酵母双杂交

酵母双杂交

酵母双杂交（筛库）

pGBK-gene 转化酵母

1. 酵母细胞（AH109）划线，YPDA平板，30°C烘箱培养18-20小时。

2. 挑取单细胞菌落，在YPDA培养基中，30°C摇床培养18-20小时至菌液饱和。

3. 次日，取饱和的酵母培养液5ml转接至100mlYPDA培养基中，30°C摇床培养2h，测

定OD600，直至OD600达到0.5左右。 4. （超净台下工作，下同）将上述菌液分装在2只50ml离心管（灭菌）中，室温下3000rpm

离心5min。

5. 弃上清，重悬于20ml无菌水中，3000rpm离心5min。

6. 弃上清，重悬于10ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。 7. 弃上清，重悬于500μl 1×TE/LiAc溶液中，室温温育10min。

8. 取eppendorf管，每管加100μl酵母细胞、5μl鲑鱼精DNA（10mg/ml，用之前沸水煮

2-3min，立即放冰上）、15μl DNA（pGBK连接的基因）。 9. 加入280μl

PEG/LiAc 溶液，30°C放置45min（可摇）。 10. 42°C热激10min，立即放冰上2min。

11. 室温下6000-8000rpm离心20~30s，去上清。

12. 重悬于500μl无菌水中，取100-200μl涂在SD-trp板上，30°C烘箱培养48-72h。

酵母大规模转化AD文库

1. 挑取上述SD-trp板上的pGBK连的基因转化子，YPDA培养基中培养至饱和。 2.

将上述转化子转接至200mlYPDA培养基中，30°C培养至OD600 0.5-0.6左右。 3. 离心收集菌体，20ml无菌水洗涤，3000rpm离心5min。

4. 去上清，重悬于20ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。 5. 去上清，合并菌体于一管，1ml TE/LiAc溶液悬浮菌体。 6. 加入鲑鱼精DNA200μl, 20μl AD文库DNA（4μg左右），混匀后，再加入7ml PEG/LiAc 溶液，Vortex，分装，500μl/管。

酵母双杂交筛库原理

嘿，朋友们！今天咱来聊聊酵母双杂交筛库原理，这可真是个有趣又神奇的东西呢！

你看啊，酵母就像是个小小的魔法盒子，而双杂交筛库就像是在这个盒子里施展的奇妙魔法。想象一下，酵母细胞就像是一个热闹的社区，里面住着各种不同的“居民”。

在这个酵母社区里，我们有两种特别重要的“角色”，一个是“诱饵”，另一个是“猎物”。“诱饵”呢，就像是一个专门吸引“猎物”的钩子，它被固定在酵母细胞里的某个地方。而“猎物”呢，就是我们要找的目标啦，它们在细胞这个大社区里游荡。

当“诱饵”和“猎物”相遇的时候，哇塞，就像是两块拼图完美地拼在了一起！这时候，酵母细胞就会发出一个特别的信号，告诉我们：嘿，找到了！这感觉就像是在茫茫人海中，一下子就找到了那个对的人一样惊喜。

为什么要用酵母呢？这就好比酵母是个特别友好的伙伴，它很乐意帮我们完成这个神奇的任务呀。酵母细胞里有一套自己的机制，能够让“诱饵”和“猎物”顺利地相遇和结合。而且酵母细胞好养活呀，给它点营养它就能茁壮成长，然后帮我们好好工作。

那这个原理有啥用呢？用处可大啦！比如说，我们想知道哪些蛋白质之间能够相互作用，就可以利用酵母双杂交筛库原理呀。这就像是在一个大宝藏里寻找那些有特殊联系的宝贝。通过这个方法，我们可以发现很多以前不知道的蛋白质之间的关系，这对于理解生命的奥秘可是非常重要的哦！

再比如说，在医学研究中，我们可以用它来寻找和疾病相关的蛋白质相互作用，这就像是在为治疗疾病找到关键的线索一样。一旦我们知道了这些关键的相互作用，也许就能找到更好的治疗方法呢，你说神奇不神奇？

所以啊，酵母双杂交筛库原理可真是个宝贝！它就像是一把神奇的钥匙，能打开很多未知的大门，让我们看到更多生命的奇妙之处。我们可得好好利用这个神奇的原理，去探索更多的科学奥秘呀！难道不是吗？

总之，酵母双杂交筛库原理虽然听起来有点复杂，但其实就像是一个有趣的游戏，只要我们掌握了规则，就能在这个酵母的世界里玩得不亦乐乎，发现很多意想不到的惊喜呢！让我们一起在这个酵母的魔法世界里尽情探索吧！

酵母双杂交系统

1．原理

酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。

2．试验流程

酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:

2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。

2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。

2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。

2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。

3．特点

优点

蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。

缺点

尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。

- 1 - 酵母双杂交技术流程

酵母双杂交技术是一种用于鉴定蛋白质相互作用的实验方法，它可以识别某个蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用关系。以下是酵母双杂交技术的流程：

1. 构建酵母菌株：将感兴趣的两个蛋白质编码序列分别克隆至酵母表达载体中，并插入适当的启动子和终止子后，将其转化至酵母细胞中，并筛选出正确的菌株。

2. 转化酵母菌株：将构建好的酵母菌株分别转化至两个含有互补杂交部位的酵母菌株中，使其产生可杂交的菌株。

3. 筛选正面杂交菌株：通过选择菌株在适当培养基中的生长情况或染色体特征，筛选出正面杂交的菌株。

4. 验证杂交结果：通过进一步实验验证杂交结果的准确性，例如，利用质粒转染或重组DNA重组实验等方法。

5. 鉴定蛋白质相互作用：最终确定两个蛋白质之间的相互作用关系，并进一步研究其生物学意义。