20110915 利用多参数表面等离子谐振_SPR_生物传感器检测莠去津

第29卷 第5期2010年 9月环 境 化 学E NV I RONMENTAL C H E M I STRY V o.l 29,N o .5Septe m ber 2010 2009年7月23日收稿.*国家自然科学基金项目(60701019);中国科学院重大科研装备研制项目(YZ200807);国家高技术研究与发展计划( 863 计划)(2007AA10Z431).**通讯联系人,Te:l 010 ********;E ma i :l d fc u @i ma i .l i e .ac .cn利用多参数表面等离子谐振(SPR)生物传感器检测莠去津*李 辉 蔡浩原 张璐璐 陈 兴 崔大付**(传感技术国家重点实验室,中国科学院电子学研究所,北京,100190)摘 要 利用自行研制的多参数SPR 生物传感器,对莠去津的检测方法进行了研究.检测时间设定为15m i n ,可以检测到10ng !m l -1的莠去津的抑制作用.利用多参数SPR 传感器,可以同时对多种环境污染物进行检测,实现检测过程集成化,提高检测效率,获得对单一组份进行检测无法得到的全面和深入的信息.关键词 莠去津,多参数,SPR 生物传感器.农药莠去津(A trazi n e)是广泛使用的除草剂之一.虽然目前莠去津被列为低毒类农药,但是它在环境中的残留时间较长,并具有生物累积性,会破坏生态环境尤其是导致大范围的水污染,最终对人体健康造成直接或间接的不良影响[1],因此检测环境以及农产品中的莠去津残留具有重要意义.中国农业部制定的国家强制性标准(G /SPS /N /C H N /87)规定莠去津在农田灌溉水中的限量标准为0.15m g !kg -1,在苹果和梨中的最大残留限量为0.2mg !kg -1.水中莠去津含量的常规测定方法包括高效液相色谱、气相色谱质谱联用(GC MS )等,这些方法准确度及精密度均较高,但是具有待测样品前处理过程复杂,操作过程繁琐等缺点.基于表面等离子谐振(Surface Plas mon Resonance ,SPR)效应的生物传感器工作原理是:将能够与待测物结合的物质固定在传感器芯片上,当待测物流过芯片表面是与固定在芯片表面的物质结合,引起芯片表面光学参数的变化,这种变化以电信号的形式表现出来,不需要标记即可对分子间的相互作用进行实时监测,已被广泛应用于药物研究,食品分析、环境监测等许多领域[2 7].表面等离子谐振(SPR)检测法与高效液相色谱、气相色谱质谱联用(GC MS )技术相比具有不需要特别的样品预处理、操作过程简单、无毒环保、容易实现便携式现场检测等特点,因此可以作为一种快速筛选技术.与常用的快速检测技术酶联免疫(ELI SA )法相比,表面等离子谐振(SPR )检测法具有如下特点:(1)不需要对抗体进行标记,检测方法的建立更为容易.(2)需要的样品量少.(3)利用SPR 生物传感器可以实时监测抗原抗体的结合程度,通过动力学特性绘制标准曲线,减少不必要的反应时间,克服了EL I SA 等终点反应的盲目性.目前,SPR 传感器正在向便携式、阵列化发展.便携式SPR 传感器能够使检测随时随地进行,阵列化的多参数SPR 传感器则能够同时对多种物质进行快速分析.本文研究了利用多参数SPR 传感器[8 11]检测莠去津的方法.实验采用抑制法,将莠去津 蛋白耦联物固定在芯片的表面,莠去津的单克隆抗体与可能含有莠去津的样品混合后流过芯片表面,如果样品中含有莠去津,则莠去津与抗体的结合将抑制抗体与芯片表面的莠去津 蛋白耦联物结合,所得的传感器响应值与样品中的莠去津浓度成反比.该方法不依赖待测物的化学性质,具有通用性,只要具有能够与待测物特异性结合的物质(如抗体),即可对待测物进行检测.将不同种类的抗原固定在阵列芯片表面不同的阵列点上,配合多通道流体控制系统,即可在同一芯片的不同阵列点上实现多种不同物质的同时检测.1 实验方法1.1 试剂和仪器莠去津标准品(纯度96.4%)由国家标准物质研究所提供.莠去津单克隆抗体及莠去津 蛋白耦联5期李辉等:利用多参数表面等离子谐振(SPR)生物传感器检测莠去津967物由中国原子能科学研究院赠送,N 羟基琥珀酰亚胺(NH S)、N 乙基 N∀ (二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)购自ACROS公司.莠去津标准品用乙醇溶解为1m g!m l-1的储液.流动相缓冲液为H BS EP缓冲液(10mm ol!l-1 H epes,p H7.4,150mm ol!l-1N a C,l0.005%(V/V)Surfactant P20,3mm ol!l-1EDTA),抗原抗体反应缓冲液为PBS缓冲液(2mm o l!l-1N a H2PO4,2mm ol!l-1Na2H PO4,150mm o l!l-1N a C,l p H7.4).缓冲液在使用前均经0.22 m的微孔滤膜过滤和超声脱气处理.实验所使用的高通量、多组份图像SPR生化系统分析[8]为本实验自行研制,可高通量、实时检测多处生物分子之间的相互作用.它采用机器手自动进样和高精度面阵CCD图像检测以及阵列化多单元SPR敏感芯片,半导体激光器发出的波长为650n m的光束,经过准直和扩束系统,进入三棱镜,照射在敏感芯片上,光束被反射进入高分辨率CCD进行光强检测,并通过计算机记录其结果,从而实现对芯片表面的分子间的相互作用的实时分析.1.2 生物芯片的制备莠去津 蛋白耦联物在芯片表面的固定采用共价固定的方法.