

2010级化学教育仪器化学综合性与设计性实验—高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺的含量——2012-06-03一、实验题目：乳制品中三聚氰胺的含量的测定（高效液相色谱法）二、摘要、关键词：[摘要]三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,被用作化工原料。

它是白色单斜晶体,为建立乳制品中三聚氰胺含量的高效液相色谱测定方法, 通过超声提取,离心, 结合高效液相色谱进行样品测定。

A液：0.9508 g辛烷磺酸钠（5mmol/L）+ 1.0640 g柠檬酸（pH=3-4）用高纯水品配制1L溶液；B液：甲醇；色谱条件：30%B+70%A。

色谱柱：CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×250mm，5 µm）,检测波长：240nm。

[关键词] 高效液相色谱; 三聚氰胺; 乳制品三、引言1、对三聚氰胺的概述：三聚氰胺(Melamine) (化学式:C3H6N6 ) ,俗称密胺、蛋白精,国际纯粹与应用化学联合会命名为「1 ,3 ,5 - 三嗪- 2 ,4 ,6 - 三氨基」,是一种三嗪类含氮杂环有机化合物,被用作化工原料。

它是白色单斜晶体,几乎无味,微溶于水(311g/PL常温) ,可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等,对身体有害,不可用于食品加工或食品添加物。

三聚氰胺的结构式如下：三聚氰胺最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂(MF) 的原料。

三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。

该树脂硬度比脲醛树脂高, 不易燃,耐水、耐热、耐老化、耐电弧、耐化学腐蚀,有良好的绝缘性能、光泽度和机械强度,广泛运用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。

蛋白质主要由氨基酸组成。

蛋白质平均含氮量为16 %左右,而三聚氰胺的含氮量为66 %左右。

通用的蛋白质测试方法“凯氏定氮法”是通过检测含氮量来估算蛋白质含量,因此,添加三聚氰胺会使得食品的蛋白质测试含量偏高,从而使劣质食品通过食品检验机构的测试。

牛奶中三聚氰胺的检测方法牛奶是我们日常生活中常见的食品之一，而牛奶中是否含有三聚氰胺成为了人们关注的焦点。

三聚氰胺是一种有毒化学物质，长期摄入可能对人体健康造成危害，因此对牛奶中三聚氰胺的检测成为了必不可少的工作。

一、高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）。

HPLC-MS技术是目前较为常用的牛奶中三聚氰胺检测方法之一。

该技术结合了高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）两种分析手段，能够对样品中的三聚氰胺进行高效、快速、准确的检测。

首先通过色谱柱将样品中的混合物分离，然后再通过质谱进行定性和定量分析，能够有效地避免其他成分对三聚氰胺检测的干扰，提高了检测的准确性和可靠性。

二、酶联免疫吸附法（ELISA）。

ELISA法是一种常用的免疫学分析方法，也可以用于牛奶中三聚氰胺的检测。

该方法利用酶标记抗体与待检测物发生特异性反应，再通过底物显色从而对三聚氰胺进行定性或定量检测。

ELISA法具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点，但也存在着对样品的预处理要求较为严格、易受其他成分干扰等缺点。

三、红外光谱法。

红外光谱法是一种基于样品对红外辐射的吸收、散射、透射等现象进行分析的方法，也可以用于牛奶中三聚氰胺的检测。

通过测定样品在红外光谱区的吸收峰，可以得到样品中三聚氰胺的含量信息。

该方法操作简便、分析速度快，但对仪器的精度要求较高，且受样品基质的影响较大。

四、原子吸收光谱法。

原子吸收光谱法是一种常用的重金属元素分析方法，也可以用于三聚氰胺的检测。

该方法通过样品中三聚氰胺原子吸收光谱的特征进行定性和定量分析，具有操作简便、分析速度快的优点。

但是该方法对样品的预处理要求较高，且仪器设备成本较高。

在进行牛奶中三聚氰胺检测时，应根据实际情况选择合适的检测方法，并严格按照操作规程进行操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。

同时，加强对牛奶生产企业的监督检查，提高牛奶质量安全水平，对保障消费者的健康具有重要意义。

ICS 67.100C 53中华人民共和国国家标准GB/T 22388—2008 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法Determination of melamine in raw milk and dairy products2008-10-07 发布2008-10-07 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布前言本标准包括三个方法：第一法高效液相色谱法，第二法液相色谱-质谱/质谱法，第三法气相色谱-质谱联用法，检测时，应根据检测对象及其限量的规定，选用与其相适应的检测方法。

本标准的附录A 为资料性附录。

本标准由全国食品安全应急标准化工作组、全国质量监管重点产品检验方法标准化技术委员会提出并归口。

本标准第一法起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国疾病预防控制中心、国家食品质量安全监督检验中心、北京市疾病预防控制中心、国家乳制品质量监督检验中心、浙江省质量技术监督检测研究院、国家加工食品质量监督检验中心（广州）。

本标准第一法主要起草人：宋书锋、鲁杰、安娟、杨大进、李淑娟、张晶、刘艳琴、杨红梅、杨金宝、鄂来明、廖上富、陈小珍、蔡依军、郭新东、吴玉銮。

本标准第二法起草单位：中国检验检疫科学研究院、北京市疾病预防控制中心、国家食品质量安全监督检验中心、中国疾病预防控制中心、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。

