米曲霉GX0011_果糖基转移酶的分离纯化_覃益民
- 格式：pdf
- 大小：307.60 KB
- 文档页数：5
文档推荐
-
果聚糖果糖转移酶的研究进展_杭华页数:6
下载文档原格式
合集下载
米曲霉β呋喃果糖苷酶基因克隆及生物信息学分析
摘 要：Ｄ．呋喃果糖苷酶水解蔗糖和低聚果糖，酶法生产高纯度低聚果糖，必须抑制或消除Ｄ．呋喃果糖苷酶的 水解活性。本研究以工业生产低聚果糖的米曲霉菌株ＧＸ００１５为研究材料，采用ＲＴ．ＰＣＲ技术，克隆获得Ｄ．呋喃 果糖苷酶基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＥＵｌ３０９４４）。利用生物信息学手段对Ｄ．呋喃果糖苷酶基因进行分析得知：该酶为 ４５６个氨基酸组成的亲水性膜外蛋白；功能域分析结果显示：该酶从第５２个至第４５６个氨基酸残基之间序列属于糖 苷酶３２家族特征序列，并具有镛苷酶３２家族酶活性中心的（Ｎ／Ｇ）ＤＰ（Ｃ／Ｎ）Ｇ和ＲＤＰ保守序列；米曲霉Ｄ．呋喃果糖 苷酶在进化树上的位置处于酵母菌的转化酶和细菌的六磷酸蔗糖水解酶之间。 关键词：ｐ．呋喃果糖苷酶；克隆；生物信息学分析
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｏｒ ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＦＯＳ ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｎｌｄｙ．ａ １３－ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ
ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｗｉｔｈ ＲＴ—ＰＣＲ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＧＸ００１５ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ａ ｋｅｙ ｓ廿ａｉｌＩ ｆｏｒＦＯＳ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｌｙ．Ｔｈｉｓ ｇｅｎｅ ｗａｓ
根据米曲霉ＲＩＢ４０菌株的１３．呋喃果糖苷酶基因 （ＧｅｎｅＢａｎｋ访问号：ＢＡＥ６１ ７９９）序列设计扩增米曲霉 ＧＸ００１５菌株中１３．呋喃果糖苷酶基因的引物。
上游引物：５’ＧＧＧＱ鱼！△￡￡ＡＴＡＡＴＧＧＴＧ ＡＴＧＣＣＡＧｒｒＩ［１℃ＧＣＡＧＧＡＴＧＣ ３’
下游引物：５‘ＧＧＧＱ△Ｑ￡Ｉ￡ＴＧＡＴＧＣＴＴＣ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ＧｅｎＢａｎｋ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＥＵｌ３０９４４）．Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃａｌｌｙ．Ｔｈｅ
果糖基转移酶及低聚果糖生产研究进展
果糖基转移酶及低聚果糖生产研究进展发布时间：2022-09-25T09:07:29.629Z 来源：《中国科技信息》2022年第33卷10期作者：干昭波刘环崔秀芹王蒙蒙刘丹丹姜继芹崔爱[导读] 文章对果糖基转酶的来源、性质与果糖基转移酶与低聚果糖生产进行阐述，干昭波刘环崔秀芹王蒙蒙刘丹丹姜继芹崔爱山东百龙创园生物科技股份有限公司山东德州 251200摘要：文章对果糖基转酶的来源、性质与果糖基转移酶与低聚果糖生产进行阐述，对其生产当中的相关问题进行分析。
