富勒烯对PCR反应的抑制作用

第28卷第12期2008年12月环 境 科 学 学 报 Acta Scientiae C ircu mstanti a eV o.l 28,N o .12D ec .,2008基金项目:武汉市青年科技晨光计划(No .20065004116-23);国家自然科学基金项目(No .20537020)Supported by t he W uhan Chen-Guang Progra m f or Young Scienti sts and T echn ici ans (N o .20065004116-23)and t he National N at u ral S cience Found ati on of Ch i na (No .20537020)作者简介:张捷(1974)),女,副教授;*通讯作者(责任作者),E -ma i :l l y76@Biography :Z HANG J i e(1974)),f e m ale ,associ ated p rofessor ;*Corresponding author ,E-m ai:l l y76@张捷,林燕,汪畅,等.2008.富勒烯对PCR 反应的抑制作用[J].环境科学学报,28(12):2573-2577Zhang J ,L i n Y ,W ang C,et a l .2008.Inh i b ition eff ect s of fu ll eren e on t he poly m erase chai n reacti on [J].Act a S cien ti ae C ircum stan tiae ,28(12):2573-2577富勒烯对PCR 反应的抑制作用张捷1,林燕2,汪畅1,梁勇2,3,*,江桂斌3,周群芳31.华中农业大学资源与环境学院,武汉4300702.江汉大学医学院,武汉4300563.中国科学院生态环境研究中心,环境化学与生态毒理学国家重点实验室,北京100085收稿日期:2008-12-22 修回日期:2008-05-16 录用日期:2008-10-07摘要:以110bp 单链DNA 为模板,研究富勒烯(C 60)对聚合酶链式反应(pol ym erase chain reacti on ,PCR)的影响.实验结果表明,随着C 60浓度的增加,PCR 反应被显著抑制;将T aq DNA 聚合酶、单链DNA 模板与C 60孵育后,其PCR 扩增产物均显著减少;增加PCR 反应体系中的Taq DNA 聚合酶量,可消除C 60的抑制作用,但增加起始单链DNA 模板的数量,效应不明显.上述研究结果说明,C 60不仅可抑制Taq DNA 聚合酶活性,同时对DNA 模板也具有一定的损伤作用.关键词:富勒烯;Taq DNA 聚合酶;PCR ;DNA 模板文章编号:0253-2468(2008)12-2573-05 中图分类号:X171.5 文献标识码:AInhi biti on effects of fullerene on the poly m erase chai n reacti onZ HANG Jie 1,L I N Y an 2,WANG Chang 1,L I A NG Yong2,3,*,JI A NG Gu i b i n 3,Z HOU Qunfang21.Co ll ege of Resou rces and E nvironm ent ,H uaz hong Agri cu lt u ralUn ivers i ty ,W uhan 4300702.S chool ofM ed ici ne ,J i angh an U nivers it y ,W uhan 4300563.S tat e K ey Laborat ory ofEnv i ron m en talChe m i s try and E cotoxicology ,Research Cen ter for Eco-En vi ronm entalS ci en ces ,Ch i neseAcade m y of S ci ence ,Beijing 100085R ecei ved 22Dece mb er 2007; recei ved i n rev i sed f or m 16M ay 2008; accepted 7Oct ob er 2008A bs tract :Based on a d esigned 110bp si ngle strand DNA te mp l ate ,a pol y m erase chai n reaction (PCR)m ethod w as estab lis hed t o eval u ate t he effect of C 60on DNA in vitro rep li cati on.Th e res u lts i nd icated t h at C 60cou ld dose -dependen tl y i nh i b it t he generati on of PCR produ cts .A ft er co -i ncubation w i th C 60,the activit y of treated