高效液相色谱测定饮料中的咖啡因-研究生
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HPLC 法测定饮料中的咖啡因
一、实验目的
1、学习高效液相色谱仪的操作。
2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。
3、掌握高效液相色谱分析条件的选择
4、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。
二、实验原理
咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。
咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。
咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。
可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。
其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式为：
N N
3
H 3C
O
O N
N
CH 3
咖啡因的含量可使用反相高效液相色谱法测定。
三、仪器和试剂
1、高效液相色谱仪：Agilent 1100。
2、色谱柱：ODS ， 250×4.6mm 。
3、 流动相：甲醇-水。
4、 咖啡因标准贮备液：将咖啡因在110℃下烘干1h 。
准确称取0.1000g 咖啡因，用二
次蒸馏水溶解，定量转移至100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。
5、 测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。
四、实验内容
1、 用标准贮备液配制质量浓度分别为25、50、75、100、125μg·mL -1的标准系列溶液。
2、 色谱仪器条件：泵的流速：1.0mL/min ；检测波长：275nm ；进样量：20μL ；
柱温：室温。
3、 样品处理：
（1）将约100mL 可口可乐置于一250mL 洁净、干燥的烧杯中，剧烈搅拌30min 或用超声波脱气5min ，以赶尽可乐中二氧化碳。
（2）准确称取0.25g 速溶咖啡，用蒸馏水溶解，定量转移至100mL 容量瓶中，定容至刻度，摇匀。
（3）准确称取0.30g 茶叶，用20mL 蒸馏水煮沸10min ，冷却后，将上层清液转移至100mL 容量瓶中，并按此步骤再重复两次，最后用蒸馏水定容至刻度。
将上述三种样品溶液分别进行干过滤，弃去前过滤液，取后面的过滤液。
再分别吸取上述三份样品滤液25.00mL于125mL分液漏斗中，加入1.0mL饱和氯化钠溶液，1mL lmol·L-1 NaOH溶液，然后用20mL氯仿分三次萃取（10mL、5mL、5mL）。
将氯仿提取液分离后经过装有无水硫酸钠的小漏斗（在小漏斗的颈部放一团脱脂棉，上面铺一层无水硫酸钠）脱水，滤液用25mL容量瓶接收，最后用少量氯仿多次洗涤无水硫酸钠小漏斗，将洗涤液合并至容量瓶中，定容至刻度。
（4）将上述三份样品用0.45µm的过滤膜过滤后，注入干燥的样品管中备用。
4、工作曲线的绘制：待液相色谱仪基线平直后，分别注入咖啡因标准系列溶液20μL，记
录下个浓度下咖啡因的保留时间t R和峰面积A，绘制咖啡因峰面积与其浓度的关系曲线。
5、样品测定：分别注入样品溶液20μL，根据保留时间t R确定样品中咖啡因色谱峰的位置，
记下咖啡因色谱峰面积A x。
根据样品的峰面积，由工作曲线计算可口可乐、咖啡、茶叶中咖啡因的含量（分别用mg·L-1，mg·g-1和mg·g-1表示)。
五、结果处理。