酶催化合成低聚果糖需要的果糖基转移酶重点来源于微生物，源自植物果糖基转移酶难以提取，即便材料易得，可是难以运用在低聚果糖生产。
所以，源于微生物的果糖基转移酶加低聚果糖有着良好的应用前景。
关键词：果糖基转移酶；低聚果糖；生产；研究进展果糖基转移酶叫做合成低聚果糖酶类，其属于水解酶并且有着转移活动的，以及受体互动，可以基于蔗糖与乳糖为原料，合成蔗果三糖、乳果糖等低聚果糖，对人体具有良好的作用。
所以，人们更加重视对果糖基转移酶与低聚果糖的生产。
一、果糖基转移酶来源果糖基转移酶具有两个来源，其一是源于植物，例如洋葱、芦荟等植物，其二源于微生物，例如曲霉、出芽短梗霉等产果糖转移酶的微生物众多，例如酵母、米曲霉等。
果糖基转移酶是胞外酶，能够利用更多菌株选择获得生产需要的产酶菌株，国际也报道各种植物与微生物果糖基转移酶的分离纯化与活性分析[1]。
二、果糖基转移酶与低聚果糖性质果糖基转移酶是存在植物和微生物的糖苷酶。
当前，其基于蔗糖为果糖供体，合成不同的低聚糖、糖苷化合物潜力，备受国际关注。
在受体作为糖醇化合物时，酶反应产物分别是低聚糖与烷基糖苷化合物。
当前已经分离纯化获得不同果糖基转移酶，对其性质研究比较成熟。
源于微生物酶分子较多，与植物对比酶更加耐热。
通过相关研究表明，果糖基转移酶活性的酸碱值与温度范畴分别在5-6.5,50-60℃。
因为反应一般是在较高蔗糖浓度下开展的，所以微生物酶更易使用在商业生产中。
产果糖基转移酶米曲霉菌株的选育
ＵＶＬｉ ｘ ｉｉｅ ５． ％ ｈｇ ｅ ｕ ｔｓ ｈｒｎｓｅ ａ ｅａ ｔｖｔ ａ ｈ ｔａｎＧＸ－ ０１ ． －３ｅ ｈｂ ｔｄ４ ４ ｉｈ ｒ ｒ ｃ ｏ ｙ ａ ｆｒ ｓ ｃｉｉｙｔ ｎｔｅｓｒ ｉ ｆ ｈ ０ ０ Ｋｅ ｙｗｏｒ ｓ： ｒ ｃ ｏ ｙ ａ ｓｅａ ｅ Ａｓ ｒ ｉ ｕ 口 ； ｒ ｅ ｉ ｇ ｍｕ ａ ｅ ｅ ｉ ｄ Ｆ ｕ ｔｓ ｈｒｎ ｆｒ ｓ ； ｐｅｇ ｌ ｓｏ ｌ ｅ ｂ ｅ ｄ ｎ ； ｔｇ ｎ ｓｓ
Ｓ ｂ ｒ ｐｃ ｌ ｏ ｅ ｏ ｒｅＣｏ ｓ ｒａｉｎ ａ ｄ Ｕｔ ｉａｉｎ Ｎａ ｎｎ ３ ０ ５， ａ ｇ ｉ Ｃｈｎ ； ． ｌ ｇ ｆＬ ｅＳ ｉ ｎ ｅａ ｄ ｕ ｔｏ ｉ ａ ｒ ｓ ｕ ｓ ｎ ｅ ｖ ｔ ｎ ｉ ｚ ｔ ， ｎ ｉ ｇ５ ０ ０ Ｇｕ ｎ ｘ ， ｉ ａ ３ Ｃｏｌ ｅｏ ｉ ｃｅ ｃ ｎ Ｂｉ ｏ ｌ ｏ ｅ ｆ
便， 调节血脂 ， 防龋齿 ， 促进钙 、 、 等矿物质 吸收 以 镁 铁 及人体内 Ｂ族维生素 的合成等保健作用【 。
低 聚果糖可通过微生物发 酵法进 行生产 ，生产 所
用菌株多为黑 曲霉和出芽短梗霉 等 。赵 玉秀等曾对 果 糖基转移酶进行 了分离纯化 以及酶 学性质 研究［－， ３７ ，］ ６
低 聚果 糖（ ｒｃ —ｌ ｏａｃ ａ ｄ ， Ｏ ）又称寡果 Ｆ ｕｔ ｏ ｇｓｃｈｒ ｅ Ｆ Ｓ ， ｏ ｉ ｉ 糖或蔗果三糖族低 聚糖 ， 分子式为 Ｇ Ｆ Ｆ ｎ ｌ３ Ｇ — — ｎ（ ＝ 一 ； ：
果糖基转 移酶酶 活的报道 尚少 。本研究 通过紫外线 、
紫外线 和氯 化锂 复合诱 变 、 微波 、 微波 和氯化 锂复合 诱变 等 ４种 方法 ，对本室 筛选 获得 的 已用于 工业 化 生产 的米 曲霉 菌株 Ｇ ～ ０ ０进行 了诱变研 究 ，旨在 Ｘ ０１ 得到高 酶 活的菌株 ，以降低低 聚果 糖工业 化 生产 的
Ｓ ｂ ｒ ｐｃ ｌ ｏ ｅ ｏ ｒｅＣｏ ｓ ｒａｉｎ ａ ｄ Ｕｔ ｉａｉｎ Ｎａ ｎｎ ３ ０ ５， ａ ｇ ｉ Ｃｈｎ ； ． ｌ ｇ ｆＬ ｅＳ ｉ ｎ ｅａ ｄ ｕ ｔｏ ｉ ａ ｒ ｓ ｕ ｓ ｎ ｅ ｖ ｔ ｎ ｉ ｚ ｔ ， ｎ ｉ ｇ５ ０ ０ Ｇｕ ｎ ｘ ， ｉ ａ ３ Ｃｏｌ ｅｏ ｉ ｃｅ ｃ ｎ Ｂｉ ｏ ｌ ｏ ｅ ｆ
