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一、实验目的1. 了解吞噬细胞吞噬功能的测定原理和方法。
2. 掌握中性粒细胞和巨噬细胞吞噬功能测定的操作步骤。
3. 分析吞噬功能测定的结果，评估吞噬细胞的功能状态。
二、实验原理吞噬细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有吞噬、消化病原微生物和衰老细胞等功能。
吞噬功能测定是评估机体免疫功能的一种方法。
本实验通过测定中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬功能，了解其吞噬能力，从而评估机体免疫功能。
三、实验材料1. 实验动物：小白鼠（6-8周龄，体重20-25g）。
2. 试剂：中性粒细胞和巨噬细胞分离试剂、鸡红细胞悬液、瑞氏染液、生理盐水、0.1%吐温-80、磷酸缓冲盐溶液（PBS）等。
3. 仪器：显微镜、离心机、移液器、培养皿、载玻片、试管等。
四、实验方法1. 中性粒细胞和巨噬细胞分离将小白鼠处死，无菌操作取腹腔液，加入中性粒细胞和巨噬细胞分离试剂，充分混匀后室温放置5分钟。
低速离心（1000r/min，5分钟）分离中性粒细胞和巨噬细胞。
2. 吞噬功能测定（1）中性粒细胞吞噬功能测定取分离的中性粒细胞，加入鸡红细胞悬液，37℃孵育30分钟。
低速离心（1000r/min，5分钟）弃上清，加入瑞氏染液，染色5分钟。
洗涤、干燥、封片，显微镜下观察中性粒细胞吞噬鸡红细胞的情况。
（2）巨噬细胞吞噬功能测定取分离的巨噬细胞，加入鸡红细胞悬液，37℃孵育30分钟。
低速离心（1000r/min，5分钟）弃上清，加入瑞氏染液，染色5分钟。
洗涤、干燥、封片，显微镜下观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况。
3. 结果分析计算吞噬百分率和吞噬指数。
吞噬百分率=吞噬有鸡红细胞的细胞数/细胞总数×100%；吞噬指数=吞噬的鸡红细胞总数/吞噬有鸡红细胞的细胞数。
五、实验结果1. 中性粒细胞吞噬功能吞噬百分率：60.5%；吞噬指数：1.2。
2. 巨噬细胞吞噬功能吞噬百分率：70.2%；吞噬指数：1.8。
六、讨论本次实验成功测定了中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬功能。
中性粒细胞碱性磷酸酶检验的诊断意义摘要】目的讨论中性粒细胞碱性磷酸酶检验的诊断意义。
方法对采集到的样本进行检验。
结论中性粒细胞碱性磷酸酶的临床检验结果对细菌感染性疾病和病毒感染性疾病的鉴别、妇科疾病的鉴别诊断具有一定的参考价值，但对于除了结核性脑膜炎和病毒性脑膜炎患者以外的其他脑膜炎患者的疾病诊断提供重要依据。
【关键词】中性粒细胞碱性磷酸酶检验诊断中性粒细胞碱性磷酸酶(neutrophilicalkalinephos-phatase，NAP)是一种中性粒细胞胞内水解酶，属一种含锌的金属酶类，它主要见于成熟中性粒细胞、网状细胞和吞噬细胞。
其他细胞(嗜酸性、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、巨核细胞、浆细胞、红细胞、血小板中)皆为阴性反应。
有研究表明，NAP活性随中性粒细胞发育成熟有递增的趋势。
一、检验方法临床测定中性粒细胞碱性磷酸酶的方法有组织细胞经化学染色后，在光镜下按Kapl0五级半定量法和测其酶活力的生化定量法。
目前临床上NAP染色仍常采用Gomeri钙-钴法(硫化钴染色法)，NAP阳性率为镜检l00个成熟中性粒细胞，计数其中阳性反应的细胞数，以%表示。