Taq DNA poly m erase w as s i gn ifican tl y i nh i b it ed,and the a mp lifi cati on p roduct of t h e treated DNA te m plat e w as als odecreased.The i nh i b ition effect i nduced by C 60cou l d be eli m i n ated by i ncreas i ng the a m oun t of Taq DNA poly m erase i n t he PCR reacti on sol u tion ,but cou l d n ot be eli m i nated by i ncreasi ng the qu antit y of D NA te mp late .The resu lt s reveal ed thatC 60cou ld i nh i b it the acti vity of Taq DNA pol ym erase ,and m ay have potenti al adverse effects on the DNA t e m p l ate .K eywords :f u llerene ;Taq DNA po l y m erase ;PCR;DNA te mp late1 引言(I ntroduction)碳纳米材料,如富勒烯(C 60)、碳纳米管等具有较好的生物相容性,在基因转染、药物载体、抗病毒、抗氧化等方面已展开了系列研究(Fr i e d m anet al .,1993;Jensen et al .,1996;N aka m ura et a l .,2003).1993年Tokuya m a 等合成并检测了一系列富勒烯衍生物,发现它们在光诱导下能够抑制酶的活性,包括半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等(Tokuya m a et al .,1993).有研究表明,三丙二醇富勒烯(tri m alon ic ac i d C 60,T MA C 60)可抑制M-MLV 逆转录酶、H I V 逆转录酶、DNA 限制性内切酶以及Taq DNA 聚合酶等多种酶的活性,具有一定的临床应用价值(M ashino et al .,2005;M eng et al .,2006;环境科学学报28卷Y ang et al.,2007).但是,其它的研究结果表明,C60、碳纳米管等可造成细胞膜的脂质过氧化,具有一定的细胞毒性和基因毒性,并对多种水生无脊椎动物、脊椎动物具有不可逆的毒性效应(Oberdorster,2004; Oberdorster et al.,2006).Zhao等(2005)通过计算机模拟证明,C60可以与DNA双链或单链非选择性结合,干扰DNA构象的稳定.目前有些研究者认为,C60所造成的脂质过氧化、DNA损伤等多种生物学效应,均与C60催化产生的活性氧和自由基相关(Sayes et al.,2004;Sayes et al.,2005;Lyon et al.,2006;Y a m akosh i et al.,2003).上述研究结果说明,C60可直接或间接干扰蛋白质、酶、DNA等生物大分子构象的稳定,进而产生相应的毒性效应.当前,PCR技术被广泛应用在生命科学、医学等多个研究领域,同时也随着纳米技术的迅速发展产生了/纳米粒子PCR0技术.纳米粒子PCR技术是一种新型的优化DNA扩增的方法,在提高PC R扩增特异性、增加反应灵敏度以及加快反应速度等方面展现了特殊的优化效果(Li et al.,2005;L i et al .,2005;Cui et al.,2004).同时,纳米粒子PCR技术也可作为一种新方法评估纳米材料对细胞内重要的生物大分子(蛋白质和核酸)等构象的影响,本研究中选择单链DNA为PCR模板,考察C60对PCR 扩增的影响,并对抑制作用机理做初步探讨,旨在阐明纳米材料对生物体产生毒性作用的分子机制.2材料与方法(M aterials and m ethods)2.1水溶性C60的制备水溶性C60的制备主要按照Y a m akosh i的方法进行(Y a m akosh i et al.,1994).将0.8mg的C60 (99.5%,A l p ha Aesar)完全溶解于1mL甲苯中,再加入2mL溶解了100m g聚乙烯吡咯烷酮(po l y v i n ylpyrr o li d one,PVP K-30,95%,上海试剂公司)的三氯甲烷,溶液充分混合后真空旋转蒸发干燥,完全去除所有溶剂;加入2mL超纯水溶解干燥产物,经超声处理后得到褐色的澄清溶液,C60的终浓度为400L g#mL-1.2.2C60对PCR反应的影响单链DNA模板序列为5.-GTTGCC AGTG GGGGTTGGGGGGTTGGGGGGTTGGGGGGTTGGGGG GTTGGGTCTCTGCTCTTGGTTTTTTGGTTTTTTGGTTT TTTGGTT TTTTGGTTTTGGTATAGCGC-3.(上海生工公司),引物序列为:上游5.-GTTGCCAGTG-3.,下游5.