便， 调节血脂 ， 防龋齿 ， 促进钙 、 、 等矿物质 吸收 以 镁 铁 及人体内 Ｂ族维生素 的合成等保健作用【 。
低 聚果糖可通过微生物发 酵法进 行生产 ，生产 所
用菌株多为黑 曲霉和出芽短梗霉 等 。赵 玉秀等曾对 果 糖基转移酶进行 了分离纯化 以及酶 学性质 研究［－， ３７ ，］ ６
低 聚果 糖（ ｒｃ —ｌ ｏａｃ ａ ｄ ， Ｏ ）又称寡果 Ｆ ｕｔ ｏ ｇｓｃｈｒ ｅ Ｆ Ｓ ， ｏ ｉ ｉ 糖或蔗果三糖族低 聚糖 ， 分子式为 Ｇ Ｆ Ｆ ｎ ｌ３ Ｇ — — ｎ（ ＝ 一 ； ：
果糖基转 移酶酶 活的报道 尚少 。本研究 通过紫外线 、
紫外线 和氯 化锂 复合诱 变 、 微波 、 微波 和氯化 锂复合 诱变 等 ４种 方法 ，对本室 筛选 获得 的 已用于 工业 化 生产 的米 曲霉 菌株 Ｇ ～ ０ ０进行 了诱变研 究 ，旨在 Ｘ ０１ 得到高 酶 活的菌株 ，以降低低 聚果 糖工业 化 生产 的
β-果糖基转移酶和β-呋喃果糖苷酶的分离纯化
β-果糖基转移酶和β-呋喃果糖苷酶的分离纯化杨正茂;秦克亮;赵玉秀;杨光礼【期刊名称】《中国医药工业杂志》【年(卷),期】2002(33)5【摘要】用球磨机 Dyno- Mill破碎低聚果糖产生菌黑曲霉 (Aspergillus niger) SIPI- 6 0 2的菌丝体 ,其离心上清液经硫酸铵分级沉淀、Octyl- Sepharose CL - 4 B疏水层析、Q- Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、Sephacryl S- 30 0凝胶过滤等步骤得到了在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上均呈单带的两种酶:β-果糖基转移酶与β-呋喃果糖苷酶。
前者可将蔗糖转化成低聚果糖 ,而后者则催化蔗糖和低聚果糖的水解反应。
用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得两者的分子量分别为 98.86 k D和 84 .92 k D。
【总页数】5页(P219-223)【关键词】低聚果糖;黑曲霉;β-果糖基转移酶;β-呋喃果糖苷酶;分离纯化【作者】杨正茂;秦克亮;赵玉秀;杨光礼【作者单位】上海医药工业研究院【正文语种】中文【中图分类】Q814.1【相关文献】1.米曲霉产果糖基转移酶发酵条件优化与分离纯化 [J], 史文婷;刘寅;赵越;毛多斌;杨雪鹏2.节杆菌β-呋喃果糖苷酶的纯化及性质研究 [J], 童群义;朱桂兰3.节杆菌β-呋喃果糖苷酶的纯化及性质研究 [J], 童群义;朱桂兰4.米曲霉GX0015 β-果糖基转移酶分离纯化及酶学性质研究 [J], 唐江涛;覃益民;杨梅;姚评佳;魏远安;唐尹平5.米曲霉GX0011 β-果糖基转移酶的分离纯化 [J], 覃益民;苏加坤;唐江涛;王机;姚评佳;魏远安因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
米曲霉GX0011 β-果糖基转移酶的分离纯化
摘 要 ：通过 热变 性 、硫酸 铵分 级沉 淀、Ｄ Ａ ．ｅ ｈｄ ｘ Ａ ５ （ １、Ｏ ｔｌ ｅ ｈｒｓ Ｌ４ 、Ｓ ｐ ａｒｌＳ３ ０ Ｅ Ｅ Ｓｐ ａｅ ．ｏ柱 ） ｃ － ｐ ａ ｅ Ｃ －Ｂ ｅ ｈ ｃ －０ 、 ｙＳ ｏ ｙ
Ｄ Ａ －ｅｈ ｄ ｘ ． （ ２层析 等分离纯化步骤对 本实验室 自行筛选诱变 的米曲霉 Ｇ ０ １ 来源的 ｐ果糖基转移 酶进 行 Ｅ ＥＳｐａｅ ５ 柱 ） Ａ Ｏ Ｘ ０１ ．
Ａｂｔａｔ ｓ ｃ： ｒ
