生物工程下游技术

⽣物⼯程下游技术

⽣物⼯程下游技术⽣物⼯程下游技术的定义

指从动植物与微⽣物的有机体或器官、⽣物⼯程产物（发酵液、培养液）及其⽣物化学产品中提取、分离、纯化有⽤物质的技术过程。

实质：是研究如何从混合物中把⼀种或⼏种物质分离出来的科学技术。1.⽣化⼯程分离技术

预处理

结晶⼲燥

离⼼法：离⼼过滤、离⼼沉降、超离⼼

萃取法：有机溶剂、双⽔相、液膜、反胶团、超临界

层析法：凝胶过滤层析、反相层析、亲和、疏⽔相互作⽤、聚焦、离⼦交换

膜分离：微滤、超滤、

反渗透、透析、电渗透2.⽣物物质常⽤的分离技术

氨基酸：结晶和离⼦交换法

蛋⽩质和多肽：离⼦交换层析、电泳

糖类：吸附层析

脂质：有机溶剂萃取、超临界流体萃取和层析

抗⽣素：有机溶剂萃取、离⼦交换、结晶和吸附层析3. ⽣物分离⽅法的选择与评价

原则：

步聚少，次序合理，产品规格（注射，⾮注射），⽣产规模，物料组成，产品形式，产品稳定性，危害性，物性：溶解度、电荷、分⼦⼤⼩、功能团、稳定性、挥发性，废⽔处理4.浓缩率：浓缩程度⼀般⽤浓缩率(concentration factor)表达，是⼀个以浓缩为⽬的的分离过程的最重要指标。浓缩率为m，mt=mx则⽬标产物未得到任何程度的分离纯化。

5.分离因⼦：分离因⼦⼜称分离系数。产品中⽬标产物浓度越⾼，杂质浓度越低，则分离因⼦越⼤，分离效率越⾼。

6. 回收率：⽆论是以浓缩还是以分离为⽬的操作过程，⽬标产物均应以较⼤的⽐例回收, 回收率R：

⽣物分离操作多为间歇过程（分批操作），若原料液和产品溶液的体积分别为VC和VP。1 ⽣物产品与普通化⼯产品分离过程有何不同？

2 设计⽣物产品的分离⼯艺应考虑哪些因素？

3 分离纯化的回收率与浓缩率如何计算？

4 现代⽣物分离⼯程研究⽅向有哪些特点？

5 分离纯化指标有哪些?

简述pH对发酵液过滤特性的影响，并举例说明。

答：（1） pH直接影响发酵液中某些物质的电离程度和电荷性质，因此适当调节pH值可以改善发酵液的过滤特性。（2）氨基酸和蛋⽩质在酸性条件下带正电，碱性条件下带负电，等电点时净电荷为零，两性物质在等电点下的溶解度最⼩，等电点沉淀法在⽣物⼯业分离中⼴泛使⽤。（3）如味精⽣产，利⽤等电点沉淀法提取⾕氨酸，⼀般蛋⽩质也在酸性范围达到等电点；膜分离中可通过调整pH 值改变易吸附分⼦的电荷性质，减少膜堵塞和膜污染；此外，细胞、细胞碎⽚及某些胶体物质等在特定pH下也可能趋于絮凝⽽成为较⼤颗粒，有利于过滤进⾏。

第⼆章1.预处理的⽬的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提⾼固液分离的效率：

⑴改变发酵液的物理性质，包括增⼤悬浮液中固体粒⼦的尺⼨，降低液体黏度。

⑵相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（⾼价⽆机离⼦和杂蛋⽩质），以利于后续各步操作。

⑶尽可能使产物转⼊便于后处理的⼀相中（多数是液相）；2.预处理的⽅法

凝聚和絮凝

加热法

调节悬浮液的pH值

杂蛋⽩的去处

⾼价⽆机离⼦的去处

助滤剂

反应剂3凝聚与絮凝：.凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋⽩质等胶体粒⼦的分散状态，破坏其稳定性，使其聚集起来,增⼤体积以便固液分离。

凝聚和絮凝技术常⽤于菌体细⼩⽽且黏度⼤的发酵液的预处理中。

凝聚和絮凝是两种⽅法，两个概念。

凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类）作⽤下，胶体脱稳并使粒⼦相互聚集成１ mm ⼤⼩块状凝聚体的过程。

机理：1）中和粒⼦表⾯电荷

2）消除双电层结构

3）破坏⽔化膜

胶体双电层结构

发酵液中菌体表⾯带有负电荷，由于静电引⼒使溶液中反离⼦被吸附在其周围，在界⾯上形成了双电层。

正离⼦同时受到使它们均匀分布的热运动影响，具有离开胶粒表⾯的趋势。两种相反作⽤⼒下，双电层分裂成两部：1）吸附层或stern层；2）扩散层。

扩散双电层的结构模型(Gouy-Chapman-Stern model)。

两种相反作⽤⼒下，双电层分裂成两部：1）吸附层或stern层；2）扩散层。

扩散双电层的结构模型(Gouy-Chapman-Stern model)。

絮凝：指使⽤絮凝剂（天然的和合成的⼤分⼦量聚电解质）将胶体粒⼦交联成⽹，形成10mm⼤⼩絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作⽤。