NAP积分计算方法为镜检100个成熟中性粒细胞，若全部细胞充满硫化钴颗粒，呈黑色团块，甚至盖核则判为“++++”，计4分；若胞浆内充满黑色颗粒，但颗粒之间有空隙，或者是胞浆内有3/4面积充满了致密的黑色颗粒沉淀则判为“+++”，计3分；若胞浆面积的l/2呈黑色或灰黑色颗粒沉淀(或者是全胞浆呈均匀灰色，无颗粒)则判为“++”，计2分，若胞浆面积的l/4呈黑色，或灰黑色颗粒沉淀，或者是全胞浆呈均匀浅灰色，无明显颗粒则判为“+”，计1分；若胞浆内无灰色或黑色沉淀则计0分。
正常人NAP阳性率和积分都较低，一般阳性率为4%～56%，积分为7～51分。
由于NAP染色所采用的Gomeri钙-钴法是一种酶促反应，且此酶反应所需时间长，受技术因素影响大(如试剂pH、标本保存温度与时间、温浴时间等)，如在某些环节掌握不当，往往可致染色失败，所以不同的实验室有不同的正常值，各实验室应找出稳定的操作方法，以排除其影响因素，根据自身实验条件而建立参考范围且实验过程中应注意质量控制。
2．吞噬和杀菌功能测定1）原理中性粒细胞可吞噬颗粒性物质（如金黄色葡萄球菌），根据吞噬率(phagocytic rate) 和吞噬指数(phagocytic index)可判断该细胞的吞噬功能，根据被吞噬的细菌是否着色测定杀菌率。
2）技术要点（1）显微镜检查法将白细胞与葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合、温育后，涂片用碱性美兰液染色。
在油镜下计数吞噬细菌和未吞噬细菌的白细胞数。
对有吞噬作用的白细胞，应同时记录所吞噬的细菌数。
按下式计算吞噬率和吞噬指数。
还可根据被吞噬的细菌是否着色测定杀菌率(%)。
吞噬百分率（%）=吞噬指数=杀菌率（%）=（2）溶菌法将白细胞悬液与经新鲜人血清调理过的细菌（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌）按一定比例混合后，置37℃。
每隔一定时间取定量培养物，稀释后接种固体平板培养基。
37℃培养18h后，计数生长菌落数，以了解中性粒细胞的杀菌能力。
杀菌率（%）=3.硝基蓝四氮唑还原能力测定1）原理中性粒细胞在杀菌过程中，能量消耗剧增，耗氧量也随之增相应增加，磷酸己糖旁路的代谢活性增强，6-磷酸葡萄糖脱氢酶使葡萄糖的中间代谢产物6-磷酸葡萄糖氧化脱氢转变为戊糖。
如加入硝基蓝四氮唑(nitroblue tetrazolium，NBT)，可被吞噬或渗透到中性粒细胞胞浆中，接受所脱的氢，使原来呈淡黄色的NBT还原成点状或块状的蓝黑色甲月替颗粒，沉积于中性粒细胞胞浆中，称NBT阳性细胞。
NBT阳性细胞百分率可反映中性粒细胞杀菌功能2）技术要点将肝素抗凝血加入等量的NBT应用液，孵育。
取1滴推片，染色，计数NBT阳性细胞，计算NBT阳性细胞百分率。
3）方法评价此法主要用于检测02的产生能力。
正常值为40%～50%，一般以阳性细胞数超过10% 判定为NBT试验阳性。
4．化学发光测定法中性粒细胞在吞噬经调理的葡萄球菌过程中，出现呼吸爆发，产生的活性氧化代谢产物（如O2-、OH-、H2O2等）可激活化学发光剂鲁米诺(luminol)类物质，并使之产生化学发光(chemiluminescence)，发光量与中性粒细胞的杀菌能力相关。
抗中性粒细胞胞浆抗体的检测方法及临床意义赵秀芬,孙 彬,钱 军,邢昌赢(南京医科大学第一附属医院肾内科研究室,江苏南京,210028) 关键词:抗中性粒细胞胞浆抗体;酶联免疫吸附测定;间接免疫荧光 中图分类号:R 557 文献标识码:A 文章编号:1672Ο2353(2008)06Ο0079Ο01 作者对220份不同患者的空腹静脉血进行了抗中性粒细胞胞浆抗体的检测,现将结果报告如下。
1 材料与方法1.1 待测血清均取自2002年12月～2003年10月收到的本院220份不同患者的空腹静脉血1mL ,离心提取血清,-20℃保存备用。
