生物实验4 实时定量PCR 实验报告

pcr技术实验报告PCR技术实验报告引言PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它能够在短时间内扩增DNA片段，从而使得微量的DNA得以扩增至足够多的量进行进一步的分析和研究。

本实验旨在通过PCR技术扩增目标DNA片段，验证其在实验条件下的可行性和准确性。

实验方法1. 样品准备：从细胞或组织中提取DNA，并进行纯化处理。

2. PCR反应体系的准备：按照所需的PCR反应体系配制反应液。

3. PCR扩增：将DNA模板加入PCR反应管中，进行PCR扩增反应。

4. 扩增产物分析：将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

实验结果通过PCR技术扩增，成功获得了目标DNA片段，并在琼脂糖凝胶电泳中观察到了明显的扩增产物条带。

实验结果表明PCR技术在实验条件下具有较高的可行性和准确性，能够快速、高效地扩增目标DNA片段。

讨论本实验结果验证了PCR技术在实验条件下的可行性和准确性，为进一步的分子生物学研究提供了可靠的技术支持。

同时，本实验还表明PCR技术在分子诊断、基因克隆等领域具有重要的应用前景。

结论通过PCR技术实验，成功扩增了目标DNA片段，并验证了其在实验条件下的可行性和准确性。

PCR技术的高效、快速特点使其在分子生物学研究和临床诊断中具有广阔的应用前景。

总结PCR技术作为一种重要的分子生物学技术，已经成为现代生命科学研究中不可或缺的工具。

本实验结果验证了PCR技术在实验条件下的可行性和准确性，为进一步的研究和应用提供了可靠的技术支持。

PCR技术的不断发展和完善，将为生命科学领域的研究和临床诊断带来更多的可能性和机遇。

实验四定量PCR扩增姓名：李宗翰专业：环境工程学号：1432999 同组人姓名：刘雪飞一、实验目的复习定量PCR原理，熟悉绝对定量的操作流程二、实验原理实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析三、实验仪器及材料real time PCR仪(ABI7500, RotorGene 3000)，微量移液器，Tip头，0.2ml光学薄壁管，8联PCR管，1.5ml离心管，SYBR Mix，引物及108 copy/ul 标准品四、实验步骤1、标准样品稀释：取4个1.5ml的离心管，写上标记107，106, 105, 104，向每管加入90μl ddH2O，取10μl 108copy/ul 的标样加入到107管中，充分混匀后，从管中取10μl 107copy/ul的液体到106管中。

按上述操作依次稀释，得到5个倍数的标准样品。

注意，每次稀释都要换Tip头。

2、配制预混液：取119μl ddH2O、7μl引物4204f、7μl引物4448r和7μl Rox 到装有175μl SYBR Mix液的1.5ml离心管中，混匀。

3、分装预混液：取7个小离心管，分别标记108、107、106、105、104、UNK （未知样）、NTC（阴性对照）。

向其中分别加入42μl预混液和4.7μl模板（1-5号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O），混匀。

4、戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。

分别取上述样品20μl至第1-7管中（第8管空出），每个样品两个重复，共14个样品。

将加好样的8联管振荡。

5、设置分析仪参数如下：95℃3min；95℃15s+60℃40s为一个循环，循环次数40，融解曲线温度范围60~95℃。

A
25
为什么要做定性测定？
用于未知患者的确认 用于血液筛检 突变检测
A
26
定量和定性测定的结果报告
定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测定则 是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的 确认诊断。
定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范 围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告 >多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围， 则报告<多少，如<103拷贝数/ml，而不能报告为0拷 贝数/ml或阴性。
1/log2=-3.32
如果扩增效率为0.5（100%），则斜率A =1/log1.5=-5.68
A
21
纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型
此种计算模式下，斜率 A必≤-3.32。
截距B则为原始模板趋 向于0亦阴性标本检测的 Ct 值，因此，一个实时 荧光PCR，如果设定的 扩增循环数为40，则其 截距B即应≥40。
A
12
实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
在实时荧光PCR 中，每个模板的 Ct值与该模板的 起始拷贝数的对 数存在线性关系， 起始拷贝数越多， Ct值越小。
A
13
实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
利用已知起始拷贝 数的外部标准品可 做出标准曲线，在 现有实时荧光PCR 中，大部分以纵坐 标为Ct值，横坐标 为起始拷贝数，少 部分以纵坐标为起 始拷贝数，横坐标 为Ct值。
A
5
基本概念
Ct值（threshold cycle）或CP值（crossing point） Ct或CP值指的是实时监测扩增过程的 荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。主要 的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧 光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值 时的循环数则为阈值循环数（Ct）。有实验证 明Ct值与样本中的原始拷贝数成正比关系。Ct 值是当前实时荧光PCR的主要定量参数。

基本概念

扩增效率E（amplification efficiency） 扩增 效率指的是一个循环后的产物增加量与这个循 环的模板量的比值，其值位于0到1之间。在 PCR的前20或30个循环中，E值比较恒定，为 指数扩增期，随后E值逐步降低，直至0，此时 PCR达到平台期，不再扩增。扩增效率的计算 可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值 与所得Ct值做图，在一定范围内应该是得到一 条直线，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K为该 直线斜率）即可计算出E值。
纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型
纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型
LogX = -Ct×Log ( 1+E ) + Log YCt (5) 可变换为: Ct =( -1/log(1+E)) Log X +Log YCt / log(1+E) (7) A= -1/log(1+E), B= Log YCt / log(1+E) 如果扩增效率为1（100%），则斜率A =1/log2=-3.32 如果扩增效率为0.5（100%），则斜率A =1/log1.5=-5.68
基本概念