１ｆ ｃ ｓｌ ａｓ ｒ ｅｗａ ｐｒｔｄａ ｄｐ ｒ ｅ ｏ ｔｅ ｓｅｇｉ ｓ ｒｚｅＧ ０ ｈｃ ３ ｒ ｔ ｙｔ ｎｆ ａ ｓｓ ａａ ｎ ｕｉ ｄｆ ｍ ｐ ｒｉｕ ｙ ａ Ｘ ｏ ｗ ｉ －ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｅ ｅ ｉ ｆ ｒ ｈＡ ｌ ｏ Ｉ １ ｈ
ｅｚ ｍｅ ａ ２ ．，１ ７ ｍｇ ａｄ Ｉ ％， ｅｐｃｉｅ ． ｌ ｂａ ｄ ￣ｆｕｔｓｌａｓｅａｅ ｅ ｈ ｉ ｅ ｎｙ ｒ １１ ｅ ７ ９ ５ Ｕ・ － ｎ ７ ｒｓｅｔ ｌ ＴＩ ｏ ｔｉ ｖｙ ｅ ｅ ｎ ｒｃ ｙｔ ｎｆｒｓ ｘ ｉ ｔ ｔ ｏ ｒ ｂ ｓｈ
ｃ ｔｌ ｔ ｅｉ ｔ ｆ ｒ ｅ ｓ ｌ ｒ ｓｅ ｎｌ ｎ ｄｄ ｅ ｏ ｈｏ ａ ｙｈ ｒ ｌｔｃａ ｔ ｔ． ａａｙ ｉ ａ ｔ ｙｏ ｆｕ ｔ ｙ ｔａ ｆｒｏ ｙａ ｃ ｖｉ ｏ ｎ ｏ ｓｎ ｔｓ ｗ ｎ ｙｄ ｏｙ ｉ ｃ ｉ ｙ ｖｉ Ｋｅ ｒ ｓ ￣ ｔｔ ｏ ｉｏ ａ ｃ ａ ｉｅ ； ｙｗｏ ｄ ： ｃｏ ｌｇ ｓ ｃ ｈ ｒｄ ｓ
了分离纯化 ，并通过 Ｓ ．Ａ ＤＳＰ ＧＥ检 测了该酶的纯度和 亚基 分子量 ．结果表 明电泳一条带 ，亚基表 观分子量为 ５１ ｌ ．ｘ ０，
小于多 数文献 报道 的结果。纯化倍 数为 １ １ ，比活和活力回收分别为 １７ ・ｇ ｌ ％。酶 活测 定表明该酶只起到 ２． ７ ９ ５ ｍ －和 ７ Ｕ
Ｄ Ａ －ｅｈ ｄ ｘ ． （ ２层析 等分离纯化步骤对 本实验室 自行筛选诱变 的米曲霉 Ｇ ０ １ 来源的 ｐ果糖基转移 酶进 行 Ｅ ＥＳｐａｅ ５ 柱 ） Ａ Ｏ Ｘ ０１ ．
Ａｂｔａｔ ｓ ｃ： ｒ
１ｆ ｃ ｓｌ ａｓ ｒ ｅｗａ ｐｒｔｄａ ｄｐ ｒ ｅ ｏ ｔｅ ｓｅｇｉ ｓ ｒｚｅＧ ０ ｈｃ ３ ｒ ｔ ｙｔ ｎｆ ａ ｓｓ ａａ ｎ ｕｉ ｄｆ ｍ ｐ ｒｉｕ ｙ ａ Ｘ ｏ ｗ ｉ －ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｅ ｅ ｉ ｆ ｒ ｈＡ ｌ ｏ Ｉ １ ｈ
ｅｚ ｍｅ ａ ２ ．，１ ７ ｍｇ ａｄ Ｉ ％， ｅｐｃｉｅ ． ｌ ｂａ ｄ ￣ｆｕｔｓｌａｓｅａｅ ｅ ｈ ｉ ｅ ｎｙ ｒ １１ ｅ ７ ９ ５ Ｕ・ － ｎ ７ ｒｓｅｔ ｌ ＴＩ ｏ ｔｉ ｖｙ ｅ ｅ ｎ ｒｃ ｙｔ ｎｆｒｓ ｘ ｉ ｔ ｔ ｏ ｒ ｂ ｓｈ
ｃ ｔｌ ｔ ｅｉ ｔ ｆ ｒ ｅ ｓ ｌ ｒ ｓｅ ｎｌ ｎ ｄｄ ｅ ｏ ｈｏ ａ ｙｈ ｒ ｌｔｃａ ｔ ｔ． ａａｙ ｉ ａ ｔ ｙｏ ｆｕ ｔ ｙ ｔａ ｆｒｏ ｙａ ｃ ｖｉ ｏ ｎ ｏ ｓｎ ｔｓ ｗ ｎ ｙｄ ｏｙ ｉ ｃ ｉ ｙ ｖｉ Ｋｅ ｒ ｓ ￣ ｔｔ ｏ ｉｏ ａ ｃ ａ ｉｅ ； ｙｗｏ ｄ ： ｃｏ ｌｇ ｓ ｃ ｈ ｒｄ ｓ
了分离纯化 ，并通过 Ｓ ．Ａ ＤＳＰ ＧＥ检 测了该酶的纯度和 亚基 分子量 ．结果表 明电泳一条带 ，亚基表 观分子量为 ５１ ｌ ．ｘ ０，
小于多 数文献 报道 的结果。纯化倍 数为 １ １ ，比活和活力回收分别为 １７ ・ｇ ｌ ％。酶 活测 定表明该酶只起到 ２． ７ ９ ５ ｍ －和 ７ Ｕ
一株曲霉果糖转移酶酶学性质及底物特异性
一株曲霉果糖转移酶酶学性质及底物特异性
王立梅;周惠明
【期刊名称】《食品科学》
【年(卷),期】2006(027)003
【摘要】一株野生曲霉(Aspergillus sp.JN19)所产果糖转移酶为胞内酶,该酶的最适反应温度为50℃,在45～52℃范围内能够保持较高的酶活性;反应的最适pH为5.5,pH在4.0～6.0的范围内酶活力稳定;Mg2+对该酶具有激活作用,可以使酶活力提高2.2倍,Cu2+则完全抑制果糖转移酶活力;该酶能够催化蔗糖分子中的果糖基转移形成新的低聚糖;该酶具有广泛的受体特异性.
