免疫检验实验凝集沉淀

凝集反应名词解释免疫学

凝集反应是一种免疫学反应，指的是当抗原 (例如细菌、红细胞等) 与相应的抗体相遇时，它们之间会发生特异性结合，导致抗原颗粒聚集成块状，从而形成肉眼可见的凝集物。凝集反应是免疫学中最常见的反应之一，可以分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。直接凝集反应是指抗原与抗体在直接接触下结合，形成凝集物;间接凝集反应则是指抗原先与某种非免疫性物质 (例如胶乳颗粒或红细胞)

结合，然后再与相应的抗体结合，形成凝集物。

另一种免疫学反应是沉淀反应，指的是当可溶性抗原与相应抗体相遇时，它们之间会发生结合，形成肉眼可见的沉淀物。沉淀反应通常在抗原抗体分子可以自由扩散的固体状琼脂凝胶中进行，抗原抗体在比例合适处结合，形成较稳定的白色沉淀线。沉淀反应可以用于检测抗原抗体的特异性和比例关系，并且还可用于某些抗原物质的含量测定。

免疫检验实验凝集沉淀

实验一

实验名称：免疫凝集类实验

实验目的与要求：掌握胶乳凝集试验的原理，熟悉试验方法，了解其应用

实验仪器、试剂：RF阳性、阴性对照，胶乳试剂、反应板、血清、生理盐水、吸管、试管、玻片

实验原理：凝集反应是完整的细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体在一定条件下出现凝集物的现象。参与反应的抗原称凝集原，抗体称凝集素。本实验介绍间接凝集反应。

可溶性抗原与抗体结合后不出现凝集。如把可溶性抗原吸附在载体微球上，成为人工免疫微球，再与抗体结合即出现凝集，此称间接凝集反应。由于载体微球增大了可溶性抗原的反应面积，微球上少量抗原存在就足以出现肉眼可见的反应。这种反应的敏感性比沉淀反应高得多。

操作方法：

在反应板上依次滴加待检血清，阳性对照、阴性对照各50μl（一滴），然后垂直滴加胶乳试剂1滴，搅匀2～3分钟，肉眼观察结果。

实验现象与数据：出现凝集为阳性，不出现凝集为阴性。结果分析与结论：

实验二

实验名称：免疫沉淀类实验 实验目的与要求：

掌握抗原抗体反应的特异性和沉淀反应的原理；熟悉双向琼脂扩散的操作方法和结果分析。

实验仪器、试剂：

待检血清、抗人IgG血清，琼脂、玻片、打孔器、生理盐水实验原理：

双向扩散实验是一种定性及半定量试验方法。先将一定量琼脂倾注于平板上。凝固后打孔。加入待测抗原及抗体。抗原、抗体向孔四周扩散，在比例恰当处形成抗原抗体复合物，呈白色沉淀线，如将抗体作倍比稀释，根据白色沉淀线逐渐消失的情况可测定抗体效价。

操作方法：

1、制备琼脂板：将已溶化的盐水琼脂（15g/L）4ml倾注于水平放置的载玻片上，制成约1.5mm厚的琼脂板。

2、打孔：用打孔器打双孔

3、加样：在对应孔中加入抗原抗体

4、温育：37℃，湿盒中温育24h后观察

结果分析与结论：

ChIP（染色质免疫沉淀）实验心得

基于体内分析而发展的染色质免疫沉淀分析（Chromatin immunoprecipitation assay

kit,ChIP）技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，因此能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管病以及中央神经系统紊乱等疾病主要通路的一种非常有效的工具。

染色质免疫沉淀分析（ChiP）的基本原理是在活细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。固定的蛋白质－DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知DNA信息。

今天小编将ChIP实验的一点心得体会拿出来与大家一同分享。

（一）关于细胞

细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响所研究的TF与其靶Promoter的结合。一般而言，细胞密度长到75％－80％比较好。

（二）关于抗体

抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。单抗和多抗两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。一般而言，如果没有十足把握，比如单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），建议选择多抗比较稳妥一点。

染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告

步骤一：样品准备

试剂和仪器：

Biopulverizer(biospec)

37% formaldehyde

甘氨酸(Glycine)

PBS

protease inhibitors

步骤二： 细胞交联

1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。

2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。

3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。

4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。

5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。800Xg，4°C离心5min，小心去掉上清。

步骤三： 细胞裂解

试剂:

裂解缓冲液 1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%;

Tritonx -100 0.25%。

裂解缓冲液 2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1%

Protease inhibitors。

步骤:

1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。

2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。

3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。

步骤四：超声破碎ＤＮＡ

仪器:

Bioruptor(Diagenode)

步骤:

(1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档 “Mid”(M)。