-GCGCTATACC-3.(上海生工公司).Taq DNA聚合酶购自上海中科开瑞公司.PCR反应体系总体积为20L L:1L L单链DNA模板(100 nm ol#L-1),1L L上游引物(2L m o l#L-1),1L L下游引物(2L m o l#L-1),5L L PCR Buffer(40mmo l#L-1 Tris-HC l p H=8.3,200mmo l#L-1KC,l6mm o l#L-1 M gC l2).加入的C60终浓度分别为10、20、40、60和80L g#mL-1.核酸扩增在TC-312PCR仪(美国TEC HNE公司)上进行,PCR扩增条件为:95e下变性30s,45e下退火30s,72e下延伸40s,循环35周,然后在72e下延伸2m i n.PCR产物长度为110bp,用2.5%琼脂糖凝胶进行电泳分析,溴化乙锭染色后,在JD-801型凝胶成像仪(江苏捷达科技公司)上观察并记录条带强度.2.3单链DNA模板含量对C60作用的影响增加PC R体系中所用单链DNA模板含量,并分别加入80L g#mL-1C60,按照上述条件进行PCR.以不添加C60的PCR体系为对照组,以添加相应浓度的PVP为溶剂对照组.2.4C60对Taq DNA聚合酶活性的影响为研究C60对PC R的作用机制,将Taq DNA聚合酶(2U)单独或与不同浓度的C60在37e下避光孵育12h,10000g、25e下离心5m in,以去除溶液中的C60.取1U孵育后的Taq DNA聚合酶进行后续PCR扩增,同上相应设定对照组和溶剂对照组.2.5C60对单链DNA模板的影响将单链DNA模板单独或与不同浓度的C60在37e下避光孵育2h,在10000g、25e下离心5m in;取上清进行后续PCR扩增,各个对照组的设定同上所述.2.6Taq DNA聚合酶含量对C60作用的影响(酶补偿实验)改变PCR体系中所用Taq DNA聚合酶的含量,并加入80L g#mL-1C60,按照上述条件进行PCR. 2.7数据的统计分析所有实验数据用平均值?标准偏差表示,各实验组与对照组之间用ANOVA进行统计分析,P< 0.05定义为实验组与对照组之间存在显著性差异.3结果(R esu lts)3.1C60对PCR的抑制作用在单链DNA模板起始浓度为5nm o l#L-1的257412期张捷等:富勒烯对PCR 反应的抑制作用PC R 反应体系中加入不同数量的C 60,考察C 60对PC R 的抑制作用.实验结果表明,随着C 60浓度的增加,PCR 扩增产物被明显抑制;当C 60浓度达到80L g #mL -1时,PCR 的扩增被完全抑制,而PVP 溶剂对PCR 有一定的促进作用(图1).图1 C 60抑制PCR 扩增的琼脂糖凝胶电泳结果(M.DNA 分子量标准; 1.对照组; 2.10m g #mL -1P VP 溶剂对照组;3~7.PCR 反应体系中C 60的终浓度分别为10、20、40、60和80L g #mL -1)Fig .1Th e agarose gel stai n i ng res u lt of C 60dose -d ependen t i nh i b ition of the generation of PCR p roducts (M.DNA m arker ;1.control group ;2.10m g #mL -1PVP sol ven t con trol group;3~7.t he fi nal concen trati ons ofC 60i n the PCR reacti on s yste m w ere 10,20,40,60,80L g #m L -1res pecti vel y)与之相对应的是,即使将单链DNA 起始模板浓度增加到10nm ol #L -1和25n m o l #L -1,80L g #mL -1的C 60仍然可以显著抑制其PCR 产物的扩增(图2).考虑到PCR 反应体系组成复杂,含有Taq DNA聚合酶、单链引物、单链模板、M g 2+、dNTP 等多种组分.而现有文献结果表明C 60分子不仅可以和DNA 相结合,同时可以和多种蛋白质或酶相互作用,干扰其所执行的正常生物学功能.基于上述实验结果,可推测C 60的主要靶分子为Taq DNA 聚合酶或DNA 模板.3.2 C 60对Taq DNA 聚合酶的抑制作用为探讨C 60和Taq DNA 聚合酶之间的相互作用,将Taq DNA 聚合酶单独或与C 60共同孵育后,通过PCR 反应评估C 60对Taq DNA 聚合酶活力的影响.实验结果表明,与C 60共孵育后的Taq DNA 聚合酶活力与各个对照组相比,均显著降低,并且C 60对Taq DNA 酶的抑制作用存在浓度依赖性;20L g #m L-1C 60(低浓度C 60组)对酶的活性无显著性影响,80L g #mL -1C 60(高浓度C 60组)完全抑制了酶的活性(图3).另外,单独孵育后的Taq DNA 聚合酶活力与对照组相比,酶活力也有一定的下降,这可能是由于孵育本身造成Taq DNA 聚合酶活性的降低或高速离心所造成的酶浓度的下降.