【总页数】4页(P79-82)
【作者】王立梅;周惠明
【作者单位】江南大学食品学院,江苏,无锡,214036;江南大学食品学院,江苏,无锡,214036
【正文语种】中文
【中图分类】Q555.4
【相关文献】
1.一株曲霉果糖转移酶的发酵条件及转果糖基活性 [J], 王立梅;周惠明
2.米曲霉GX0015 β-果糖基转移酶分离纯化及酶学性质研究 [J], 唐江涛;覃益民;杨梅;姚评佳;魏远安;唐尹平
3.果糖基转移酶AoFT在毕赤酵母中的表达与纯化及其酶学性质研究 [J], 魏涛; 赵彩梦; 郏未未; 黄申; 毛多斌
4.果糖基转移酶AoFT在毕赤酵母中的表达与纯化及其酶学性质研究 [J], 魏涛;赵彩梦;郏未未;黄申;毛多斌
5.低聚果糖合成酶──果糖转移酶的部分酶学性质研究 [J], 江波;王璋
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
米曲霉耐盐蛋白酶的分离、纯化及其耐盐机制初步研究
米曲霉耐盐蛋白酶的分离、纯化及其耐盐机制初步研究米曲霉耐盐蛋白酶的分离、纯化及其耐盐机制初步研究米曲霉蛋白酶的耐盐性与酱油蛋白质利用率和氨基酸含量密切相关,目前对米曲霉3.042（Aspergillus oryzae 3.042）蛋白酶的耐盐性及其耐盐机理研究较少且不够深入。
因此,选育高产蛋白酶米曲霉并研究其所产蛋白酶的耐盐机制具有重要意义。
本文以米曲霉3.042（Aspergillus oryzae 3.042）为原始菌株,利用常压室温等离子体诱变（ARTP）技术得到一株高产蛋白酶诱变菌株,从诱变菌株中分离、纯化和鉴定出两种耐盐蛋白酶—天冬氨酰氨肽酶（AAP）与碱性蛋白酶（AP）,并在分子水平上初步阐明了两种蛋白酶的耐盐机制。
（1）利用ARTP技术选育出一株高产蛋白酶米曲霉诱变菌株H8。
采用ARTP诱变技术选育到一株高产蛋白酶、遗传稳定（传代15次）、孢子颜色发生变化的诱变菌株H8,其中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和天冬氨酰氨肽酶酶活比原始菌株分别提高了31.82%、19.36%、20.76%和24.77%。
诱变菌株H8生物量比原始菌株提高2.9%。
应用RT-qPCR方法进一步证实,高产蛋白酶菌株H8中AAP和AP 基因转录水平分别高于原始菌株米曲霉27%和30%,说明AAP基因与AP基因转录水平提高是引起种曲发酵酶活提高的因素之一。
ARTP处理可能加强了米曲霉AAP和AP基因的转录表达,进而提高了两种酶的酶活。
（2）从诱变菌株H8中分离纯化出耐盐天冬氨酰氨肽酶（AAP）并阐明了其初步耐盐分子机制。
利用磷酸盐缓冲液提取、现代色谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）等技术从诱变菌株H8中分离纯化和鉴定出耐盐蛋白酶—AAP。
结合理化特性分析可知该酶分子量约57 kDa含有Zn2+,其最佳和最稳定的pH值和温度分别为7和50°C。
蛋白质同源建模、分子动力学模拟、二级结构、酸性残基和内部残基疏水性分析表明,与对照蛋白酶相比,该酶在高盐环境下有序二级结构含量较高、水合表面酸性残基与特定碱性残基之间形成的盐桥较多、内部残基疏水性较强,这是该酶可能的耐盐机制。
米曲霉β-呋喃果糖苷酶基因克隆及生物信息学分析
米曲霉β-呋喃果糖苷酶基因克隆及生物信息学分析唐江涛;覃益民;杨梅;姚评佳;魏远安;唐尹萍【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2008(029)006【摘要】β-呋喃果糖苷酶水解蔗糖和低聚果糖,酶法生产高纯度低聚果糖,必须抑制或消除β-呋喃果糖苷酶的水解活性.本研究以工业生产低聚果糖的米曲霉菌株GX0015为研究材料,采用RT-PCR技术,克隆获得β-呋喃果糖苷酶基因(GenBank 登录号:EU130944).利用生物信息学手段对β-呋喃果糖苷酶基因进行分析得知:该酶为456个氨基酸组成的亲水性膜外蛋白;功能域分析结果显示:该酶从第52个至第456个氨基酸残基之间序列属于糖苷酶32家族特征序列,并具有糖苷酶32家族酶活性中心的(N/G)DP(C/N)G和RDP保守序列;米曲霉β-呋喃果糖苷酶在进化树上的位置处于酵母菌的转化酶和细菌的六磷酸蔗糖水解酶之间.【总页数】4页(P208-211)【作者】唐江涛;覃益民;杨梅;姚评佳;魏远安;唐尹萍【作者单位】广西大学化学化工学院,广西,南宁,530004;广西大学化学化工学院,广西,南宁,530004;广西大学化学化工学院,广西,南宁,530004;广西大学牛命科学与技术学院,广西,南宁,530004;广西大学亚热带生物资源保护利用重点实验室,广西,南宁,530004;湖北中医学院药学院,湖北,武汉,430065【正文语种】中文【中图分类】Q785;Q811.4【相关文献】1.