可以将芯片安装在仪器中,利用蠕动泵控制不同的溶液在芯片表面的流动,从而实现在线固定;也可以在仪器外利用点样仪实现线下固定.在线固定的方法如下:将0.4m ol!l-1EDC和0.1m o l!l-1NH S(1#1;V/V)等体积混合后注入仪器中,对芯片表面进行活化,流速为10 l!m in-1,活化时间为7m i n.将莠去津 牛血清白蛋白耦联物用p H4.2的0.2m o l!l-1醋酸缓冲液稀释适当的倍数后以10 l!m i n-1的流速注入仪器中,与芯片表面的指定阵列点反应10m i n.最后以10 l!m i n-1的流速通入1m o l!l-1乙醇胺(p H8.5)反应7m i n以灭活剩余的酯键. 1.3 芯片表面阵列点的光学一致性测量具有不同折射率的溶液通过芯片表面时所产生的信号差值,对芯片表面各点的光学一致性进行研究.先通入HBS缓冲液,待基线稳定后将0.4m o l!l-1EDC和0.1m o l!l-1NH S(1#1;V/V)等体积混合后注入仪器中,稳定后记录相对响应值,并对芯片表面各阵列点所得的相对响应值进行比较.1.4 抗体工作稀释度的选择莠去津单克隆抗体用PBS缓冲液稀释成不同的浓度(1#100,1#500,1#1000,1#2000),与不同浓度(如0,1,10,100,1000ng!m l-1)莠去津溶液在室温下(20∃1)%以一定比例混合后,以10 l!m i n-1的流速通入芯片表面,反应10&20m i n后记录相对响应值,选择合适的稀释度作为抗体工作浓度.1.5 芯片的再生以10 l!m in-1的流速通入0.1m ol!l-1H C l对芯片表面进行再生.1.6 构建标准曲线工作浓度抗体与不同浓度莠去津溶液,在室温下(20∃1)%以一定的比例混合后以10 l!m i n-1的流速流经芯片表面,反应15m i n后通入PBS缓冲液,记录相对响应值.以抑制率(阳性样品所得的相对响应值与阴性对照所得的相对响应值的比值)为纵坐标,莠去津浓度为横坐标,绘制标准曲线.1.7 抗体的特异性用磺胺二甲嘧啶的表观浓度值,即利用上述方法对100ng!m l-1的磺胺二甲嘧啶溶液进行测试,所得的响应值对应于莠去津检测标准曲线上的莠去津浓度值表示抗体的特异性.2 结果与讨论2.1 芯片表面阵列点的光学一致性结果表明,芯片各阵列点具有很好的光学一致性,相同折射率变化(H BS缓冲液 EDC:NH S混合液)所引起的平均相对响应值为12000I U,相对标准偏差小于6.9%.2.2 芯片表面抗原的固定量对检测的影响利用多参数SPR传感器,研究了传感器表面抗原固定量的多少对检测的影响.通过改变芯片表面不同阵列点与抗原接触的时间(2&20m i n)实现了在不同阵列点上固定不同量的抗原:一种方式是在线固定,即将传感器芯片置于仪器中,通过蠕动泵控制抗原溶液在流通池内的流动,同时通过传感器所传968环 境 化 学29卷出的图像监测溶液流动所经过的位置,打开蠕动泵,使液体流动3s,然后关闭蠕动泵,使液体在指定阵列点上停留2m i n,重复此过程.另外一种是在仪器外进行,每间隔2m in,利用接触式点样仪在芯片表面不同阵列点滴加相同浓度的抗原.抗原固定完成后,在微阵列芯片表面通入同一浓度的抗体,对各阵列点表面对应的响应值进行分析.利用第一种固定方式可以监测抗原的固定量,通过抗原固定前后基线的变化值对抗原的固定量进行定量分析.将通入抗体后所得的相对响应值为纵坐标,抗原固定量为横坐标作图,可以得到近似于 S型曲线,即在一定范围内,抗原固定的量越多,所得的相对响应值越大.利用第二种固定方式不能够对抗原的固定量进行定量分析,且得到的相对响应值和抗原固定量之间的关系不如第一种方法明显,可能是由于接触式点样方式存在点样形状的不均一性,以及开放环境下抗原溶液浓度变化造成的.2.3 莠去津的检测图1是利用SPR传感器检测莠去津的动态曲线,包括五个连续的检测过程(包含再生),所使用的抗体稀释浓度为1#100.莠去津单克隆抗体与芯片表面固定的抗原结合后产生上升的响应值,形成指数增长曲线.抗体与样品混合物后所得的相对响应值与样品中莠去津的浓度成反比.通入再生液后,结合在芯片表面的抗体很容易被洗脱,基线降至抗体结合前的高度,芯片得以再生,说明该抗体与抗原的之间的解离速度较快.具有较强亲合力的抗体往往可以得到很高的检测的灵敏度.然而,如果具有较高亲和力对应的解离常数小,则解离速度慢,芯片表面很难再生.而再生过程对于高质量数据的获得、芯片的反复利用以及降低检测成本又非常重要.图1 典型的检测曲线显示了五个检测循环(1)0ng!m l-1(2)10ng!m l-1(3)50ng!m l-1(4)100ng!m l-1(5)500ng!m l-1Fig.1 T ypical detecti on curve sho w s four detection cyc l es图2为检测时间设定为15m in的条件下,利用SPR传感器免疫法检测缓冲液中的莠去津所得的标准曲线.对每一个浓度进行重复测试(5次)的标准偏差小于15%.