昆虫酚氧化酶
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酚氧化酶的作用机理
酚氧化酶是一种重要的生物催化剂,其作用机理涉及到生物体内氧化还原反应的调节和催化。
酚氧化酶广泛存在于多种生物体中,包括植物、动物和微生物,其作用机理主要体现在以下几个方面:
1.底物与活性位点的结合:酚氧化酶能够通过其特定的三维结构使底
物分子与活性位点结合,形成一个稳定的酶-底物复合物。
这种结合可以有选择地促进底物的氧化反应,并提高反应速率。
2.催化氧化反应:酚氧化酶的活性位点通常含有金属离子或辅酶等辅
助因子,这些因子可以促进氧化反应的进行。
在催化过程中,酶分子参与底物的氧化,将氧分子与底物分子结合,并形成产物。
3.协同作用:在反应过程中,酚氧化酶通常与其他辅助酶或辅助因子
共同作用,形成一个催化体系,从而提高反应效率。
这种协同作用有助于维持酶的活性,并保持反应的顺利进行。
总的来说,酚氧化酶的作用机理主要涉及底物与活性位点的结合、催化氧化反应以及与其他辅助因子的协同作用。
这些机理共同作用于生物体内,促进生命活动的正常进行,体现了酚氧化酶在生物体内的重要作用和价值。
酚氧化酶的作用机理全文共四篇示例,供读者参考第一篇示例:酚氧化酶是一种广泛存在于生物体内的酶,负责参与多种生物代谢途径中的化学反应。
它的主要作用是将酚氧化成醛或酮,通过氧化还原反应来转化底物分子。
本文将详细探讨酚氧化酶的作用机理及其在生物体内的重要性。
酚氧化酶的作用机理主要是通过氧化酶催化反应来完成。
其催化过程表现为,在存在氧气和NAD(P)H的情况下,酶催化底物酚被氧化成醛或酮,同时NAD(P)H还原成NAD(P)。
酚氧化酶主要通过与辅助因子一起参与这种反应,辅助因子通常由金属离子或其他辅助蛋白质组成。
在催化过程中,酶会在其活性位点上结合底物分子,并通过氧化底物的羟基来将其氧化成醛或酮,同时还原辅助因子。
酚氧化酶在生物代谢途径中扮演着重要的角色。
在生物氧化过程中,酚氧化酶可以催化底物酚的氧化反应,将其转化为更容易代谢的醛或酮。
这有助于维持细胞内氧化还原平衡,促进细胞的正常代谢。
酚氧化酶还可以作为氧化底物的催化剂参与防御体内自由基的生成,减少氧化应激造成的细胞损伤。
酚氧化酶还在多种生物代谢途径中发挥着重要作用,如植物中色素合成和动物体内神经传递等。
第二篇示例:酚氧化酶是一种重要的生物催化剂,其作用机理涉及到许多复杂的生物化学过程。
在细胞内,酚氧化酶参与了许多生物代谢途径,起着至关重要的作用。
本文将详细介绍酚氧化酶的作用机理,包括其催化反应过程、产物生成及影响因素等方面。
让我们来了解一下酚氧化酶的基本结构。
酚氧化酶是一种酶类蛋白质,通常存在于细胞质中。
其分子结构通常呈现出四聚体或二聚体结构,每个亚基都包含一个辅酶(辅基)和一个蛋白质组成。
酚氧化酶的催化活性主要由其所含的辅酶决定,不同的辅酶决定了酶的催化作用和底物选择性。
酚氧化酶主要通过氧化底物将底物转化为相应的醛或酮。
其催化反应主要遵循以下催化机理:底物与酸基团在酚氧化酶催化下形成氧化过渡态,然后这个过渡态在水的作用下得到进一步氧化,最终生成产物。
多酚氧化酶的酶学性质及其应用摘要:本文论述了多酚氧化酶的酶学性质和它对果蔬类食品的影响,以及如何利用它的酶学性质加以控制。
关键词:多酚氧化酶性质抑制0引言多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶,普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中,甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。
由于其检测方便,是被最早研究的几类酶之一。
自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关,1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化,得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。
多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶,酪氨酸酶,苯酚酶,甲酚酶,邻苯二酚氧化还原酶,是六大类酶中的第一大类氧化还原酶[1]。
1多酚氧化酶的结构特性多酚氧化酶是一种含有Cu2+离子的结构蛋白,可以催化酚类上的羟基,使之转化为醌或催化多酚类变为氧合醌。
因为醌类具有较强的电化学性质,会发生自动氧化、蛋白质的亲核聚合反应及一些二级反应,而这些反应都会导致酶促褐变反应的发生[2]。
多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。
