原发性肝癌患者癌组织、血清miR-202表达变化及其意义

山东医药２０１７年第５７卷第７期　

发性肝癌患者癌组织、血清ｍｉＲ一２０２　

达变化及其意义　

於琳，张开炯，柴利，李宝林，杨志惠，刘靳波　

（西南医科大学附属医院，四川泸州６４６０００）　・论著・　

摘要：目的观察原发性肝癌患者癌组织及血清微小ＲＮＡ　２０２（ｍｉＲ一２０２）水平变化，并探讨其意义。方法　７０　例原发性肝癌患者，留取其术前血清标本及手术切除的原发性肝细胞癌组织标本；３０例份正常肝组织来自本院手　术切除的肝血管瘤旁组织（病理检查证实无肿瘤浸润），３０例体检健康者留取血清标本，检测原发性肝癌患者癌组　织、正常肝组织ｍｉＲ－２０２，检测原发性肝癌患者、健康体检者血清ｍｉＲ－２０２。分析ｍｉＲ－２０２表达与原发性肝癌患者临　床病理参数的关系，绘制ＲＯＣ曲线评价ｍｉＲ一２０２、ＡＦＰ、ｍｉＲ－２０２联合ＡＦＰ对原发性肝癌的诊断价值。结果’原发　性肝癌组织标本中ｍｉＲ－２０２的相对表达量低于正常肝组织标本（Ｐ均＜０．０５），原发性肝癌患者血清中ｍｉＲ－２０２的　相对表达量低于健康体检者（Ｐ＜０．０５）；原发性肝癌组织中ｍｉＲ一２０２的相对表达量高于血清ｍｉＲ－２０２（Ｐ＜０．０５）。　原发性肝癌组织中ｍｉＲ一２０２表达与原发性肝癌性别、年龄、血清ＡＦＰ水平、肿瘤直径、肿瘤数目、肿瘤部位、分化程　度、ＴＮＭ分期、转移与否、包膜浸润、ＨＢＶ感染、是否伴随肝硬化以及门静脉癌栓均无关（Ｐ均＞０．０５）；原发性肝癌　血清中ｍｉＲ一２０２的水平仅与肿瘤数目有关（Ｐ＜０．０５），与性别、年龄、血清ＡＦＰ水平、肿瘤直径、肿瘤数目、肿瘤部　位、分化程度、ＴＮＭ分期、转移与否、包膜浸润、ＨＢＶ感染、是否伴随肝硬化以及门静脉癌栓均无关（Ｐ均＞０．０５）。　ｍｉＲ－２０２联合ＡＦＰ诊断原发性肝癌的ＲＯＣ曲线下面积０．９４２，敏感度８１．８％，特异度９３．０％。结论　原发性肝癌　组织中ｍｉＲ－２０２低表达，血清ｍｉＲ－２０２水平降低。血清ｍｉＲ一２０２水平与原发性肝癌肿瘤数目有关。ｍｉＲ－２０２联合　ＡＦＰ诊断原发性肝癌的敏感度、特异度均较高。　关键词：肝癌；原发性肝癌；肝肿瘤；微小ＲＮＡ；微小ＲＮＡ２０２　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２—２６６Ｘ．２０１７．０７．００１　中图分类号：Ｒ７３５．７　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１７）０７－０００１－０４　

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｍｉＲ－２０２　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒｏｕｓ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ａｎｄ　ｓｅｒｕｍ　

ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　

ＹＵ　Ｌｉｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｋａｉｊｉｏｎｇ，ＣＨＡＩ　Ｌｉ，ＬＩ　Ｂａｏｌｉｎ，ＹＡＮＧ　Ｚｈｉｈｕｉ，ＬＩＵ　Ｊｉｎｂｏ　（　ｅ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＳｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｌｌ￣ｈｏｕ　６４６０００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｈａｎｇｅｓ　ａｎｄ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏＲＮＡ一２０２（ｍｉＲ一２０２）ｉｎ　ｔｈｅ　ｃａｎｃｅｒｏｕｓ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ａｎｄ　ｓｅｒｕｍ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ（ＨＣＣ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｗｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　７０　ｃａ—　ｓｅｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｒｙ　ＨＣＣ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ　ｓｅｒｕｍ　ｆｒｏｍ　７０　ＨＣＣ　ｐａｔｉｅｎｔｓ，３０　ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ｎｏｒｍａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎ—　ｆｉｒｍｅｄ　ｗｉｔｈ　ｎｏ　ｔｕｍｏｒ　ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｆｒｏｍ　３０　ｈｅｐａｔｉｃ　ｈｅｍａｎｇｉｏｍａ　ｐａｔｉｅｎｔｓ，ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　３０　ｃａｓｅｓ　ｏｆ　ｓｅｒｌｌｍ　ｆｒｏｍ　３０　ｈｅａｌｔｈｙ　ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．ＲＴ—ＰＣＲ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉＲ一２０２　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｉｍａｒｙ　ＨＣＣ　ｔｉｓ—　ｓｕｅｓ，ａｎｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｌｔｌｍ　ｏｆ　ＨＣＣ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｍｉＲ－２０２　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈ０ＩｏｇｉｃａＩ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｉｎ　ＨＣＣ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ．　Ｗｅ　ｄｒｅｗ　ｔｈｅ　ＲＯＣ　ｃｕｒｖｅ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ｖａｌｕｅ　ｏｆ　ｍｉＲ．２０２，ＡＦＰ，ｍｉＲ－２０２　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ＡＦＰ　ｉｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｌｉｖｅｒ　ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉＲ一２０２　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ＨＣＣ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｗａｓ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｌｉｖｅｒ　ｔｉｓｓｕｅｓ（ａｌｌ　Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉＲ一　２０２　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｒｕｍ　ｏｆ　ＨＣＣ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗａｓ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉＲ一２０２　ｉｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ＨＣＣ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｒｕｍ　ｏｆ　ＨＣＣ　ｐａｔｉｅｎｔｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉＲ一２０２　ｉｎ　ｐｒｉ—　ｍａｒｙ　ＨＣＣ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｗａｓ　ｎｏｔ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｇｅｎｄｅｒ，ａｇｅ，ｓｅｒｕｍ　ＡＦＰ　ｌｅｖｅｌ，ｔｕｍｏｒ　ｄｉａｍｅｔｅｒ，ｔｕｍｏｒ　ｓｉｚｅ，ｔｕｍｏｒ　ｌｏｃａｔｉｏｎ，　

基金项目：四川省科学技术厅基金资助项目（１４ＪＣ０８０１）；西南医科大学附属医院科研项目（２０１５一ＱＳ￣１７）。　第一作者简介：於琳（１９８９－），女，硕士研究生在读，主要研究方向为肿瘤的分子诊断。Ｅ－ｍａｉｌ：７９０４６００８７＠ｑｑ．ｃｏｒｎ　通信作者简介：刘靳波（１９７０－），女，博士，硕士研究生导师，教授，主要研究方向为肿瘤的分子诊断。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｕｊｂ７２０３＠１６３．ｃｏｍ　