1.2 实验方法和结果测定每份血清均分别进行IIF 与MPO 和PR3ΟEL ISA 检测、分析。
IIF 法:健康人新鲜肝素抗凝血加0.9%生理盐水对比稀释,用淋巴细胞分离液分离中性粒细胞,调整细胞浓度为4.5～5.5×104/mL ,涂成薄片,经无水酒精固定、干燥后,置-20℃保存备用。
血清及抗体均用0.01mol/L P B S (p H7.2)稀释,加1:10稀释待测血清、阴性、阳性对照血清,温育洗涤后加异硫氰酸荧光素(FITC )标记羊抗人IgG,温育洗涤后,室温晾干,于Leica 荧光显微镜下读片,结果判定:阴性结果不着色或显很浅的背景颜色,在中性粒细胞胞浆存在黄绿色荧光为C ΟANCA ,在中性粒细胞核周有黄绿色荧光为P ΟAN CA 。
MPO 和PR3ΟEL ISA 法:本试剂由AES K U 诊断试剂公司提供,每种抗原均设阴性、阳性对照、标准曲线,严格按试剂盒说明进行操作,用美国S YNTRON 酶标仪,于波长450nm 读取OD 值,最后根据标准曲线计算每种抗原的含量,结果判断:MPO 或PR3含量>10U/mL 为阳性,M PO 或PR3含量<10U/mL 为阴性。
2 结 果阳性率IIF 法N 阳性率3%(6220),其中C -ANCA 5.91%(13/220),p -AN 2CA 1.36%(3/220),可疑阳性2.72%(6/220);抗原特异性-EL ISA 法总阳性率3.64%(8/220),其中MPO ΟEL ISA 阳性率2.27%(5/220),PR3ΟEL ISA 阳性率1.36%(3/220)。
白细胞减少症和粒细胞缺乏症……【概述】周围血液白细胞计数低于4000/mm3称为白细胞减少症（leukopenia）。
白细胞减少症最常见是由中性粒细胞减少所致。
中性粒细胞绝对计数低于1800～2000/mm3称为粒细胞减少症（neutropenia）；低于500～1000/mm3称为粒细胞缺乏症（agranulocytosis），常伴有严重的难以控制的感染。
上述三类情况的病因和发病机理大致相同，但病情的严重程度不等。
【诊断】白细胞计数是最主要的实验诊断依据。
白细胞计数受多种因素影响可有较大的波动，所以往往需要多次重复检验始可诊断。
粒细胞浆内可有毒性颗粒和空泡，常提示存在细菌性感染。
单核细胞比例常代偿性增多。
如杆状核的比例增加（＞20％）提示骨髓有足够的粒细胞生成能力。
骨髓象随原发病而异。
粒细胞缺乏症骨髓内各阶段的中性粒细胞极度减少，甚至完全消失。
粒细胞有明显的毒性改变或成熟受阻。
淋巴细胞、单核细胞、浆细胞和组织细胞可增多，幼红细胞和巨核细胞大致正常。
病情好转时外周血中晚幼粒细胞及较成熟粒细胞相继出现，个别可呈类白血病血象。
诊断的第二步是寻找白细胞减少的病因。
要注意追问有无可能引起本病的药物或化学物接触史；有无引起粒细胞减少的基础疾病，例如慢性炎症、自身免疫性疾病；有无反复感染史等。
下列特殊检查可辅助了解粒细胞减少症的病因和发病机理。
（一）骨髓粒细胞贮备功能测定用致热原如初胆烷醇酮、脂多糖及强的松（或氢化考的松），通过中间产物——“中性粒细胞释放因子”的作用，促使骨髓粒细胞释放，了解粒细胞的释放功能。
如用强的松40mg口服五小时后白细胞计数较服药前增加2×109/L以上或用氢化考的松200mg静脉注射3～4小时后白细胞计数较用药前增加4×109～5×109/L以上者均为正常。
（二）肾上腺素试验皮下注射0.2mg后20分钟测白细胞数，如升高2000/mm3或较原水平高1倍以上，提示血管壁上有粒细胞过多聚集在边池。
实验一、中性粒细胞吞噬功能测定Assay for Phagocytosis of Polymorphonuclear Leukocyte 【实验目的】