在广义上,多酚氧化酶可分为三大类:单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。
在这三大类多酚氧化酶中,儿茶酚酶主要分布在植物中,微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。
2 多酚氧化酶的来源和制备2.1多酚氧化酶的来源多酚氧化酶普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。
2.2多酚氧化酶的制备制备马铃薯丙酮粉:取50g去皮切丁的马铃薯与60mL丙酮(-20℃)混合粉碎抽滤,滤渣用-20 ℃的丙酮冲洗至白色室温下晾干。
PPO粗提液的制备:5g马铃薯干粉与40mL粗酶提取液混合搅拌1min 静止1hr,4℃离心(4℃,15000rpm,15min)过滤取上清,即得PPO粗提液,粗酶提取液为4.2g+1000mL0.2M PB。
昆虫酚氧化酶[资料]昆虫酚氧化酶酚氧化酶(PO)又称为酪氨酸羟化酶或酪氨酸酶,广泛存在于动物、植物和微生物中,位于黑素细胞中的黑素体内,绝大部分与黑素体膜相结合,只有极少部分以游离状态存在。
不同来源的PO,其生物化学特性具有一定的差异,并且在同种生物的不同器官中也具有不同的特征。
在高等植物中,酚氧化酶通过催化形成黑色素可进入表皮和毛发的角质细胞中,使体表着色。
哺乳动物合成的黑色素可以保护皮肤和,抵御紫外线的辐射,防止内部组织过热等。
酚氧化酶具有独特的双重催化功能,是生物体内黑色素合成的关键酶,与昆虫的发育、伤口癒合和果蔬的褐变有密切关系。
因此多年来,酚氧化酶一直受到学术界的关注,其研究涉及生物、医学、农学、化学、药学等多个学科和领域。
目前已有上百种酚氧化酶的研究报道,来源于20多种生物的酚氧化酶已被测序,近几年来,对该酶的研究愈加深入,已有来自于链霉菌的酚氧化酶晶体结构的报道。
在昆虫体内,PO是一种重要的酶,它在昆虫的变态发育和名疫系统中起着重要作用。
酚氧化酶催化完成的醌鞣化作用可以促进昆虫表皮的硬化与黑化,这个过程对于具有“外骨骼”的昆虫生命过程至关重要。
在昆虫变态的各个阶段,譬如,由新生卵发育为成熟卵、幼虫蜕皮、幼虫化蛹以及蛹羽化为成虫后的体壁及其附肢的黑化和硬化过程都与酚氧化酶的作用息息相关。
因此,酚氧化酶抑制剂的研究可以为发展新型害虫控制剂提供重要线索,特别是研究不同昆虫酚氧化酶特性及抑制剂抑制动力学将会为发现一类全新的、专化性的无公害害虫控制剂提供理论基础和实践参考。
酚氧化酶在昆虫的正常发育过程中具有重要的生理功能:1、参与表皮的硬化和黑化,昆虫的新表皮经过硬化和黑化过程才得以坚硬,从而可以起到支撑和保护整个虫体的作用,硬化过程中,PO产生的醌与角蛋白及甲壳质相互作用,最终形成角质,高度硬化的角质能阻断微生物和异物的入侵。
2、对卵壳的鞣化作用。
3、参与伤害防御,在节肢动物中,PO要参与防御反应和伤口癒合。
一、多酚氧化酶研究概况多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶,普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中,甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。
由于其检测方便,是被最早研究的几类酶之一。
自1883年Yoghid发现日本漆树液汁变硬可能和某种活性物质相关,1938年Keilin D.和Mann G.研究了蘑菇多酚氧化酶的提取和纯化,得到多酚氧化酶并将这类酶称为polyphenol oxidase。
多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶,酪氨酸酶,苯酚酶,甲酚酶,邻苯二酚氧化还原酶,是六大类酶中的第一大类氧化还原酶。
多酚氧化酶的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。
在广义上,多酚氧化酶可分为三大类:单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)。
在这三大类多酚氧化酶中,儿茶酚酶主要分布在植物中,微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。
现在大部分文献所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。
编辑本段二、多酚氧化酶在自然界的分布1植物中的多酚氧化酶及作用在植物(如苹果、荔枝、菠菜、马铃薯、豆类、茶叶、桑叶、烟草等)组织中,PPO是与内囊体膜结合在一起的,天然状态无活性,但将组织匀浆或损伤后PPO被活化,从而表现出活性。
