HPLC反相色谱法流动相常用的乙腈和甲醇比较

反相液相色谱法原理：
反相色谱法是一种液相色谱技术，其原理是分析物与疏水固定相之间发生非极性、非特异性的相互作用。

在反相色谱系统中，通常使用的固定相是C18、C8苯基等。

流动相则是极性溶剂，例如水，可含缓冲液或用酸或碱调节pH。

这种色谱技术的分离效果受到流动相的极性和组成等因素的影响。

拓展资料
反相色谱法是以表面非极性载体为固定相，以比固定相极性强的溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式．反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离．在生物大分子分离中，多采用离子强度较低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、异内醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作流动相．普通的反相色谱固定相和孔径大于300Å的硅胶键合烷基固定相应用较为普遍，聚合物基质的反相色谱固定相也有较多应用。

反相高效液相色谱法（RP-HPLC）使用亲水性的固定相和疏水性的移动相，利用样品分子在移动相和固定相之间的互作用力差异进行分离。

一、基本原理：
1.疏水性固定相：反相色谱柱通常使用疏水性的固定相材料，如疏水链状碳氢化合物改性的硅胶或封闭的C18链，使分析物在移动相中具有亲水性，与固定相表面发生疏水作用。

2.亲水性移动相：移动相一般由水和有机溶剂混合而成，亲水性较强。

通过调节有机溶剂的类型和浓度，可以控制移动相的极性，以实现分离不同特性的分析物。

3.受体相互作用：分析物在移动相中通过水合作用与亲水性的移动相发生相互作用，进而与固定相上的疏水链状结构发生疏水作用，从而实现分离。

高效液相色谱法（反相液相色谱）一、液相色谱法方法的分类和选择1、方法的分类：根据流动相和固定相极性的相对强弱，液相色谱法分为正相色谱法和反相色谱法。

两类色谱使用流动相极性顺序与物质的极性流出顺序恰好相反。

正相色谱法中通常固定相的极性较大，，如硅胶、氧化铝等，流动相极性小于固定相的极性。

实验时，流动相的选择从极性小到极性大递增，样品中极性弱的组分最先流出，随后是极性逐步增大的组分流出。

反相色谱中使用的固定相极性小，如C18键合的硅胶固定相，流动相的极性大于固定相的极性。

通常用水-甲醇作流动相时，样品中极性强的组分先流出，随后是极性较小的组分。

流动相的极性变化从最大的水开始，逐步增加甲醇的比例，流动相的极性逐步减弱。

在HPLC中应用最广泛的是反相分配色谱法（常称为反相色谱法）。

它是利用样品组分在流动相和固定相之间的溶解度之差进行分离。

在反相色谱柱中改变流动相组成、进行梯度淋洗和恢复柱子分配平衡容易实现，因此同一柱子可以长时间使用，柱效长久，重复性较好。

在反相色谱法中，极性大的组分先出峰，保留体积小，峰形扩散小，分离效率高，流动相价格便宜，毒性较小，容易得到。

正相色谱法大多利用吸附的原理进行分离，正相色谱法的柱子如使用强极性的流动相（如水、醇等溶剂）会使柱中吸附剂活性失去后很难恢复，特别是分离极性强的组分时，常常因为固定相的吸附作用使保留体积增大，引起峰的扩散和拖尾。

2、方法的选择：HPLC方法的选择主要取决于样品的组成、结构的类型、溶剂性能、相对分子质量范围等。

一般来讲相对分子质量大于2000的高分子化合物，主要采用凝胶色谱法进行分离。

相对分子质量小于2000的化合物可以利用它在水中和有机溶剂中的溶解度及溶解性质进行分离。

如极性大的水溶性化合物和在水中可解离的离子化合物，可用不同类型的色谱柱以离子色谱法进行分离；在水中溶解但不解离的化合物（如糖类）可用反相色谱法进行分离，以甲醇或乙睛-水作为流动相。

一、填空题1、液相色谱中常使用甲醇、乙腈和四氢呋喃作为流动相，这三种溶剂在反相液相色谱中的洗脱能力大小顺序为甲醇〈乙腈<四氢呋喃.2、库仑分析法的基本依据是法拉第电解定律。

3、气相色谱实验中，当柱温增大时,溶质的保留时间将减小；当载气的流速增大时，溶质的保留时间将减小。

二、选择题、1、、色谱法分离混合物的可能性决定于试样混合物在固定相中___D___的差别.A. 沸点差B。

温度差C。

吸光度D。

分配系数.2、气相色谱选择固定液时，一般根据___C__原则。

A. 沸点高低B. 熔点高低C。

相似相溶D。

化学稳定性.3、在气相色谱法中，若使用非极性固定相SE-30分离乙烷、环己烷和甲苯混合物时，它们的流出顺序为（C )A. 环己烷、乙烷、甲苯；B. 甲苯、环己烷、乙烷；C。

乙烷、环己烷、甲苯；D。

乙烷、甲苯、环己烷4、使用反相高效液相色谱法分离葛根素、对羟基苯甲醛和联苯的混合物时，它们的流出顺序为( A ）A. 葛根素、对羟基苯甲醛、联苯；B。

葛根素、联苯、对羟基苯甲醛；C. 对羟基苯甲醛、葛根素、联苯; D. 联苯、葛根素、对羟基苯甲醛5、库仑滴定法滴定终点的判断方式为（B ）A. 指示剂变色法;B. 电位法；C. 电流法D。