•掌握中性粒细胞吞噬功能试验的原理；
•熟悉中性粒细胞吞噬功能试验的操作方法；•通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。
【实验原理】
血液中的中性粒细胞通称小吞噬细胞，具有吞噬细菌和异物颗粒的能力，在体外将中性粒细胞与细菌或异物颗粒在一定条件下共同孵育后，显微镜观察可见中性粒细胞内有细菌或异物颗粒。
计数吞噬率和吞噬指数，可反映中性粒细胞的吞噬功能。
有助于对疑有吞噬细胞功能障碍的疾病作出诊断。
【材料和试剂】
1.待测样本新鲜抗凝静脉血
2.被吞噬物灭活白色葡萄球菌菌液（6×108/ml）。
3.试剂无菌生理盐水，甲醇，瑞氏－吉姆萨染液。
4.器材EP管，75%酒精棉球、载玻片，微量移液器、恒
温箱，显微镜（香柏油，二甲苯）等。
【操作步骤】
1.白色葡萄球菌液制备。
（已制备好）
2.待测血标本制备：静脉采血5ml。
3.在EP管内加40微升血液，20微升菌液，混匀。
4.将EP管置37℃温育30min，每隔10min混匀一次。
5.取一小滴上述混合液，置于载玻片上，推成薄血片，晾干。
6.甲醇固定4-5min，滴加瑞氏-吉姆萨染液A液2-3滴，染色1-
2min，再B液2-3滴，染色5-10min，水洗，晾干。
7.油镜下计数中性粒细胞(＞100个)、吞噬的细菌总数。
【推血片方法】
取血混合液一小滴，放于载玻片的右端。
将推片置于血滴前端，与载玻片接触，成30°～40°角向后拉动推片，使与血液接触•待血液扩散形成一条线之后，以均速轻轻向前推动推片，则血液均匀地被涂于载玻片上而形成一薄膜。
取两张无油脂的洁净玻片，左手拇指及中指夹持载玻片，右手持推片。
30°
血滴越大，速度越快、角度越大--血膜越厚
良好的血片，血液应分布均匀，厚度适当。
对光观察时呈霓红色，血膜应位于玻片的中央，血膜两端留有空隙，以便注明病
例编号、日期等。
【油镜的使用】
•保护：双手取显微镜，一手握臂，一手托底•对光：升聚光器→打开光栅→反光镜采光•观察：标本固定载物台上→
低倍镜找到标本→
玻片滴香柏油→
换油镜→
目镜观察→细调至图像清晰
•使用完毕立即用擦镜纸擦干镜头上的油
Eosinophil Basophil Monocyte Neutrophil Platelet RBC
Lymphocyte 胞核胞质直径形状染色质粗糙不匀，排列紧密
丰富，含较多细小均匀的紫红色中性颗粒10-15um 为RBC 两倍中性粒细胞充满粗大均匀的桔红色嗜酸性颗粒13-15um ，略大于WBC 圆形嗜酸性粒细胞少，常呈淡红，含少量粗大不均匀紫黑色嗜碱性颗粒10-12um ，略小于中性粒细胞圆形嗜碱性粒细胞大，不规则。
染色质疏松如网状丰富，染淡蓝，含大量细小嗜天青颗粒，可见空泡15-25um ，最大圆形或不规则形单核细胞圆形，偶见凹陷，染色质粗糙致密很少，有的仅在核的一侧出现少量蓝色胞浆6-10um 淋巴细胞【血细胞的鉴别】
【结果判断】
计数200个中性粒细胞，分别记录吞噬细菌的细胞数和每个中性粒细胞吞入的细胞数，按下式计算吞噬率和吞噬指数。
200个中性粒细胞中吞噬细菌的细胞数吞噬率＝×100%
200
200个中性粒细胞中吞噬细菌的总数吞噬指数＝×100%
200
美兰染色
【注意事项】
1.所用器材要清洁。
2.如细菌数太多可增加稀释倍数作平皿培养后计数。
3.血膜必须充分干燥，否则在染色过程中易脱落。
4.染液不可过少，以防止蒸发干燥，沉着于血片上不易冲掉。
5.冲洗时应以流水将染液冲去，不可先倒掉染液，以免染料
沉着于血膜上。
6.越接近推片末梢，细胞数越多。
计数时应取玻片前、中、
后三段计数，以提高准确率。
【思考题】
1.简述中性粒细胞吞噬功能测定的原理。
2.该实验过程中应注意哪些事项？
3.检测白细胞功能的实验还有哪些，各有什么特点？。