原表　山东医药２０１７年第５７卷第７期　

ＴＮＭ　ｓｔａｇｅ，ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ｉｎｖａｓｉｏｎ，ＨＢＶ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｗｉｔｈ　ｏｒ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｌｉｖｅｒ　ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｐｏｒｔａｌ　ｖｅｉｎ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ｉｎ　ＨＣＣ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　（ａｌ１　Ｐ＞０．０５）．Ｔｈｅ　ｓｅｒｕｍ　１ｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｍｉＲ－２０２　ｉｎ　ＨＣＣ　ｐａｔｅｉｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｏｎｌｙ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒｓ（Ｐ＜０．０５），　ｂｕｔ　ｗｅｒｅ　ｎｏｔ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｅｘ，ａｇｅ，ｓｅＦｕｎｌ　ＡＦＰ，ｔｕｍｏｒ　ｄｉａｍｅｔｅｒ，ｔｕｍｏｒ　ｎｕｍｂｅｒ，ｔｕｍｏｒ　ｌｏｃａｔｉｏｎ，ＴＮＭ　ｓｔａｇｅ，ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　ｏｒ　ｎｏｔ，ｃａｐｓｕｌｅ　ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．ＨＢＶ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ｗｉｔｈ　ｏｒ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｌｉｖｅｒ　ｃｉｒｈｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｐｏｒｔａｌ　ｖｅｉｎ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ（ａｌｌ　Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｍ—　ｂｉｎｅｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｆｉＲ一２０２　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒ　ｍａｒｋｅｒ　ＡＦＰ　ｃｏｕｌｄ　ｇｅｔ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（８　１．８％）ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ（９３．Ｏ％）ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ＨＣＣ．ｔｈｅ　ＡＵＣ　ｗａｓ　０．９４２．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　ｔｈｅ　ｍｉＲ一２０２　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ＨＣＣ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ａｎｄ　ｓｅｒｕｍ　ｉｓ　ｓｉｇｎｉｆｉ—　ｅａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｉｎ　ＨＣＣ　ｐａｔｉｅｎｔｓ．ｔｈｅ　ｍｉＲ一２０２　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ＨＣＣ　ｓｅｒｕｍ　ｉＳ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｕｍｏｒ　ｎｕｎｌｂｅｒ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉＲ一２０２　ａｎｄ　ＡＦＰ　ｃｏｕｌｄ　ｇｅｔ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　ＨＣＣ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｌｉｖｅｒ　ｎｅｏｐｌａｓｍ；ｍｉｃｒｏＲＮＡ；ｍｉｃｒｏＲＮＡ　２０２　

原发性肝癌是常见的肝脏恶性疾病之一，目前　

已有的生物学标志物特异度及敏感度均不高导致对　肝癌的诊断价值欠佳¨Ｊ，因此亟需寻找对肝癌具有　

特异诊断价值的标志物。微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）是一　类内源性非编码小ＲＮＡ，其异常表达可影响肿瘤的　

发生、发展过程　，提示ｍｉＲＮＡ可作为潜在的肿　瘤诊断标志物。ｍｉＲ－２０２在肝癌患者癌组织中呈低　表达　Ｊ，但目前尚无文献报道原发性肝癌组织及患　

者血清ｍｉＲ一２０２水平与肝癌临床病理参数之间的关　系。我们观察了原发性肝癌患者癌组织及血清　

ｎｆｉＲ一２０２表达变化，并分析血清ｍｉＲ一２０２检测诊断　原发性肝癌的效能。现将结果报告如下。　

１　资料与方法　１．１　临床资料　选取２０１４年７月～２０１５年１月　

西南医科大学附属医院就诊的原发性肝癌患者７０　

例，男５９例，女１１例，年龄２３～７２岁，中位年龄４８　岁。均行手术切除，留取其术前血清标本及手术切　除的原发性肝细胞癌组织标本。纳入标准：①经病　

理检查确诊为原发性肝癌者；②在此次治疗前均未　接受任何治疗者；③存在外科手术指征者。排除标　

准：①伴有严重营养不良者；②存在双相情感障碍、　

应激相关性精神障碍、偏执性精神障碍、分裂情感性　精神障碍、精神分裂症等重型精神疾病，对自己的行　

为无完全刑事承担能力者；③不愿意参加本次研究　者。同时收集３０例份正常肝组织甲醛固定石蜡包　埋标本，标本均取自本院手术切除的肝血管瘤旁组　织，病理组织学证实无肿瘤浸润，患者中男１６例、女　