都可以三、判断题1、液相色谱的流动相又称为淋洗液,改变淋洗液的组成、极性可显著改变组分的分离效果. （√）2、电位滴定测定食醋含量实验中电位突越点与使用酸碱滴定法指示剂的变色点不一致(×）四、简答题1、气相色谱有哪几种定量分析方法？答：气相色谱一般有如下定量分析方法:内标法、外标法、归一法、标准曲线法、标准加入法。

2、归一化法在什么情况下才能应用？答：归一法具有简便、准确、操作条件对结果影响小等优点，但使用归一法时，试样中所有组分必须全部出峰,某些不需要定量的组分也要测出其校正因子各峰面积，因此该法在使用中受到限制。

当样品中各组分均能流出色谱柱且在色谱图上均显示色谱峰，其它杂质峰干扰较小时可以使用归一法，此方法适用于多组分同时测定。

水液相色谱法(一)基础知识分类号：W13-0一、填空题1．高效液相色谱紫外检测器属于型检测器，只适用于检测那些的物质。

答案：选择能吸收紫外光2．高效液相色谱进样系统包括和两个步骤。

答案：取样进样二、判断题1．色谱柱的分离度表示在一定的分离条件下两个组分在某个色谱柱上分离的好坏。

( ) 答案：正确2．高效液相色谱保护柱起到保护、延长柱寿命的作用。

( )答案：正确3．高效液相色谱梯度洗脱中的低压梯度又称内梯度，高压梯度又称外梯度。

( )答案：错误正确答案为：低压梯度又称外梯度，高压梯度又称内梯度。

4．在正相键合液相色谱法中，固定相是极性的，流动相是非极性溶剂。

( )答案：正确5．在正相键合液相色谱法中，流动相极性变小，色谱保留时间延长。

( )答案：正确6．在正相键合液相色谱法中，键合固定相的极性大于流动相的极性，适用于分离脂溶性或水溶性的极性和强极性化合物。

( )答案：正确三、选择题1．液相色谱法测定中，物质在正相色谱柱中的洗脱顺序是。

( ) A．正己烷、正己醇、苯B．正己烷、苯、正己醇C．正己醇、正己烷、苯答案：B2．液相色谱法测定多环芳烃时，最好选用。

( )A.电导检测器B．荧光检测器C．示差折射检测器答案：B3．液相色谱法测定中，反相色谱法常用的流动相有。

( )A．甲醇B．环己烷C．正己烷答案：A4．适用于分离非极性、极性或离子型化合物。

( )A ．反相键合液相色谱法B ．正相键合液相色谱法C ．离子对色谱法答案：A5．当比较液相色谱检测器的性能时，常使用敏感度这一指标。

敏感度即指信号与噪声的比值(信噪比)等于 时，在单位时间内进入检测器的样品的浓度或质量。

( )A ． 1B ．2C ．2.5D ．3答案：B6．以下4种常用液相色谱检测器中，不属于选择性检测器的是 。

( )A ．紫外吸收检测器B ．荧光检测器C ．电导检测器D ．折光指数检测器答案：D四、问答题1．环境监测分析中常应用高效液相色谱法，试简述高效液相色谱法的特点。

HPLC中固定相和流动相在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离，是色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。

以下是填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。

一、基质（担体）HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。

无机物基质主要是硅胶和氧化铝，无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀；有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯，有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。

1、基质的种类：1）硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。

除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。

硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。

缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。

通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2～8。

硅胶的主要性能参数有：①平均粒度及其分布。

②平均孔径及其分布，与比表面积成反比。

③比表面积：在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。

④含碳量及表面覆盖度（率）：在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。

⑤含水量及表面活性：在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。

⑥端基封尾：在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。

⑦几何形状：硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差，后者无此缺点。

⑧硅胶纯度：对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。

2）氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。

它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。

但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。

不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。

通则0512高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。

注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。

色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。

超高液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。

（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。

常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。

常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。

氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。

有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。

为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。

残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。

（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

反相色谱极性大小出峰顺序反相色谱极性大小出峰顺序：极性大的先出峰反相色谱：根据流动相和固定相相对极性不同，液相色谱分为正相色谱和反相色谱。

流动相极性大于固定相极性的情况，称为反相色谱。

非极性键合相色谱可作反相色谱。

在现代液相色谱中应用最广泛，现代液相色谱分析工作的70%以上是在非极性键合固定相上进行的。

基本原理反相色谱(RPC)是指利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离与纯化的洗脱色谱法。

与HIC一样，RPC中溶质也通过疏水性相互作用分配于固定相表面，但是，RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现出强烈的疏水性。

因此，必须用极性有机溶剂(如甲醇、乙腈等)或其水溶液进行溶质的洗脱分离。

溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。

当固定相一定时，可以通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。

RPC主要应用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可以用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。

由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性的有机溶剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活，所以，以回收生物活性蛋白质为目的时，应注意选用适宜的反相介质。

反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以硅胶为载体，通过表面键合非极性分子层制备。

通过控制反应时间和温度，可获得性能稳定的反相介质。

在硅胶基质的反相填料中，以键合有C18、C8、C2的球形多孔填料最为常见，用途最广。

RPC固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离。

在生物大分子分离中，多采用离子强度较低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、异丙醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作为流动相。

影响因素(1)柱长有机小分子和肽类的分辨率随柱长的增加而增加．但是柱长增加并不能使蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率显著增加．它们在较短的柱子上往往也有很好的分离效果。