这些实验结果表明,C 60可抑制Taq DNA 聚合酶活性,进而降低DNA 单链模板PC R 产物的生成.2575环 境 科 学 学 报28卷3.3 C 60对DNA 模板的损伤作用考虑到DNA 起始模板数量决定了PCR 产物生成量,本研究中将DNA 模板单独或与C 60共同孵育后,再加入相同数量的Taq DNA 聚合酶进行PCR 反应,通过比较不同处理组PCR 产物的生成来评估C 60对DNA 模板的影响.电泳结果表明,DNA 模板与C 60共孵育后,与对照组相比,其PCR 产物生成量显著性下降(图4); 与酶孵育实验不同的是,20L g #mL -1C 60和80L g #mL -1C 60与DNA 模板共孵育后,均可显著抑制PCR 产物的生成.DNA 模板单独孵育后与对照组相比,其扩增产物也有下降,这可能是由于孵育或离心所造成的干扰.结合前面的酶孵育实验结果,说明C 60不仅可抑制Taq DNA 聚合酶活性,同时可损伤DNA 单链模板,降低DNA 单链模板起始浓度,进而减少了DNA 单链模板PCR 产物的生成.图4 C 60与DNA 模板共孵育后对PCR 反应的抑制效应(小图为琼脂糖凝胶电泳结果.M.DNA 分子量标准;1.对照组;210m g #m L-1PVP 溶剂对照组;3.孵育后对照组; 4.孵育后P VP 对照组;5.20L g #mL -1C 60处理组;6.80L g #mL-1C 60处理组)F i g .4 C 60dose depend ent decrease of t he a mp lifi cati on product ofi ncubated DNA te m plate (Th e li gh t i ntens it y of every treat m en t w as nor m ali zed to the level of DNA te m plat e untreated con trol group (2.5nm ol #L -1)and exp ress ed as a rati o of i t (n =3).Th e i nset s ho w s a typ i cal electrophoresis resu l t)(M.DNA m arker ;1.con trol group ;2.10m gmL -1PVP sol ven t con trol group ; 3.treated contro l group ;4.treat ed PVP con trol group; 5.20L g #mL -1C 60i ncubated group;6.80L g #mL -1C 60i n cubated group )3.4 酶补偿实验由于Taq DNA 聚合酶的数量和酶活力是PCR反应的关键因素之一,为进一步探讨C 60对PC R 影响的作用机制,研究了C 60对不同Taq DNA 聚合酶量所催化的PCR 反应的影响.研究结果表明,80L g #m L -1C 60可显著抑制1U Taq DNA 聚合酶的酶活力,但不能抑制5U 和10U Taq DNA 聚合酶催化的核酸合成.换言之,可通过增加PCR 反应体系中Taq DNA 聚合酶量,来消除C 60的抑制作用(图5);这也从另一方面证明了Taq DNA 聚合酶是C 60作用的靶分子之一.图5 酶补偿实验结果(小图为琼脂糖凝胶电泳结果.M.DNA分子量标准; 1.1U 对照组;2.5U 对照组;3.10U 对照组;4.10U +10mg #mL -1PVP 溶剂对照组;5.1U +C 60组;6.5U +C 60组;7.10U +C 60组)F i g .5Res u lt of Ta q DNA pol y m erase co m pensati on experi m ent (The light i n tens i ty of every treat m entw as nor m ali zed to t h e l evel of Taq DNA pol y m erase un treated con trol group (1U)and expressed as a rati o of it (n =3).Th e i n s et sho w s a typ ical el ectrophores i s res u lt)(M.DNA m arker ;1.1U control group ; 2.5U con trol group;3.10U contro l group ;4.10U contro l group con tai n i ng 10m g mL -1PVP ;5.1Ucontrol group contai n i ng 80L g #m L -1C 60; 6.5U control group con tai n i ng 80L g #mL -1C 60;7.10U con trol group contai n i ng 80L g #mL -1C 60)4 讨论(D iscussion)Taq DNA 聚合酶酶活性的大小取决于其构象的稳定性,尤其是酶活性位点的构象.在光催化条件下,C 60可生成多种活性氧和自由基,可显著造成蛋白质、核酸分子构象的改变,更可造成DNA 的降解.本研究中发现,C 60不仅可以抑制Taq DNA 聚合酶酶活性,同时对DNA 模板有一定的损伤.