在果蔬细胞组织中,PPO存在的位置因原料的种类、品种及成熟度的不同而有差异,绿叶中PPO活性大部分存在于叶绿体内[7];马铃薯块茎中几乎所有的亚细胞部分都含有PPO,含量大约与蛋白质部分相同[8];在茶叶中的PPO分为游离态和束缚态,前者主要存在于细胞液中属可溶态PPO,而后者则主要存在于叶绿体、线粒体等细胞器中,与这些细胞器的膜系统或其他特异部位结合呈不溶态[9],ThanarajS.N.(1990)研究了茶树新梢中PPO活性及多酚含量对红茶品质的影响,发现PPO活性强,多酚含量高,对红茶品质有利,相反则利于绿茶的生产[10];新鲜的苹果中,多酚氧化酶几乎全部存在于叶绿体和线粒体中。
家蚕表皮酪氨酸酶型和漆酶型酚氧化酶分离纯化及
其酶学性质研究的开题报告
一、选题背景
家蚕(Bombyx mori)是我国重要的经济昆虫,其丝绸产业占据了中国优越的丝绸生产优势,同时也是我国传统的农业产业之一。
丝绸是由家蚕的丝腺分泌的纤维素液体经过加工制成的,而家蚕的表皮酪氨酸酶型和漆酶型酚氧化酶则是丝腺中纤维素合成的关键酶之一。
因此,研究家蚕表皮酪氨酸酶型和漆酶型酚氧化酶的分离纯化和酶学性质将对丝绸产业的发展有着积极的意义。
二、研究内容
本研究计划通过以下几个方面来对家蚕表皮酪氨酸酶型和漆酶型酚氧化酶进行研究:
1. 家蚕表皮酪氨酸酶型和漆酶型酚氧化酶的分离纯化。
可以采用各种生物化学方法,如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等方法将家蚕表皮酪氨酸酶型和漆酶型酚氧化酶进行分离纯化。
2. 酶学性质的研究。
可以对家蚕表皮酪氨酸酶型和漆酶型酚氧化酶的温度稳定性、pH稳定性、催化特性等方面进行研究并进行比较分析。
3. 基因序列分析。
运用PCR扩增法将家蚕表皮酪氨酸酶型和漆酶型酚氧化酶的基因克隆下来,并对其进行基因组序列分析。
三、研究意义
本研究将对家蚕表皮酪氨酸酶型和漆酶型酚氧化酶进行综合分析,有助于深入了解家蚕丝腺合成丝素过程中的各个环节,并为丝绸产业提供技术支持和指导。
同时,本研究也将为酶工程和遗传学等领域的研究提供参考和借鉴。
多酚氧化酶(PPO)检测
多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO),又称为儿茶酚氧化酶,是一类含铜的氧化还原酶,广泛存在于植物、真菌、昆虫的质体中,甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。
多酚氧化酶在茶中的主要作用是催化儿茶素形成邻醍,进一步形成茶黄素等色素物质和香气成分等。
PPO的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。
在广义上,可分为三大类:单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase)、双酚氧化酶(儿茶酚氧化酶catechol oxidse)和漆酶(laccase),现在所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。
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周期:2~3周
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1. 实验步骤(中英文)
2. 相关参数(中英文)
3. 图片
4. 原始数据
5. 多酚氧化酶含量/活性信息。
昆虫酚氧化酶研究综述徐广增;刘守柱【摘要】酚氧化酶广泛存在于动物、植物、微生物等有机体内,是生物体内黑色素合成的关建酶,在昆虫的免疫、防御系统中起重要的作用,可以作为害虫控制的一个重要的作用靶标。
通过对昆虫体内酚氧化酶的激活方式,组织定位,生物学特性和功能的研究,为筛选新型的抑制剂提供理论依据。
%Phenoloxidase is a copper‐containing enzyme widely distributed in animals ,plants and microorganisms ,involved in the synthesis of melanin ,and plays an important role in the immunity and defense system of insects ,then it can be as an important targets against the pest control .To research the way of activation ,organizational orientation ,biological characteristics and functions ,provide theo‐retical basis for screening new inhibitors .