米曲霉6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gnd)的克隆及生物信息学分析 [J], 吴晶晶;洪志宏;张卡;陈宏文2.节杆菌10137β-呋喃果糖苷酶基因克隆及在大肠杆菌表达 [J], 彭端;蓝东明;王永华3.日本曲霉β-呋喃果糖苷酶基因克隆及在酿酒酵母中的表达 [J], 王立梅;齐斌;周惠明4.不同米曲霉降解草甘膦能力及其甘氨酸氧化酶的生物信息学分析 [J], 李浩;高斌;袁小强;胡明;刘成梅;万茵;付桂明5.米曲霉GX0015蔗糖酶基因克隆及生物信息学分析 [J], 杨梅;唐江涛;唐尹萍;覃益民;姚评佳;魏远安因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酿造酱油米曲霉淀粉酶分离纯化及性质研究
酿造酱油米曲霉淀粉酶分离纯化及性质研究本研究利用两种方法分离纯化出淀粉酶单组分Amylase-2,探究了它的酶学性质,为研究酱油成曲中淀粉酶组分及活力对酱油产量和品质的影响提供理论基础。
优化了检测米曲霉淀粉酶的Starch-PAGE条件。
分离胶中底物淀粉溶液浓度达3.0%,孵育时间为3h时能较为清晰地显示淀粉酶单组分。
在同一底物浓度下,淀粉酶上样量不同,电泳条带上显示出的淀粉酶单组分不同。
采用该法初步鉴定出米曲霉种曲和成曲浸提液都有四个淀粉酶单组分。
按迁移率由小到大的顺序命名为Amylase-1、Amylase-2、Amylase-3和Amylase-4。
其中Amylase-2组分的活性最强。
通过制备电泳纯化出成曲淀粉酶组分中活性最强的组分Amylase-2,经SDS-PAGE电泳检测基本达电泳纯,相对分子质量为52.0kD。
另外,成曲浸提液经硫酸铵沉淀、DEAE-Cellulose-52离子交换柱层析、Sephadex-G-100凝胶过滤层析获得单一的电泳条带,该组分相对分子量为52.0kD,与Amylase-2一致。
通过纯化,淀粉酶的纯度提高了11. 35倍,收得率为7.76%。
酶学性质分析表明:纯化的Amylase-2最适温度50℃,并且在40℃保持较长时间稳定,热耐受性较低。
该酶的最适反应pH为6.2,在中性偏酸范围该酶具有较好的稳定性。
动力学研究表明,40℃时Amylase-2分解可溶性淀粉溶液的动力学常数K<sub>m</sub>和V<sub>max</sub>分别为0.149mg/mL和6.14mg/min。
Mn<sup>2+</sup>强烈激活酶活性,K+、Ca<sup>2+</sup>、Mg<sup>2+</sup>、Zn<sup>2+</sup>对酶活有一定的激活作用, Na<sup>+</sup>、Fe<sup>2+</sup>基本不影响酶活性,但Ba<sup>2+</sup>、Pb+、Cu<sup>2+</sup>等金属离子不同程度抑制酶活性,其中Hg<sup>2+</sup>强烈抑制酶活性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第21卷第4期高校化学工程学报No.4 V ol.21 2007 年 8 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Aug. 2007文章编号：1003-9015(2007)04-0710-05米曲霉GX0011 β-果糖基转移酶的分离纯化覃益民1, 苏加坤1, 唐江涛1, 王机1, 姚评佳2, 魏远安2(1. 广西大学化学化工学院, 广西南宁 530004;2. 广西大学生命科学与技术学院广西南宁 530005)摘要：通过热变性、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex A-50(柱1)、Octyl-Sepharose CL-4B、Sephacryl S-300、DEAE-Sephadex A-50(柱2)层析等分离纯化步骤对本实验室自行筛选诱变的米曲霉GX0011来源的β-果糖基转移酶进行了分离纯化，并通过SDS-PAGE检测了该酶的纯度和亚基分子量。
结果表明电泳一条带，亚基表观分子量为5.1×104，小于多数文献报道的结果。
纯化倍数为121.7，比活和活力回收分别为1975U⋅mg−1和17％。
酶活测定表明该酶只起到转果糖基的作用而无水解活性。
