温度对沼气菌群产气能力的影响及菌群变化的研究

室于４℃冰箱保存。整个过程中应使采集物尽量
少接触空气。
１．１．２培养基和无氧试剂的配制 （１）培养基：
富集培养基采用ＭＢ［３３培养基，发酵培养基采用
Ｍｅｄｉｕｍ １４１（ＤＳＭＺ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／
ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／ｈｔｍｌ／ｍｅｄｉａ ／ｍｅｄｉｕｍ０００１４１．
产甲烷菌是一类特殊的原核微生物，只能利 用低分子量的有机物或二氧化碳作为碳源，合成 甲烷作为能量代谢的最终产物，是自然界碳素循 环中厌氧生物链的最后一个成员。同时，它也是 沼气发酵微生物的核心。产甲烷菌为极端严格厌 氧微生物，广泛存在于各种厌氧的极端环境中［１］。 由于分离纯化需要严格的厌氧条件，所以产甲烷 菌的研究在很长时间停滞不前，直到２０世纪５０ 年代初Ｈｕｎｇａｔｅ发明的厌氧操作技术，产甲烷菌 的研究才有长足的发展。国内对沼气池中产甲烷 菌的研究由来已久［２］，但是对低温条件下沼气池 中产甲烷菌的研究却不多见。本试验就厌氧发酵
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｏｌｏｇｙ．Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｎｇ Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｏ．ｎ ｂｉｏｇａｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｉｎ ａ ｓｅｌｆ－ｍａｎｕ— ｆａｃｔｕｒｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｏｆ ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｙｅａｓｔ．Ｒｅ— ｓｕｉｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔｈａｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆａｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ３０℃ｔｏ １０℃．ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅａｋ ｏｆ ｔｈｅ ｄａｉｌｙ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｂｉｏｇａｓ ｗａｓ ａｌｓｏ ｐｏｓｔｐｏｎｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｄｕｒｉｎｇ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ，ｔｈｅ ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｃｈａｎｇｅｄ ｎｏｔｉｃｅａｂｌｙ．Ｉｎ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔａｇｅ ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｔｅｄ，ｂｕｔ ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎ ｅｎｄ ｓｔａｇｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ；Ｍｉｃｒｏｂｅ ｆｌｏｒａ
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｏｎ
ｗｈｏｌｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｉｏｇａｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
／ｍＬ
注：表内不同小写字母为差异达显著水平（Ｐ＜０．０５），不同大写 字母为差异达极显著水平（Ｐ＜Ｏ．０１）。 Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｏｒ ｃａｐｉｔａｌ ｌｅｔｔｅｒ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｔ Ｐ＜Ｏ．０５
岛津ＧＣ一８Ａ气相色谱仪）、荧光显微镜（ＯＬＹＭ—
ＰＵＳ ＢＸ－５１，陕西华大生物仪器有限公司）、ｐＨ
计（ＰＨＳ－３Ｃ型，上海精密科学仪器有限公司）、电
热鼓风干燥箱（１０１－２ＡＢ型，天津市泰斯特仪器有
限公司）、电子万用炉（天津市泰斯特仪器有限公
司）及电子天平（ＹＰｌ２００，上海恒平科学仪器有限
公司）等。
收稿日期：２００８—０３—１７
修回日期：２００８—０５—１４
基金项目：陕西省农业生态校园项目（ＳＴＸＹ一０３）。
作者简介：王华（１９５９一），女。博士，教授，主要从事葡萄与葡萄酒的研究Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｈｕａｗｉｎｅ＠１２６．ｃｏｒｎ
万方数据
５期
王华等：温度对沼气菌群产气能力的影响及菌群变化的研究