【期刊名称】《聊城大学学报(自然科学版)》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】5页(P62-66)【关键词】酚氧化酶;组织定位;酶学特性;抑制剂【作者】徐广增;刘守柱【作者单位】聊城大学农学院,山东聊城 252059;聊城大学农学院,山东聊城252059【正文语种】中文【中图分类】S186酚氧化酶(phenoloxidase,PO)广泛存在于动物、植物、微生物等有机体内,又可称为酪氨酸酶(tyrosinase)或酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase),是生物体内黑色素合成的关键酶.在昆虫的变态发育、免疫和防御系统中,PO都起着重要的作用,因此可作为害虫控制的重要作用靶标.通过研究昆虫酚氧化酶的生物学特性,寻找有效的抑制剂,来筛选合成新型的,有效的生物农药已成为昆虫酚氧化酶研究中的热点.本文综述了昆虫酚氧化酶的基本结构、生物学特性、生理功能及其抑制剂的研究进展,为昆虫酚氧化酶的进一步研究和探讨奠定基础.1.1 PO的在昆虫体内的分布在无脊椎动物,如昆虫中,PO多以无活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase,proPO)的形式存在.大部分昆虫中,proPO是可溶性的,而在一些昆虫表皮中的proPO是不溶性的.特异性的丝氨酸蛋白酶的级联反应能激活无活性的proPO,而丝氨酸蛋白酶本身也以酶原的形式存在,故PO、酶蛋白、模式识别蛋白和蛋白酶的抑制剂组成了一个复杂的酶级联反应系统,即酚氧化酶原激活系统(prophenoloxidase-activated system,proPO-AS)[1].对昆虫生化研究表明,PO主要存在于昆虫的血细胞、血浆中,在中肠、表皮等组织中也有分布.通过对蝗虫(Locutamigratoria)、棉铃虫(Heliothisammigera)、亚洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)等昆虫研究发现PO既存在于血细胞中,也存在于血浆中[2-4];在蟑螂(Periplanetaamericana)中,PO主要存在于血细胞中[5],但在家蚕(Bombyxmorilinnaeus)和烟草天蛾(Manducasexta)中,PO多存在于血浆中,另外,Asano和Ashida[6]还证实在家蚕(B.mori)表皮中存在两种PO形式(F型和S型),其在血细胞中释放出来后,经修饰转运至整个表皮,但转运的机理尚未清楚.Binnington和Barrett[7]在绿蝇(Luciliacuprina)角质的上表皮和原表皮中也发现了PO的存在.并且只有通过人为角质损伤的激活,才能检测到原表皮中PO的活性.在同一种昆虫中,用不同的激活剂去激活,能检测到表达程度不同的proPO,分析原因可能是:(1)不同激活剂的作用位点可能不同;(2)proPO对不同激活剂的敏感程度可能不同;(3)昆虫体内不只存在一种proPO.另外,不同的proPO可能有不同的功能:对几种蚊子研究发现,当暴露于不同的病原菌中时,能检测到不同的proPO基因的表达.果蝇中存在3个独立的proPO基因,冈比亚疟蚊中存在9个独立的该基因.Southern blot和免疫印迹结果表明不只一种proPO存在于史蒂芬塞疟蚊基因组[8].同种昆虫,不同发育时期的同一器官中PO的含量也有所不同:研究发现,黄粉虫体内PO活性随龄期推进而加强,末龄幼虫中PO活性最低,蛹次之,成虫的最高[9],在其体壁硬化过程中,体壁PO活性也随硬化程度的改变而变化,表现出先下降后升高并稳定的趋势[10].1.2 PO的激活PO的活化大致包括:(1)酶自身的催化作用;(2)酶亚单位的聚焦;(3)部分酶蛋白被某种活性物质分解.内源性的激活系统proPO-AS和外源性的激活剂,如:有机溶剂、去污剂或蛋白酶等都可激活PO.但是,不同的激活剂其对PO的激活机理存在较大差异[1].昆虫PO的激活有两种机理:酶原的蛋白裂解激活、去污剂激活.研究表明,具有脂多糖(li-propolysoccharide,LPS),β-1,3-葡聚糖(β-1,3-glucan),肽聚糖(peptidoglycan)和酵母聚糖(zymosan,含β-1,3-葡聚糖)等成分的微生物细胞壁对PO有激活作用,其作用方式是激活丝氨酸蛋白酶后引起丝氨酸蛋白酶的级联反应,从而间接激活PO.