关键词：低聚果糖；米曲霉；β -果糖基转移酶；分离纯化中图分类号：Q814.1 文献标识码：ASeparation and Purification of β-fructosyltransferase from Aspergillus oryzae GX0011QIN Yi-min1, SU Jia-kun1, TANG Jiang-tao1, WANG Ji1, YAO Ping-jia2, WEI Yuan-an2(1. School of Chemistry and Chemical Engineering , Guangxi University, Nanning 530004, China;2. College of Life Science &Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China)Abstract: The β-fructosyltransferase was separated and purified from the Aspergillus oryzae GX0011 which was mutated and screened in the lab by using a successive procedure including heat-denaturing, ammonium sulphate precipitation, column chromatography separation by DEAE-Sephadex A50 (column 1), Octyl-Sepharose CL-4B, Sephacryl S-300 and DEAE- Sephadex A50 (column 2), respectively. The purified enzyme was confirmed to be homogeneous by SDS-PAGE and its molecular weight was estimated to be 5.1×104, which is smaller than that reported in literature. The final purified fold, specific activity and the yield of the purified enzyme are 121.7, 1975 U⋅mg−1 and 17％, respectively. The obtained β-fructosyltransferase exhibits the catalytic activity of fructosyl transfer only and does not show any hydrolytic activity.Key words: fructooligosaccharides; Aspergillus oryzae; β-fructosyltransferase; separation and purification1 引言低聚果糖(Fructooligosaccharides，FOS)因其具有高效增殖双歧杆菌、排毒洁肠、提高人体免疫力和改善脂质代谢(降血脂及胆固醇)等优异性能，逐渐受到消费者的青睐[1~3]。
天然植物存在和从微生物酶法得到的低聚果糖几乎都是直链状，是在蔗糖(GF)分子上以β-1,2糖苷键与1~3个果糖基结合而成蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的混合物，属于果糖和葡萄糖构成的直链杂低聚糖。
合成FOS的酶系有两种来源：一是来自植物[4,5]，二是来自微生物[6,7]，而工业生产主要用微生物的酶源[8~10]。
当以蔗糖为原料采用酶法生产低聚果糖时，除得到低聚果糖，还有少量的果糖产生，有学者[11]认为这是由于起催化作用的β-果糖基转移酶(β-fructosyltransferase, EC 2.4.1.9，FTS)是双功能酶，不仅有催化收稿日期：2006-07-22；修订日期：2006-11-10。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(29772096)；广西高校博士点建设资金资助。
作者简介：覃益民(1962-)，男，广西平南人，广西大学副教授，在读博士生。
通讯联系人：苏加坤，E-mail：sujiakun@第21卷第4期覃益民等：米曲霉GX0011 β -果糖基转移酶的分离纯化711转移果糖基连到蔗糖上产生低聚果糖的作用，还有催化转移果糖基连到水分子上产生果糖的作用，从而降低了低聚果糖的含量。
也有学者[1]认为这两种作用分属两种酶完成，即FTS催化产生低聚果糖，另一种酶β- D-呋喃果糖苷酶(β-D-fructofuranosidase，EC 3.2. 1.26，FFS)水解蔗糖和低聚果糖产生果糖。