可能的解释是:由于C 60表面的疏水性,C 60可与Taq DNA 聚合酶的酶活性位点发生相互作用,导致Taq DNA 聚合酶酶活性降低,从而引起PCR 产物显著下降;C 60不仅可与Taq DNA 聚合酶相结合,同时可结合到DNA 单链模板上,干扰引物、底物与模板之间的257612期张捷等:富勒烯对PCR反应的抑制作用精确配对,造成PCR扩增效率的下降;另外,在PC R实验条件下,由于C60特殊的表面性质,可在PC R反应体系中活化生成多种活性氧或自由基,进而造成Taq DNA聚合酶构象的改变以及DNA模板的损伤(降解),最终抑制了PCR反应的进行.纳米材料的环境安全性问题目前已受到广泛关注,迫切需要建立合适的毒性测试方法和生物筛选模型来评估纳米材料的生态风险和环境健康效应,以保障纳米材料得以安全的生产和使用(B rant et al.,2006;Ne l et al.,2006;Serv i c e,2003; Zhang,2003).最近的研究结果表明,C60可造成生物体DNA损伤,具有基因毒性(Lyon et al., 2006).本研究中所介绍的DNA体外复制实验结果也证明,C60可以抑制Taq DNA聚合酶酶活性,同时可损伤单链DNA模板,说明C60存在一定的基因毒性.但需要明确的是生物体体内微环境的复杂性,以及生物体DNA损伤的修复机制,基于不同的实验模型、实验方法可能会得出孑然相反的结论,需要建立更多的实验模型和方法来研究和评估C60以及其它多种纳米材料对生物体的毒性效应及潜在的致毒机制.5结论(Conc l u si o n)C60能够抑制Taq DNA聚合酶酶活性,同时可损伤单链DNA模板,具有潜在的基因毒性效应, C60以及其它多种纳米材料对生物体的潜在毒性效应需引起重视.责任作者简介:梁勇(1976)),男,副教授,主要研究方向为环境内分泌干扰物的生物筛选与致毒机制.E-m a i:l l y76 @263.ne t.R eferences:Brant J A,Lab ille J,Bottero J Y,et a l.2006.C haracterizi ng t he i m pact of preparati on m et hod on full erene cl uster stru cture and ch e m istry [J].Lang mu ir,22:3878)3885C u iD X,T i an F R,Kong Y,et a l.2004.E ff ects of s i ngle-w all edcarbon nanot ubes on the po l y m erase chai n Reacti on[J].Nanotec hno l ogy,15:154)157Fri edm an S H,Deca m p D L,S ij bes m a R P,et a l.1993.Inh i b iti on of the H I V-1proteas e by f u llerene deri vati ves:m odel bu ildi ng s t ud i es and experi m en tal verification[J].J Am Che m Soc,115(15): 6506)6509Jen s en A W,W il son S R,SchusterD I.1996.B i ol ogical app li cati on s of fu ll eren es[J].B ioorgM ed Che m,4:767)779L iH,Hu ang J H,Lv J H,et al.2005.N anoparti cle PCR:nanogol d-assisted PCR w i th enhanced s pecifici ty[J].Ange w Ch e m In t Ed Eng,l44:5100)5103L iM,L i n Y C,W u C C,e t a l.2005.E nhanci ng t h e effi ciency of a PCR us i ng gol d nanoparti cles[J].Nu cleic Acids Res,33(21):e184Lyon D Y,Ada m s L K,Fal kner J C,e t al.2006.An ti b acterial acti vit y of f u llerene w ater suspens i ons:eff ects of preparati on m ethod and particl e s i ze[J].Environ Sci Techno,l40:4360)4366M ash i no T,Sh i m otohno K,Ikega m i N,e t al.2005.H um ani m munodeficiency vir u s-reverse transcriptase i nh ibiti on and hepatiti sC v i ru s RNA-dependent RNA poly m erase i nh i b ition acti viti es