组织蛋白酶,胰凝乳酶,胰蛋白酶和枯草菌蛋白酶等蛋白酶对PO也有激活作用,但不同生物种类中PO激活所需的蛋白酶的种类和数量等也有所不同,如:只需一种丝氨酸蛋白酶就能激活螯虾(Pacifastacusleniusculus)的PO[11],而至少需两种丝氨酸蛋白酶才能激活家蚕(B.mori)血淋巴中的PO[12];去污剂有十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)和十六烷基氯化吡啶(cetylpyridinium chloride,CPC)等.另外,乙醇、2-丙醇等有机溶剂和加热、Ca2+等物理化学方法也对PO的激活有促进作用,通过与proPO结合,使其构型发生变化,暴露出活性位点,进而活化PO[13].2.1 PO的活性中心及分子结构通过对家蚕(B.mori)、烟草天蛾(M.sexta)等多种昆虫的酚氧化酶原的cDNA克隆研究发现:PO是具有独特的双重催化功能含铜酶,结构与节肢动物的血蓝蛋白相似,在其活性中心序列都含有两个铜离子的底物羟基结合位点:CuA和CuB,每个铜离子结合3个保守的组氨酸残基(如图1),还有两个芳香基团结合位点,这是酶与底物专一性结合的基础[14,15].在PO的活性中心结构中,三个直立的组氨酸残基的亚氨基以共价键的形式将铜离子固定在活性中心上,两个铜离子之间通过氧原子结合,形成相应的电子通路,但研究发现,两个铜离子间结合的氧原子个数是变化的,因此在氧化反应的过程中,PO存在三种不同的双铜核形式:即氧化态酶(氧-铜离子态Eoxy),还原态酶(铜离子态Emet)和脱氧态酶(亚铜离子态Edeoxy),这三种酶形态的存在和转化也是酚氧化酶双重催化功能的基础(如图2),这说明PO是需氧酶[16,17].2.2 PO的晶体结构Matoba[18]等测定了酚氧化酶(抗生链霉菌Streptomyces castaneoglobisporus)的晶体结构,表明该酶具有一球童蛋白ORF378,其与PO的复合物形状为椭圆形,PO具核心的α螺旋体结构,由4个螺旋体束(α2,α3,α6和α7螺旋)组成,螺旋体束上拥有双铜核的活性中心,其上的每一个铜离子与三个组氨酸相连,构成ORF378,覆盖在PO的整个分子表面,作用应该是阻止底物与酶活性中心的结合,说明在早期阶段就发生了酶催化活性中心上蛋白质折叠,而不是在酶的成熟阶段.王莉[19]等合成了六齿配体N,N,N′,N′-四(2-苯并咪唑亚甲基)-1,2.乙二胺(EDTB)和单核锰(Ⅱ)配合物[Mn(EDTB)](NO3)2 ·DMF,由锰(Ⅱ)分别与两个亚胺基氮原子、配体EDTB苯并咪唑环的4个氮原子发生配位形成的变形八面体结构,并研究了其晶体结构和酚氧化酶(PPO)模拟活性,发现配合物存在PO的活性,且活性在一定范围内随pH的升高而增强.可以猜想,PO的结构可能与合成的配合物的晶体结构相似,而相似率等还需要进一步验证.PO作为一种酶在昆虫体内广泛存在,在其生命过程中也发挥着重要的作用:3.1 参与昆虫的防御机制在昆虫体内,多以无活性的酶原形式存在,病原体入侵后,PO通过级联反应被活化,进而发挥作用,故PO是昆虫体内一种重要的免疫因子.在昆虫分子识别防御系统中,proPO级联反应是一个重要组成部分,PO能参与昆虫表皮的黑化、硬化,坚固的表皮和中肠、围食膜等构成昆虫防御反应的生理屏障, PO在昆虫对入侵病原体的防御反应起重要的作用[4].当昆虫被一些外来物质(如:细菌、寄生虫等)入侵时,昆虫会启动防御反应,对于较小的颗粒异物,能够通过简单的吞噬作用将其消灭,而当异物较大时,吞噬作用难以将其消灭,则宿主内的proPO被激活产生PO,PO会在外来异物的周围产生黑色素沉淀,把异物包裹起来,并将其消灭[20].另外,PO能促进昆虫产生一些氧自由基和半醌、三羟酚等,这些物质具有细胞毒作用或潜在细胞毒作用,也能够增强昆虫的防御能力.3.2 促进伤口的愈合,参与色素的形成昆虫受伤时,昆虫体内的proPO在伤口处被激活而产生PO,PO进一步促进昆虫产生黑色素沉淀,一方面能够有效防止血淋巴的流失,另一方面也能阻止异物的入侵,加速伤口愈合,对虫体产生保护作用.3.3 参与表皮的鞣化、硬化、黑化昆虫的体壁是躯体的最外层组织,是虫体内部器官和外界环境之间的保护性屏障,对昆虫有着极其重要的作用.而昆虫表皮只有经硬化黑化过程后,才能变得坚硬而起到保护作用,其中,PO是在表皮鞣化、硬化、黑化的过程中不可或缺的.昆虫体内常见的鞣化是醌鞣化,而鞣化剂N-乙酰多巴胺(NADA)就是在PO等酶的催化氧化下形成的.NADA能继续被PO氧化为活性更高的N-乙酰多巴醌,后者与蛋白质结合形成壳硬蛋白,促进表皮的硬化[21].4.1 PO的酶活特性随着科技的发展和研究的深入,目前对多种有机体PO的活性都已经熟悉.在植物体的PO可以促进果实褐变(如:西葫芦).在昆虫体内,PO可促进昆虫表皮的黑化和硬化[22].在同种昆虫不同发育时期的同一器官中PO的含量也有所不同,PO 活性受许多因素的影响,包括:pH、底物浓度、温度、有机溶剂、金属离子等.