机理：架桥作⽤

采⽤絮凝法可形成粗⼤的絮凝体，使发酵液较易分离。

⼈⼯合成有机⾼分⼦聚合物、天然有机⾼分⼦聚合物、⽆机⾼分⼦聚合物聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点

⽤量少，⼀般以mg/L计量；

絮凝体粗⼤，分离效果好；

絮凝速度快；

种类多，适⽤范围⼴。

聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：

存在⼀定的毒性，特别是阳离⼦型聚丙烯酰胺，⽤于⾷品和医药⼯业时应谨慎。

天然有机⾼分⼦絮凝剂具有⽆毒，易⽣物降解，原料来源⼴等优点。

天然有机⾼分⼦改性絮凝剂根据其原料来源不同可分为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。

其中淀粉改性絮凝剂的研究开发最引⼈注⽬。

微⽣物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂，

由微⽣物或其分泌物产⽣的具有絮凝细胞功能的代谢产物。

主要成分是糖蛋⽩、粘多糖、纤维素及核酸等⾼分⼦物质。

微⽣物絮凝剂和天然絮凝剂最⼤的优点是安全，⽆毒和不污染环境。4.助滤剂：⼀种不可压缩的多孔微粒，

菌体可吸附于助滤剂微粒上，降低了滤饼的可压缩性，减⼩了过滤阻⼒。

常⽤的助滤剂是硅藻⼟，其次是珍珠岩粉、活性炭、⽯英砂、⽯棉粉、纤维素等。(1)粒度

根据悬浮液中的颗粒和滤液的澄清度确定，⼀般颗粒较⼩的滤饼应采⽤细⼩的助滤剂。(2)助滤剂的品种

根据过滤介质选择助滤剂品种。使⽤粗⽬滤⽹时易泄漏，可选择⽯棉粉、纤维素；采⽤细⽬滤布时，可使⽤细硅藻⼟；(3)⽤量

间歇操作时，过滤介质表⾯预涂助滤剂，其厚度应不⼩于2mm。连续过滤机中根据过滤速度确定。使⽤硅藻⼟时，通常细粒为500g/m3，中等粒度700g/m3,粗粒700-1000g/m3。5.反应剂：加⼊某些不影响⽬标产物的反应剂，可消除发酵液中的⼀些杂质对过滤的影响，从⽽提⾼过滤速度。

1）反应剂与某些可溶性盐类发⽣反应⽣成不溶性沉淀,⽣成的沉淀能防⽌菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，⼜能使蛋⽩质凝固，过滤性能上升，沉淀本⾝可作为助滤剂.

如新⽣霉素发酵液中加⼊CaCl2和Na3PO4，⽣成Ca3(PO4)2沉淀。2）发酵液中含有不溶性多糖物质时，⽤酶将其转化为单糖，以提⾼过滤速率。

如万古霉素⽤淀粉作培养基，发酵液过滤前加⼊%的淀粉酶，搅拌30min后，再加%硅藻⼟助滤剂，可提⾼过滤效率5倍。6. 杂蛋⽩的去除⽅法

沉淀法A 等电点沉淀法（isoelectric precipitation ）

蛋⽩质的等电点⼤都在酸性范围内～，调节发酵液的pH到蛋⽩质的等电点是除去蛋⽩质的有效⽅法。B. 酸碱调节，使蛋⽩质与离⼦形成沉淀

在酸性溶液中，蛋⽩质与⼀些阴离⼦形成沉淀，如三氯⼄酸盐、⽔杨酸盐、苦味酸盐等；在碱性溶液中，蛋⽩质与⼀些阳离⼦形成沉淀，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等。

变性

蛋⽩质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性。变性蛋⽩质溶解度较⼩。

加热，

⼤幅度调节pH值，

加酒精、丙酮等有机溶剂或表⾯活性剂等。

不⾜之处：

加热法只适合于对热较稳定的⽬的产物；

极端pH值也会导致某些⽬的产物失活，且要消耗⼤量酸碱；

有机溶剂法通常只适⽤于所处理的液体数量较少的场合。1.沉淀法主要包括盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法，结晶法等等。

2.按照⼀般的习惯，析出物为晶体时称为结晶，析出物为⽆定形固体则称为沉淀。

3.影响盐析的因素有：⽆机盐的种类、溶质（蛋⽩质等）种类的影响、蛋⽩质浓度的影响、温度的影响、pH的影响。

吸附法

加⼊某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋⽩质⽽除去。

四环类抗⽣素⽣产中，采⽤黄⾎盐和硫酸锌的协同作⽤⽣成亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN)5]2的胶状沉淀来吸附蛋⽩质，利⽤此法除蛋⽩质已取得很好的效果。