off u llerene deri vati ves[J].B ioorgM ed Che m Lett,15:1107)1109 M eng X M,Ch en Z,Li B,et al.2006.I nh i b ition ofM-M uLV reverse tran s cri p t ase acti vit y by f u llerene deri vati ves[J].Ch i nes e S cience Bu ll eti n,51(20):2550)2552N aka m ura E,Is obe H.2003.Fun cti onali zed f u ll eren es i n w ater.Th e firs t10years of t heir che m i stry,b i o l ogy,and nan oscience[J].Acc Che m Res,36:807)815N elA,X i a T,M adler L,e t a l.2006.Toxic potenti al ofm ateri a l s at t h e nano l evel[J].S ci ence,311:622)627Oberdorster E.2004.M anu f act u red nano m ateri als(fu ll eren es,C60)i nduce oxidati ve stress i n the bra i n of j uven ile large m ou t h bass[J].Environ H ealt h Pers p ect,112:1058)1062Oberdorster E,Zhu S Q,B li ck ley T M,et a l.2006.E cotoxicology of carb on-b ased eng i neered nanoparti cles:E ffects of f u llerene(C60) on aqu atic organ i s m s[J].Carbon,40:1112)1120S ayes C M,Fort n er J D,Guo W,et a l.2004.Th e D ifferen ti al Cytotox i city of W ater-Sol ub le Full erenes[J].Nan o Letters,4: 1881)1887S ayes C M,Gobin A M,Aus manc K D,et al.2005.Nano-C60 cyt otoxicit y is du e to li p i d p eroxi dati on[J].B io m ateri als,26: 7587)7595S erv i ce R F.2003.Nano m aterial s sho w signs of tox i cit y[J].S ci ence, 300(11):243Tokuyama H,Y a m ago S,N aka m ura E,et a l.1993.Photoi nducedb i oche m i cal acti v i ty of f u llerene carboxy lic aci d[J].J Am Che mSoc,115(17):7918)7919Y a m akos h iY N,Yaga m iT,Fukuhara K,e t al.1994.Sol ub iliz ati on off u llerenes i nto w at er Pol yvi nylpyrrolidone Appli cab le to B i o l og i calT ests[J].J Ch e m Soc Che m C o mm un,517)518Y a m akos h iY,Um eza w a N,Ryu A,et a l.2003.A cti ve oxygen species generated fro m phot oexci ted f u llerene(C60)as potenti alm ed i ci n es: O#-2vers u s1O2[J].J Am C he m Soc,125:12803)12809Y ang X L,C hen Z,M eng X M,et a l.2007.Inh i b iti on of D NA restri ctive endonucleases and Taq DNA pol ym erase by tri m a l on ic aci d C60[J].C hinese Science Bu lleti n,52(13):1802)1806 ZhangW X.2003.E nvironm ental t echnol ogi es at t h e n anos cal e[J].Environ SciT echno,l37(5):103)108Zhao X,S tri olo A,Cumm i ngs P T.2005.C60b i nds t o and def or m s nucleotides[J].B i ophys,89:3856)38622577。