通过研究发现,东亚飞蝗1-5龄蝗蝻和雄成虫在25℃时PO活性达最高,而雌成虫在30℃时PO活性才达到最高值;温度在15℃-45℃变化中,1-5龄蝗蝻PO 活性的变化规律相似,1龄蝗蝻的活性最低,2-4龄PO活性升高,5龄最高,PO 活性的差异显示出不同发育时期东亚飞蝗免疫能力的强弱差异[23].刘春英[22]等研究发现,枣尺蠖PO的最适温度为37℃,最适pH为7.0,但其热稳定性较差,70℃时其活性仅能维持3 min.酶活性都随温度,pH的升高先表现为上升趋势,后逐渐下降.4.2 PO的抑制剂由于PO在有机体生长发育过程中起重要的作用,寻找对PO有活性的抑制剂,研究其抑制动力学及抑制机理,一直是比较热门的领域,这也将成为合成应用于害虫防治的生物农药的突破点.研究发现,许多化合物对PO具有较好的抑制作用,较多的是取代苯酸类(如:对羟基苯甲酸、硫脲等),一些植物中的天然化合物对PO 也有抑制作用(如:槲皮素、银杏叶提取物等).不同的抑制剂对PO的抑制机理也可能不同.肖婷[24]等研究了9种苯胺类席夫碱化合物对菜青虫PO活力的影响,结果表明,9种化合物对PO均有抑制作用,而效果较好的有四种:2-羟基-3-甲氧基苯甲醛缩苯胺、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛缩间氯苯胺、2-羟基-3-甲氧基苯甲醛缩-3,4-二氯苯胺.2-羟基-4-甲氧基苯甲醛缩苯胺对菜青虫的PO也有较高抑制作用,并直接对靶标PO产生作用,而不是通过影响PO结构中的铜离子产生作用[25];缩氨基硫脲类化合物对PO也有较好的抑制作用[26].单宁酸对甜菜夜蛾幼虫的生长和发育也有毒杀作用,并且,研究发现单宁酸对PO的抑制作用是可逆的,属于非竞争性抑制剂[27].另外,放线菌刺糖菌素多孢菌的代谢物多杀菌素(一种抗生素农药),也能有效的抑制PO的活性[28],这也是其对害虫发生毒害作用的作用位点之一.白僵菌侵入昆虫体内后,也会对PO的活性产生一定的影响[29].酚氧化酶在昆虫的变态发育、免疫和防御系统中起着重要的作用,是一种重要的免疫蛋白,因此可作为害虫控制的一个重要的作用靶标,一直是研究的热点.经过多年的研究,人们对PO的激活系统,生物学特性有了深入的了解,在此基础上,进一步寻找有效的生物抑制剂来抑制害虫体内的PO,合理的控制害虫,减少化学药剂对环境的污染,将会有广阔的前景.[1] 李国荣,张士璀,李红岩,等.酚氧化酶研究概况Ⅰ—特性、功能、分布和在胚胎发育中的变化[J].海洋科学,2003,27(4):4-7.[2]Brehelin M,Drif L,Buad L ,et al.Insect haemolymph:cooperation 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1多酚氧化酶(PPO)简介多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶,普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中[1],甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。
多酚氧化酶最早在1895年被发现,直至1937年才被分离出来。
随着研究的深入,将其分为单酚单氧化酶[酪氨酸酶(tyrosinase),EC.1.14.18.1]、双酚氧化酶[儿茶酚氧化酶(catechol oxidase),EC.1.10.3.2]、漆酶(laccase,EC.1.10.3.1)[2]。
2多酚氧化酶的生理功能PPO能催化单元酚和二元酚等多元酚到联苯酚的羟基化以及羟基酚到醌的脱氢反应。
PPO定位于植物叶绿体的类囊体和其它类型质体的基质中,而植物体内PPO的底物存在于液泡中,且通常处于潜伏状态,因此,PPO与底物被区域化分开。
但当植物体内发生生理紊乱或组织受损时,PPO与底物的亚细胞区域化才被打破,PPO的底物被激活。
在PPO的作用下,底物与氧发生反应产生醌,醌在植物体内能发生自身聚合或与细胞内的氨基酸和蛋白质发生反应,产生黑色或褐色的沉积物,这是果蔬等农产品产生酶促褐变的主要原因,同时也是食品加工行业中影响产品的外观、风味、营养和加工性能的重要因素[3]。
另外,PPO 作为一种氧化还原酶还在光合作用中发挥作用。
如调节叶绿体中有害的光氧化反应速度,参与其中电子传递;PPO 还可促进伤口的愈合,也可增加植物对病原体的抗性。
如烟草对炭疽病、黄瓜对黑星病、苹果对轮纹病、棉苗对枯萎病菌、水稻对白叶枯病菌和细菌性条斑病以及番茄对小昆虫的抗性等。
PPO 的作用方式有:1.如番茄的具腺毛状体中含有大量 PPO,PPO 具有存在于表皮中、活化态和可溶性的特性,在毛状体介导的抗病过程中起作用。
2.通过醌共价调节亲核氨基酸形成抗营养机制,直接抵御昆虫和病原体。
3.醌的毒性直接发挥抗病作用。