在枯草杆菌发酵液中，常加⼊氯化钙和磷酸氢⼆钠，这两者本⾝⽣成庞⼤的凝胶，把蛋⽩质、菌体及其它不溶性粒⼦吸附并包裹在其中⽽除去，从⽽加快了过滤速度。1 发酵液为何需要预处理？处理⽅法有哪些？其简要机理如何？

2 凝集与絮凝过程有何区别？如何将两者结合使⽤？

3 除去发酵液中杂蛋⽩常⽤⽅法有哪些？

4 简述胶体双电层结构及稳定性机理?

5 什么是助滤剂和反应剂？能列举1-3个应⽤的例⼦

1. 盐析法：是利⽤各种⽣物分⼦在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引⼊⼀定数量的中性盐，使⽬的物或杂蛋⽩以沉淀析出，达到纯化⽬的的⽅法。2. Ks盐析：在⼀定的pH和温度下改变离⼦强度（盐浓度）进⾏盐析，称作Ks盐析法。Ks盐析法多

⽤于提取液的前期分离⼯作。3．β盐析：在⼀定离⼦强度下仅改变pH和温度进⾏盐析，称作β盐析法。在分离的后期阶段，为了求得较好的分辨率，或者为了达到结晶的⽬的，有时应⽤β盐析法。β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢且变化幅度⼩，沉淀分辨率⽐K S盐析法好。4．亲和沉淀: 利⽤亲和反应原理，将配基与可溶性的载体偶联后形成载体-配基复合物（亲和沉淀剂），该复合物可选择性地与蛋⽩质结合，在⼀定条件下沉淀出来。

四问答1.什么是盐析作⽤？盐析的原理是什么？

答：盐析作⽤：向蛋⽩质溶液中逐渐加⼊中性盐，在⾼盐浓度时，蛋⽩质溶解度随之减⼩，发⽣了盐析作⽤。产⽣盐析作⽤的⼀个原因是由于盐离⼦与蛋⽩质表⾯具相反电性的离⼦基团结合，形成离⼦对，因此盐离⼦部分中和了蛋⽩质的电性，使蛋⽩质分⼦之间电排斥作⽤减弱⽽能相互靠拢，聚集起来。盐析作⽤的另⼀个原因是由于中性盐的亲⽔性⽐蛋⽩质⼤，盐离⼦在⽔中发⽣⽔化⽽使蛋⽩质脱去了⽔化膜，暴露出疏⽔区域，由于疏⽔区域的相互作⽤，使其沉淀。2.如何选择盐析所⽤中性盐？（1）盐析作⽤要强。⼀般来说多价阴离⼦的盐析作⽤强，有时多价阳离⼦反⽽使盐析作⽤降低。

（2）盐析⽤盐要有⾜够⼤的溶解度，且溶解度受温度影响应尽可能⼩。这样便于获得⾼浓度盐溶液，有利于操作，尤其是在较低温度下的操作，不致造成盐结晶析出，影响盐析效果。

（3）盐析⽤盐在⽣物学上是惰性的，不致影响蛋⽩质等⽣物分⼦的活性，最好不引⼊给分离或测定带来⿇烦的杂质。

（4）来源丰富、经济。3.有机溶剂沉淀的原理是什么？

答：亲⽔性有机溶剂加⼊溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分⼦之间的静电引⼒增加，聚集形成沉淀；⽔溶性有机溶剂本⾝的⽔合作⽤降低了⾃由⽔的浓度，压缩了亲⽔溶质分⼦表⾯原有⽔化层的厚度，降低了它的亲⽔性，导致脱⽔凝集。4.有机溶剂沉淀影响沉淀效果的因素有那些？

答：（1）有机溶剂种类及⽤量

（2）pH的影响

（3）温度⽆机盐的含量

（4）某些⾦属离⼦的助沉淀作⽤(5)样品浓度

第三章1.影响发酵液固液分离的因素

2.1）发酵液中悬浮离⼦的⼤⼩

3.2）发酵液的黏度viscosity ：

4.固液分离速度通常与粘度成反⽐，粘度越⼤，固液分离越困难。影响粘度的因素：

5.菌体的种类和浓度(重要因素)

6.培养液中蛋⽩质、核酸⼤量存在

7.培养基成分

8.此外，某些染菌发酵液，如染细菌，则粘度会增⼤。

9.发酵过程的不正常处理，如⼤量过剩的培养基和消沫油加⼊，都会使粘度增⼤。

10.2.常见的固液分离⽅法

11.过滤 filtration

12.过滤操作是借助于过滤介质，在⼀定的压⼒差ΔP作⽤下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，

⽽固体颗粒被截留在介质上，从⽽实现固液分离的单元操作。13.离⼼ Centrifugation