１４例，年龄２６～６ｌ岁、中位年龄４２岁。选择同期　

在本院体检中心体检３０例体检健康者的血清标本，　

检查者中男ｌ８例、女ｌ２例，年龄２ｌ～５５岁、中位年　

龄３８岁。本研究经医院医学伦理学委员会批准，均　

获得患者知情同意。　

１．２原发性肝癌患者癌组织及血清ｍｉＲ．２０２检测　采用实时荧光定量ＰＣＲ法检测原发性肝癌患者　

癌组织、正常肝组织ｍｉＲ一２０２及原发性肝癌患者、健　

康体检者血清ｍｉＲ一２０２。取保存于１．５　ｍＬ灭酶、灭　

２　菌ＥＰ管中的原发性肝癌组织切片，加入二甲苯３２０　

Ｌ，漩涡震荡１０　Ｓ，瞬时离心后，将切片浸入二甲苯　中，５６　干浴锅中温育３　ｍｉｎ，待石蜡完全溶解后取　

出，置于室温冷却，按照ｍｉＲＮｅａｓｙ　ＦＦＰＥ　Ｋｉｔ说明书　操作提取ＲＮＡ；血清ＲＮＡ提取：将血清从一８０　ｃ《＝冰　

箱取出，置室温解冻，待完全溶解后取２００　ｔｘＬ血清　至１．５　ｍＬ灭菌、灭酶ＥＰ管中，按照ｍｉＲＮｅａｓｙ　Ｓｅｒ．　ｕｒｎ／Ｐｌａｓｍａ　Ｋｉｔ说明书操作提取ＲＮＡ。根据逆转录　

试剂盒ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ说明书操作将　ＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ，样本置一８０℃保存。通过　

ｍｉＲＢａｓｅ数据库查找ｍｉＲ一２０２成熟序列：ＡＧＡＧ—　

ＧＵＡｕＡＧＧＧＣＡｕＧＧＣＡＡ，采用茎环原则设计ｍｉＲ一　２０２（ＧｅｎｅＢａｎｋ序列号：ＮＣ一００００１０．１１）引物，其中　

卜－游引物序列：５　一ＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＴＡＴＡＧＧＧＣＡ一３　；　下游引物序列：５　ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ一３　。ｕ６　

基因（ＧｅｎｅＢａｎｋ序列号：ＮＣ一００００１５．１０）上游引物　序歹Ｕ：５　一ＣＴＣＧＣ　ＩＴｒＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＴＡＣＴ一３　，下游　

引物序列：５，＿ＡＣＧＣＴＩ’ＣＡＣＧＡＡＴＩ￣ＧＣＧＴＧＴＣ一３　，引　

物均由美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司合成。ＰＣＲ总反应体系　为２０　Ｌ，包括上、下游引物各０．８　ｔｘＬ，ＳＹＢＲ＠　

Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　１Ｉ　１０ｔｘＬ，ＲＯＸ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｄｙｅ　Ｉ１　０．４　Ｌ，模板ｃＤＮＡ　２　ｔｘＬ，无菌ｄｄＨ　０补足体积至２０　Ｌ。反应参数：９５℃预变性３０　Ｓ；９５℃３　Ｓ、６０　ｃ（＝　

３０　Ｓ，共４０个循环。用ＡＢＩ　７５００　Ｆａｓｔ　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　仪自带软件进行熔解曲线分析，ｍｉＲ－２０２的相对表　达量以２　△Ｃ　表示，ＡＡＣｔ＝［（样本Ｃ　【　ｆ躯　一样本　

ｃ　内参娃　）／（对照组Ｃ　口的基因一对照组Ｃ　内参赫圜）］。　

１．３统计学方法采用ＳＰＳＳ２１．０统计软件行统计　

学处理。不符合正态分布的计量资料以中位数（四　分位数）［Ｍ（Ｐ：　，Ｐ　）］表示，两组间比较采用Ｍａｎｎ—　

Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ检验，多组问比较采用Ｃｒｕｓｋａｌ—Ｗａｌｌｉｓ　Ｈ　检验。同时记录原发性肝癌患者肿瘤直径、肿瘤数　

目、肿瘤部位、ＴＮＭ分期［参照国际抗癌联盟／美国　

癌症联合委员会（ＵＩＣＣ／ＡＪＣＣ）标准］、分化程度、是　否转移、ＨＢＶ感染（采用乙肝ＤＮＡ定量ＰＣＲ法判　

定，以＜１００　Ｉ

Ｕ／ｍＬ为阴性）、ＡＦＰ浓度（采用德国西