昆虫酚氧化酶酚氧化酶(PO)又称为酪氨酸羟化酶或酪氨酸酶,广泛存在于动物、植物和微生物中,位于黑素细胞中的黑素体内,绝大部分与黑素体膜相结合,只有极少部分以游离状态存在。
不同来源的PO,其生物化学特性具有一定的差异,并且在同种生物的不同器官中也具有不同的特征。
在高等植物中,酚氧化酶通过催化形成黑色素可进入表皮和毛发的角质细胞中,使体表着色。
哺乳动物合成的黑色素可以保护皮肤和,抵御紫外线的辐射,防止内部组织过热等。
酚氧化酶具有独特的双重催化功能,是生物体内黑色素合成的关键酶,与昆虫的发育、伤口癒合和果蔬的褐变有密切关系。
因此多年来,酚氧化酶一直受到学术界的关注,其研究涉及生物、医学、农学、化学、药学等多个学科和领域。
目前已有上百种酚氧化酶的研究报道,来源于20多种生物的酚氧化酶已被测序,近几年来,对该酶的研究愈加深入,已有来自于链霉菌的酚氧化酶晶体结构的报道。
在昆虫体内,PO是一种重要的酶,它在昆虫的变态发育和名疫系统中起着重要作用。
酚氧化酶催化完成的醌鞣化作用可以促进昆虫表皮的硬化与黑化,这个过程对于具有“外骨骼”的昆虫生命过程至关重要。
在昆虫变态的各个阶段,譬如,由新生卵发育为成熟卵、幼虫蜕皮、幼虫化蛹以及蛹羽化为成虫后的体壁及其附肢的黑化和硬化过程都与酚氧化酶的作用息息相关。
因此,酚氧化酶抑制剂的研究可以为发展新型害虫控制剂提供重要线索,特别是研究不同昆虫酚氧化酶特性及抑制剂抑制动力学将会为发现一类全新的、专化性的无公害害虫控制剂提供理论基础和实践参考。
酚氧化酶在昆虫的正常发育过程中具有重要的生理功能:1、参与表皮的硬化和黑化,昆虫的新表皮经过硬化和黑化过程才得以坚硬,从而可以起到支撑和保护整个虫体的作用,硬化过程中,PO产生的醌与角蛋白及甲壳质相互作用,最终形成角质,高度硬化的角质能阻断微生物和异物的入侵。
2、对卵壳的鞣化作用。
3、参与伤害防御,在节肢动物中,PO要参与防御反应和伤口癒合。
对于小颗粒异物如细菌,宿主可通过吞噬作用来消灭它,当入侵的异物太大而无法被单个血细胞吞噬时,宿主便通过黑色素包囊反应来抵抗和消灭,而PO在这个过程中起重要作用。
当外来物入侵时,酚氧化酶原(proPO)从血细胞中释放出来并被激活成PO,在外来有机体上产生黑色素沉淀通包囊和黑化来限制入侵的外来物,因此,在包囊物的周围、血细胞结节中和感染真菌的角质部位会出现黑色素沉淀。
与此相似,当,操作部位会出现深色色素区,这是由于proPO被蛋白酶水解激活,而激活的PO将酚氧化成醌,最终形成黑色互。
酚氧化酶在伤口处催化产生黑色素沉淀以防止血淋巴丢失,并阻止入侵的微生物乘机进入,由此对有机体产生保护作用。
4、加速伤口的癒合。
5、产生具有细胞毒作用的氧自由基和具有潜在细胞毒作用的半醌及三羟酚,进一步增强寄主的防御能力。
活性氧如超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢是脊椎动物和无脊椎细胞毒性成分,黑色素形成过程中伴随活性氧的产生,同时也产生具细胞毒性的半醌及三羟酚,半醌有结合亲核物质的特性,醌可结合到个来细胞物质的表面,通过形成黑色素包囊来隔离入侵的外来物,并通过醌和其他中间产物产生氧的还原形式来摧毁入侵的微生物或寄生虫。
昆虫表皮通过其中的蛋白与醌反应完成鞣化,使表皮变硬并且获得高度的柔韧性与稳定性。
昆虫中最常见的鞣化是醌鞣化,其中包括O-醌与表皮蛋白的自由氨基成键结合,另一种为β-鞣化,即蛋白与醌在支链β-碳原子上交联。
这两种鞣化剂的前体都是N-乙酰多巴胺(NADA)。
NADA是昆虫醌鞣化过程中(包括卵壳硬化和表皮硬化)普遍存在的鞣化剂,而酪氨酸经酚氧化酶、多巴脱羧酶和乙酰基转移酶作用形成NADA,这是NADA产生的重要途径之一。
在昆虫表皮鞣化过程中,酚氧化酶的存在是必不可少的。
当醌的前体——N-乙酰多巴胺在酚氧化酶作用下被氧化成N-乙酰多巴醌是,其反应性增高,因而易与蛋白质N 端氨基结合,生成淡色的邻苯二酚态蛋白质。
这蛋白质又因N-乙酰多巴醌被还原为N-乙酰多巴胺。
这样蛋白质N端的氨基与醌环结合起来形成壳硬蛋白。
赖氨酸残基的ε-NH2和SH等还可以醌环结合,也就是说,肽链不仅其末端氨基可以与醌环结合,而且肽链中间也可以与醌环直接结合。
在昆虫角质化的色黑而坚硬的表皮形成过程中,还存在醌环的重合和缩合。
另外,酪氨酸的代谢产物NADA由皮细胞分泌进入表皮后,同时与能利用的酰胺基或羟基相互作用。
如上所述,PO是昆虫表皮硬化和黑化过程中的关键性酶,与它紧密相关的醌鞣化作用在昆虫的生命过程中具有重要意义。
由于上述过程同时也是害虫形成防御体系的重要反应,因此酚氧化酶可能作为害虫控制中的一个作用靶标,可通过抑制昆虫酚氧化酶的活力,使害虫丧失防御能力从而间接达到合理控制虫害的目的。
酚氧化酶抑制剂有可能成为继几丁质抑制剂之后一类新的对环境友好的害虫抑制剂。