为了进一步弄清这些问题，本文就本实验室自行诱变筛选的米曲霉GX0011进行了相关酶的分离纯化研究。
2 材料与方法2.1 材料和仪器考马斯亮蓝G-250(Fluka进口分装)，牛血清白蛋白(中科院上海生化所、电泳纯)，凝胶DEAE-Sephadex A-50、Octyl-Sepharose Cl-4B、Sephacryl S-300 均为Pharmacia，其它均为分析纯试剂。
高效液相色谱仪(配示差折光检测器、美国Waters)，NH2 column (4.6 mm×250 mm、日本 GL Sciences)，高速冷冻离心机(J-20XPI型、美国Beckman)；紫外可见分光光度计(UC1700型、日本岛津)，Vivaflow 50超滤器(德国 Sartorius)，自动液相色谱分离层析仪(MC99-3、上海青浦沪西仪器厂)。
2.2 菌种和培养条件米曲霉GX0011为本实验室自行筛选诱变。
培养基组成(g⋅L−1)：蔗糖24，酵母膏5，K2SO4 1。
接种量为3%，装液量为250 mL培养液，于500 mL摇瓶中在pH 6.5、28℃，150 r⋅min−1摇床培养32 h。
2.3 酶活测定用pH 5.5、50 mmol⋅L−1 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液配制10% (w/v) 的蔗糖溶液作底物, 加入适量的酶液(控制三糖最终生成量小于10％)，40℃水浴振荡反应40 min 后, 立即于100℃沸水浴中15 min, 终止反应，离心，取上清液测定各糖组分含量。
酶活定义如下：在上述反应条件下, 每分钟产生1 µmol 蔗果三糖所需酶量为转移酶1个活力单位(U)。
2.4 糖组分测定用HPLC 法测定，流动相为乙腈/水(75:25，v/v)，流速1.0 mL⋅min−1，35℃柱温下，待葡萄糖、蔗糖和蔗果三糖出峰后，用峰面积归一化法计算各糖组分含量。
2.5 蛋白质含量的测定以牛血清白蛋白作标准，用Bradford法[13]测定。
2.6 电泳分析SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳按文献[14]进行。
2.7 酶的分离纯化[15,16]2.7.1 粗酶液的提取用4-6层纱布把发酵培养的菌体过滤、洗涤、拧干，收集菌丝体。
将菌丝体悬浮于pH 7.050 mmol⋅L−1磷酸缓冲液中，用珠磨机破碎，破碎液以10000 r⋅min−1 4℃离心60 min，去除细胞碎片，得到粗酶液。
2.7.2 热变性将上述离心粗酶液置于50℃水浴热变性50 min，随后10000r⋅min−1 4℃离心60 min取上清液。
2.7.3 硫酸铵分级沉淀在4℃下，把硫酸铵缓慢加入变性后的粗酶液至55％饱和度，后用1 mol⋅L−1 NaOH调pH至7.0，4℃沉淀8 h，10000 r⋅min−1 4℃离心60 min，取上清液，按上述方法继续沉淀至95％饱和度。
过夜，10000 r⋅min−1 4℃ 60 min离心弃上清，以少许pH 7.0 50 mmol⋅L−1磷酸缓冲液溶解沉淀，将溶解液装于透析袋中在pH7.0 50 mmol⋅L−1磷酸缓冲体系透析脱盐24 h，10000 r⋅min−1 4℃ 60 min离心取上清液备用。
2.7.4 DEAE-Sephadex A-50柱层析(1)以pH 7.0 50 mmol⋅L−1磷酸缓冲液三个床体积平衡DEAE-Sephadex A-50离子交换柱(16 mm×300 mm)。
上述酶液先用超滤器浓缩，上样。
用两个床体积平衡液将未被吸附的杂蛋白洗去，随后用含0.0~1.0 mol⋅L−1的NaCl平衡液进行线性梯度洗脱，流速1.5 mL⋅min−1，收集酶活部分，酶液再用截留分子量为10000 (下同)712 高 校 化 学 工 程 学 报 2007年8月Fig.1 The course of heat denaturation的超滤器浓缩。
2.7.5 Octyl-Sepharose CL-4B 柱层析用PH 7.0 50 mmol ⋅L −1磷酸缓冲溶液配制的2 mol ⋅L −1 (NH 4)2SO 4充分平衡Octyl-Sepharose Cl-4B 疏水柱(φ16 mm×300 mm)，向上述浓缩酶液中加入(NH 4)2SO 4粉末，至其浓度为2 mol ⋅L −1，上样。
用两个床体积平衡液将未被吸附的杂蛋白洗去，随后用含2.0~0.0 mol ⋅L −1 的(NH 4)2SO 4洗脱液进行线性梯度洗脱，流速1.0 mL ⋅min −1, 收集酶活部分, 如上超滤浓缩。