图2 利用SPR传感器检测莠去津的标准曲线Fig.2 T he cali brati on curve fo r a trazi ne检测时间可以根据抗原抗体结合响应值的大小,结合实际检测要求进行设定.时间越长,反应越充分,则对应的检测限越低.从中可以看出,将检测时间设定为15m i n,利用SPR生物传感器可以检测到10ng!m l-1的莠去津的抑制作用.但是不同浓度的莠去津所产生的抑制反应的差距不够明显,10005期李辉等:利用多参数表面等离子谐振(SPR)生物传感器检测莠去津969ng!m l-1的莠去津溶液的抑制率也未达到50%.实验中改变抗体的稀释度也没有明显的效果.进一步的实验将筛选出亲和力更高的抗体从而使标准曲线得到优化.实际水样中的基质对于检测的影响可以通过参比表面去除,特别混浊的样品通过简单过滤即可进行检测.2.4 抗体的特异性100ng!m l-1的磺胺二甲嘧啶的表观浓度值为0ng!m l-1,说明抗体具有较高的特异性.3 结论本研究利用自制的SPR生物传感器对莠去津快速检测方法进行了研究,并对检测过程中所涉及到的问题进行了讨论.初步的实验结果是检测时间为15m i n,可以检测到10ng!m l-1的莠去津的抑制作用.该检测方法可通过筛选高亲和力的抗体进一步得到优化,以提高灵敏度,满足实际应用的需要.参 考 文 献[1] H ayes T B,Co lli ns A,Lee M,et a.l H er m aphroditi c,de m ascu li n ized frogs after expos ure to the h erb ici de atrazi ne at l ow ecologicall yrelevant doses[J].Proc NatlAcad S ciU S A,2002,99(8)#5476 5480[2] Indyk H arvey E,Filonz iEn r co L.D eter m i nati on of lactof erri n i n bov i ne m il k,col ostrum and i nfan t f or mu las by op tical b i osensor anal ys i s[J].I n tern ati ona lDairy Jou rnal,2005,15(5)#429 438[3] S ternesjo,M ellgren C,B j ork L.Deter m i nation of s u lfa m et hazi n e res i dues i n m il k by a s u rface p l as m on res onance b ased b i osensor ass ay[J].Anal B i oche m,1995,226(1)#175 181[4] W u C M,L i n L Y.I m m ob iliz 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崔大付,王于杰,蔡浩原,等.SPR生化分析仪对6 氧甲基鸟嘌呤 DNA甲基转移酶的检测[J].自然科学进展,2003,13(8)#874 876THE STUDY OF SPR B I OS ENS OR DETECT IONMETHOD FOR ATRAZ INELI H ui CAIH aoyuan Z HANG Lulu C HEN X i n g CUI Dafu (S tate K ey Lab of Transdu cer Techn ol ogy,I n stitute of E l ectron i cs,C h i nes e A cade m y of S ci en ces,B eiji ng,100190,Ch i na)ABSTRACTA self developed surface plas m on resonance(SPR) based biosensor w as used to study the detection m ethod for atrazine.An i n h i b iti o n assay fo r m at w as applied.The standard curve w as constr ucted and the i n h i b iti o n effect of10ng!m l-1atrazine could be detected w it h the detecti o n ti m e15m i n.The m ulti ana l y te SPR biosensor could be used to perfor m mu lti analysis so as to i m prove the detecti o n efficiency and he l p to obtai n i n for m ation wh ich is m ore thorough and co m prehensive than that fro m si n gle analysis.It has pro m ising app lications.K eyw ords:A trazi n e,m u lti analyte,surface plas m on resonance b i o sensor.。