由图２可知，３０℃、２５℃、２０℃试验组的ｐＨ 在发酵初期分别在第３天、第５天、第７天出现一 个小的低谷，分别由起始的ｐＨ ７．０３、７．０２、７．０１ 降到６．９２、６．８７、６．９１；随后ｐＨ又呈缓慢上升趋 势。这可能是因为本试验所用的接种菌体来自于 ３７℃的富集培养的菌液，均高于各试验的发酵温 度。一般认为，不同温度的厌氧发酵是由不同温 度类型的微生物进行的［７］，当环境温度改变时，产 甲烷菌的活性降低；而此时，菌群中的产酸菌就略 占优势，生长相对较旺，所以在发酵初期３０℃、 ２５℃、２０℃试验组的ｐＨ会略有下降。而随后，由 于产氨细菌的大量活动，蛋白质分解和脱氨作用 的强烈进行，为甲烷菌提供了丰富的氮素营养，故 使发酵液的ｐＨ又上升到７～８之间【８］。
１．３试验方法
１．３．１ 产甲烷茵菌群的富集培养 采用Ｈｕｎ－
ｇａｔｅ厌氧操作改良技术［６］，在已灭菌的２００ ｍＬ
液体培养基中分别用５ ｍＬ灭菌注射器加入１％
硫化钠和５％碳酸氢钠的混合试剂４ ｍＬ，加入
２．５ ｍｏｌ／Ｌ乙酸钠，２５％甲酸钠，５０％（ｖ／ｖ）甲醇
各４ ｍＬ，加入无氧青霉素液４ ｍＩ。，然后接种活性
群产气能力的影响以及发酵过程中微生物菌群的变化。结果表明，在１０～３０℃范嗣内，产甲烷菌的产气能力
随着温度的降低而减小，且其日产气量的最高峰也随之往后推迟。在沼气发酵过程中，微生物菌群的变化也
比较明显，初期以球菌占优势，后期则转为杆菌类为优势菌。
关键词：温度；厌氧发酵；产甲烷菌；菌群
中图分类号：ＴＳ２６１．１
本试验将发酵集气装置放置在５个不同处理
温度的霉菌培养箱中，设置的温度分别为１０，１５，
２０，２５，３０。Ｃ，每个处理温度设置３个重复。本试 验发酵周期为２０ ｄ。 １．３．３ 甲烷体积及发酵液ｐＨ的测定 采用排 水集气法收集气体，每天定时用量筒测量集水瓶 中排出的水，并做记录。
每天定时用无菌的注射器从发酵瓶中，抽取 １ ｍＬ发酵液，然后用ＰＨＳ－３Ｃ型ｐＨ计测定发酵 过程中ｐＨ。 １．３．４镜检及荧光检验 取沼气发酵瓶的上清 液制菌体湿标本，在ＯＬＹＭＰＵＳ ＢＸ一５ｌ紫外荧光 （４２０ ｎｍ）显微镜下进行菌体形态观察和自发荧 光检验。 １．４统计分析方法
试验数据采用ＤＰＳ ７．５５数据分析软件进行 统计分析，结果通过平均值±标准差表示，并用 Ｄｕｎｃａｎ新复极差法进行多重比较差异显著性。
２ 结果与分析
２．１不同发酵温度对沼气发酵过程中产气量的 影响 ２．１．１ 不同发酵温度对沼气发酵过程中日产气 量的影响 对比试验的发酵周期为２０ ｄ，在第２０ 天结束时强行中止发酵。在不同发酵温度条件 下，各试验组的平均日产气量见图１。由图１可 知，３０℃的发酵试验在反应初期，其日产气量呈现 明显上升趋势，在第６天达到高峰值，即其最大日 产气量为２７．１０ ｍＩ。，但在第９天其日产气量出现 一个低谷；随后，日产气量略有回升，但总的趋势 却呈缓慢下降状态。在发酵周期结束时，其总产 气量为３４８．９７ ｍＬ。
过程中产沼气微生物菌群在不同的低温条件下产 气能力及发酵过程中微生物菌群的变化进行了研 究，以便为在低温条件下沼气的可控性发酵提供 参考依据。
１ 材料与方法
１．１材料 １．１．１ 活性污泥样品的采集在１～２月份气温 较低的时候，先后到陕西省农作物新品种引进示 范区及西大寨中学采集沼气池污泥样品。采集 时，除去上面的表层，采集底下呈现乌黑色的沉积 物到自封袋中，然后立即封闭袋口，迅速带回实验
１５３．２３ ｍＬ。
在３０℃、２５℃、２０℃的发酵试验中，产气量分
万方数据
西北农业学报
别在第９天、第９天和第１５天出现一个低谷，极 有可能是因为在发酵过程中不同菌种之间的相互 更替造成的（在后续ｐＨ的变化中给予解释）。
１５℃、１０℃的发酵试验从图１可知，其日产气 量持续很低，１５℃的最大日产气量为３．８７ ｍＬ，２０ ｄ的发酵试验总产气量为４６．６３ ｍＩ。；而１０℃的最 大日产气量为３．１３ ｍＬ，２０ ｄ的发酵试验总产气 量为３６．１０ ｍＩ。。这是因为这两组的试验温度太 低，不适于沼气发酵菌群的生长，从而影响了两者 的产气情况。由图１可知，本次对比试验在１０～ ３０℃温度区间，沼气发酵菌群产气能力随温度降 低而减小，并且随着培养温度的降低，其日产气量 的最高峰也随之往后推迟。在试验结束时，３０℃ 试验组无论在日产气量还是总产气量均明显高于 其他四组，２５℃、２０℃试验组居中，１５℃、１０℃试验 组最低。
１．２设备与仪器
１．２．１ 试验装置 试验装置为实验室自行制作
的小型厌氧发酵装置［５］，主要由发酵瓶与集气装
置组成。选用透明的玻璃三角瓶作为发酵瓶。发
酵瓶用适当大小的橡胶塞密封，橡胶塞上设有输
气口和取样口。集气装置采用排水集气法，集气
瓶为三角瓶。 １．２．２ 主要的试验仪器
霉菌培养箱（ＭＪ一
２０５Ｂ，上海跃进医疗器械厂）、气相色谱仪（日本
ｉ北蔻业学报 ２００８，１７（５）：２９４—２９７ Ａｃｔａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ Ｂｏｒｅａｌｉ—ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ Ｓｉｎｉｃａ
温度对沼气菌群产气能力的影响及菌群变化的研究
王 华，杨 光，刘小刚，罗 华
（西北农林科技大学葡萄酒学院。陕西杨凌７１２１００）
摘要：试验以中温厌氧发酵液为接种物，在自制的小型厌氧发酵装置上，研究了不同温度条件对产沼气菌
ｈｔｍｌ）。每２５０ ｍＬ发酵瓶装入２００ ｍＩ，培养基，
顶空为高纯氮气，１２１℃，２０ ｍｉｎ高压灭菌。
（２）厌氧试剂Ｌ４］：ａ．硫化钠（１％）＋碳酸氢钠
（５％）混合试剂，ｂ．２．５ ｍｏｌ／Ｌ乙酸钠，Ｃ．２５％甲
酸钠，ｄ．５０％（ｖ／ｖ）甲醇，ｅ．无氧青霉素溶液（７