本标准第二法主要起草人：彭涛、吴永宁、邵兵、王浩、李晓娟、郭启雷、苗虹、赵云峰、丁涛、李立、蒋原。

本标准第三法起草单位：上海市质量监督检验技术研究院、国家食品质量安全监督检验中心、中国检验检疫科学研究院。

本标准第三法主要起草人：巢强国、常宇文、雷涛、陈冬东、赵玉琪、周耀斌、穆同娜、葛宇、曹程明、张辉、麦成华、曹红。

原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法1 范围本标准规定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的三种测定方法，即高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱联用法[包括气相色谱-质谱法（GC-MS），气相色谱-质谱/质谱法（GC-MS/MS）]。

固相萃取一高效液相色谱法测定液态奶中三聚氰胺含量一、引言三聚氰胺是一种无机化合物，常用于工业制造和农业生产中，然而高浓度的三聚氰胺会对人体造成严重危害，特别是对婴儿和幼儿的影响更为严重。

由于近年来液态奶中三聚氰胺事件的频繁发生，因此对液态奶中三聚氰胺含量的检测显得尤为重要。

固相萃取一高效液相色谱法是目前常用的一种高效、准确的检测方法。

本文将介绍使用固相萃取一高效液相色谱法测定液态奶中三聚氰胺含量的方法和结果。

二、实验材料和仪器1. 实验材料：液态奶样品、甲醇、乙腈、乙酸、二氯甲烷、硅胶2. 仪器：高效液相色谱仪、固相萃取柱、离心机、显微天平、pH计、紫外可见分光光度计等三、实验方法1. 样品处理：首先将液态奶样品样瓶放在冰箱中冷藏，取出一定量的样品后使用显微天平称取出适量样品，并将其加入样品离心管内。

然后加入适量的甲醇，进行振荡混合，最后使用离心机离心沉淀，得到混合物的过滤液。

2. 固相萃取：将得到的过滤液加入到固相萃取柱中，使用甲醇等洗脱混合物，得到固相萃取柱的萃取液。

3. 色谱分析：将获取到的固相萃取液置于高效液相色谱仪中进行色谱分析，根据三聚氰胺的特征峰进行定性和定量分析。

四、实验结果经过实验验证，使用固相萃取一高效液相色谱法测定液态奶中三聚氰胺含量的结果显示，样品中三聚氰胺的含量为xmg/kg，达到了食品卫生安全标准。

五、实验结论通过该实验结果可以得出结论：固相萃取一高效液相色谱法是一种准确可靠的测定液态奶中三聚氰胺含量的方法。

该方法操作简便，结果准确，可以满足食品安全检测的需求。

六、实验改进尽管该方法已经得到了实验结果的验证，但在实际操作中还是存在一些可以改进的地方。

例如固相萃取柱的选择、色谱分析条件的优化等方面可以进行进一步的改进，以提高该方法的灵敏度和稳定性。

高效液相色谱法测定乳制品中三聚氰胺的含量实验部分高效液相色谱法（HPLC）1、试剂与材料（除非另有说明，所有试剂均为分析纯。

）1.1 甲醇：色谱纯，200ml1.2 乙腈：色谱纯,10ml1.3 乙酸铅:0.5g1.4 柠檬酸:1.0640g1.5 辛烷磺酸钠：色谱纯,0.9508g1.6 三氯乙酸：2.5g1.7 三聚氰胺：0.2500g试剂配制⏹三氯乙酸溶液（1％）：准确称取2.5g三氯乙酸用水溶解后转移至250mL容量瓶中，定容至刻度，混匀后备用。

⏹离子对试剂缓冲液：准确称取0.9508 g 辛烷磺酸钠（5mmol/L）+ 1.0640g柠檬酸（pH=3-4）用蒸馏水配制1L溶液，备用。

⏹三聚氰胺标准储备液：准确称取0.2500g（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品于100mL 容量瓶中，用甲醇水溶液（20%）溶解并定容至刻度，配制成浓度为2.5 mg/mL的标准储备液，低温避光保存。

2、仪器和设备2.1 高效液相色谱（HPLC）仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。

2.2 分析天平：感量为0.0001 g。

2.3 离心机：转速不低于4000 r/min。

2.4 超声波水浴。

2.5 具塞塑料离心管：50mL。

3、样品处理分别称取3份5 g（精确至0.0001g）奶粉于50mL具塞塑料离心管中，各加入5mL配制好的2.5g/L的三聚氰胺溶液，编号1、2、3，往1号试管中加入20mL 三氯乙酸溶液，往2号试管中加入15mL三氯乙酸和5mL乙腈溶液，往3号试管中加入20ml乙酸铅的三氯乙酸溶液，超声提取10 min，后以4000 r/min离心10 min。

各取三支试管中上清液10mL于3个25mL容量瓶中用水定容，待测。

4、高效液相色谱测定4.1 HPLC条件a) 色谱柱：CNWSIL C18液相色谱柱（4.6×250mm，5 µm）b) 流动相：A液：0.9508 g 辛烷磺酸钠（5mmol/L）+ 1.0640 g柠檬酸（pH=3-4）用高纯水品配制1L溶液；B液：甲醇；色谱条件：30%B+70%A。