由于酚氧化酶具有重要的理论意义和发展前景,大量的研究工作集中在此领域,目的在于寻找对酚氧化酶具有活性的抑制剂,并对其抑制动力学和抑制机理进行研究。
因为蘑菇酚氧化酶已有成功的分离纯化产物且性质稳定,所以多以蘑菇酶为研究对象。
虽然该酶与来自昆虫的同类酶系有不同之处,但作为基础研究仍具有重要意义。
从当前的研究资料来看,对酚氧化酶有抑制作用的化合物有多种类型,其中以酮醇和取代苯酸类化合物较多。
抑制类型与酶源、底物和抑制剂种类有关。
例如,以L-多巴为底物,蛇葡萄素对酚氧化酶为竞争性抑制;以L-酪氨酸类似物与L –酪按酸为底物,对羟基苯甲酸对酚氧化酶为竞争性抑制;以邻苯二酚为底物,硫脲对酚氧化酶为非竞争性抑制;以L-酪氨酸为底物,银杏叶提取对酚氧化酶为非竞争性抑制;以L-多巴为底物,苦参碱、芦荟素和肉桂酸则属于混合型抑制。
近些年来,从植物中分离对酚氧化酶具有抑制活性的天然化合物已得到人们关注,当前,酚氧化酶抑制剂的大量研究工作集中于这些天化合物。
植物中存在的鼠鞠草素、对羟基苯甲酸、槲皮素、山奈素、芦丁、曲酸、枯醛、枯酸、杨梅黄素和蛇葡萄素等都可以作为酚氧化酶的抑制剂,另据报道,放多中药的提取成分对酚氧化酶有抑制作用,抑制作用较强的有茯苓、白鲜皮、芦荟、橘梗、当归和熟地黄等。
酚氧化酶抑制剂对该酶抑制的机理可能有以下几种:1作为酚氧化酶的竞争性底物,抑制酚氧化酶的活力。
酚氧化酶活性中心的环境是疏水的,与氧化态酶中双氧结合的质子来源于酪氨酸和多巴等底物分子中的羟基,因此氨酸和多巴等底物与氧化态酶必须以酸的形式结合。
含羟基的芳环化合物对格氨酸酶的作用机理与酪氨酸和多巴的作用相似,通过与酪氨酸和多巴竞争氧化态酶和铜离子态,把一部分酚氧化酶从催化反应循环中带走,降低酚氧化酶在反应体系中的浓度,从而抑制该酶的活力,在其他条件不变的情况下,它的抑制作用随pH的增大而减弱。
曲酸、氢醌、黄芹素诱导体等都属于这种抑制剂,主要通过作为竞争性底物来抑制酶活性。
2结合酶活性中心周围的基团,在活性中心周围形成空间位阻,阻止底物与酶活性中心作用。
醛类化合物对异丙基苯甲醛和Melanoxazal通过羟基与酶活性中心周围的亲核基团如—SH、—NH2、—OH结合,生成的产物在酚氧化酶的疏水性环境中能稳定存在,并在活性中心周围形成空间位阻,阻止底物与酶活性中心作用。
3结合酶中的铜离子,使铜离子失去对氧的结合能力,从而抑制酚氧化酶的活力。
酚氧化酶是一种含铜酶,铜离子是构成酚氧化酶催化氧化反应活性中心的重要因子,是维持酚氧化酶活性的重要保证,因此铜的螯合剂能够特异性地抑制酚氧化酶的活性。
如苯硫脲、二乙基二硫代氨基甲酸钠、和托酚酮等均可被用来作为PO的特异性抑制剂。
另外,黄酮醇、高良姜精、四羟基黄酮和槲皮素等也是与该类氧化酶中的铜离子进行螯合而产生抑制作用。
4阻止酚氧化酶中氧原子与芳环的取代反应,抑制酶活力。
在芳香酸中带有羧基的化合物,如苯甲酸对氧化态酶的作用机理与酪氨酸和多巴有所不同,因为羧基是强吸电子基,它抑制了氧化态酶中的氧原子与芳环的取代反应,于是氧化态酶与之形成的化合物成了终端化合物,从而降低了催化反应循环过程中的酚氧化酶浓度。
5作为氧化剂,拮抗氧对酚氧化酶的激活。
银杏叶提取物及时清除了过氧自由苦,从而终止了自由基链的引发,减弱了酚氧化酶的作用。
6去除自由基,终止自由基链的引,抑制酚氧化酶的活力。
过氧负离子、氢氧基和氧原子自由基等可以作为酚氧化酶活性中心的桥联配体,与酚氧化酶的活性有密切关系,有些植物提取物如银杏中含有效的天然自由基清除刘,同时可参与调节和提高超氧化物岐化酶(SOD)等搞氧化酶的活力,因此可以降低酚氧化酶的活性。
酚氧化酶抑制剂在害虫控制领域的前景由于传统农药固有的缺点,加之不合理的使用和研发工作的滞后,传统农药的负面影响逐渐暴露出来,已经引起了从们的高度关注,如“三R”,即残留、抗性、再猖獗等现象。
面对此情况,们们逐渐转变新农药研发思路,制订新的防治策略,探索新的防治途径,其中之一就是寻找新型的环境友好有害生物控制剂。
研究开发新杀虫剂的途径一般有四条,即:1、随机筛选;2、类推合成;3、天然产物模型;4、生物合理设计。
生物合理设计是一个诱人的领域。
对杀虫剂研发而言,其理论基础即昆虫生物化学,即以靶标生物体生命过程中某个关键的生理生化作用机制作为研究模型,人为地设计合成干扰此作用机制的化合物,从中筛选出先导化合物,然后进行结构优化开发。
大多数农药都是与某种特定的酶或者受体结合,发生化学反应而表现活性作用的。
酶在正常条件下有很强的催化活性,当特定的外源分子与酶结合发生作用时,酶很容易被抑制,使其活力下降甚至完全变性失活,所以我们可以针对特定的酶研究开发能影响酶活性的抑制剂作为害虫的控制剂。
鉴于酚氧化酶在害虫的生长发育过程中的重要作用,故有可能作为害虫控制中的一个重要作用靶标,寻找有效的抑制剂,通过抑制害虫体内酚氧化酶的活力,使其丧失防御能力从而间接达到合理的控制害虫的目的。