Ct值（threshold cycle）或CP值（crossing point） Ct或CP值指的是实时监测扩增过程的 荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。主要 的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧 光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值 时的循环数则为阈值循环数（Ct）。有实验证 明Ct值与样本中的原始拷贝数成正比关系。Ct 值是当前实时荧光PCR的主要定量参数。
实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型

在实时荧光PCR 中，每个模板的 Ct值与该模板的 起始拷贝数的对 数存在线性关系， 起始拷贝数越多， Ct值越小。

PCR的种类及其应用实验报告简介聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种分子生物学技术，可在体外合成大量特定DNA片段。

PCR技术广泛应用于生物医学研究、疾病诊断以及生物工程领域。

本实验旨在探究PCR技术的种类及其应用。

PCR的种类传统PCR传统PCR包括三个主要步骤：变性、引物结合和延伸。

首先，通过高温变性将DNA 双链分离为两条单链DNA。

然后，引物与目标DNA序列的两端结合。

最后，通过DNA 聚合酶的作用，在引物的起始点上合成新的DNA链。

实时定量PCR实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是PCR的一种改进形式，可快速、准确地定量测定 DNA的相对数量。

qPCR使用荧光探针或染料实时监测PCR反应的进程，从而实时测定DNA产物的累积量。

qPCR技术广泛应用于基因表达研究和疾病诊断等领域。

反转录PCR反转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）是一种结合了反转录和PCR的技术，可将RNA转录成DNA，并进一步进行PCR扩增。

RT-PCR技术常用于研究基因表达，可以测定特定基因的转录水平。

数字PCR数字PCR（Digital PCR，dPCR）是一种对DNA分子进行数字化处理的PCR技术。

这种技术能够准确计算起始DNA分子的数量，而不依赖于外部标准曲线。

dPCR常用于检测低拷贝基因、测定突变频率等。

PCR的应用基因克隆PCR技术在基因克隆中起着关键作用。

通过合成引物，选择性扩增所需基因片段，可以获得大量特定目标DNA。

这些扩增的DNA片段可以用于构建基因表达载体、插入突变或其他基因编辑等实验操作。

疾病诊断PCR技术在疾病诊断中具有重要意义。

通过特定引物扩增病原微生物的DNA或RNA，可以快速检测出疾病的存在。

例如，PCR在检测病毒、细菌感染和遗传疾病等方面广泛应用。

法医学鉴定PCR技术在法医学领域有着重要应用，可以通过扩增可疑样本中目标基因的DNA片段，进行罪犯的DNA鉴定。

QPCR实验报告实验报告：QPCR技术在基因表达分析中的应用一、引言基因表达是指基因通过转录和翻译过程产生相应分子的过程，是维持生物体正常功能的关键步骤。

定量聚合酶链反应（Quantitative PCR，QPCR）是一种常用的检测和分析基因表达水平的方法。

该方法通过测量目标基因在不同时间点或条件下的转录水平，可以揭示基因调控机制、寻找新的治疗靶点以及评估药物治疗的效果。

本实验旨在熟悉和掌握QPCR技术的基本操作步骤，并通过示例实验，了解该技术在基因表达分析中的应用。

二、材料与方法2.1实验仪器-核酸提取仪-反转录仪-实时定量PCR仪2.2实验材料-被测样品：包括正常组织和疾病组织样本-细胞裂解缓冲液-细胞核酸提取试剂盒-反转录试剂盒-实时定量PCR试剂盒2.3实验步骤1.样品处理：将被测样品均匀切割后，加入细胞裂解缓冲液使细胞破裂，并离心去除细胞碎片。

2.核酸提取：使用核酸提取试剂盒从细胞裂解液中提取总RNA，按照试剂盒说明进行操作。

3.反转录：将提取的总RNA加入反转录试剂盒进行反转录反应，将RNA转录为cDNA。

4.实时定量PCR：根据目标基因和参比基因设计引物，并使用实时定量PCR试剂盒进行PCR反应，测量模板DNA的含量。

5.数据分析：根据实时定量PCR的结果，计算目标基因的相对表达量，并进行统计分析。

三、结果与讨论3.1实时定量PCR结果通过实时定量PCR测量得到各样品中目标基因的转录水平。

以CT值为指标，CT值越低代表目标基因的转录水平越高。

同时还可以通过计算相对定量，比较不同样品之间目标基因的表达变化。

3.2数据分析通过对实时定量PCR结果的数据分析，可以得到目标基因的相对表达量，并进行统计学分析。

通常可以通过t检验来判断不同样品之间目标基因的表达差异是否具有统计学意义。

3.3结果讨论根据实验结果，可以得出目标基因在不同样品之间的表达差异是否达到统计学意义，并进一步分析可能的原因。

实用文档
实用文档
CT 值（ threshold value ）：每个反应管内的 荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称 为 CT 值。 研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数 的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越 小。反之亦然。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表 CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从 标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
• 评估基因表达水平等方面的工作,并在不需要构建和筛选 cDNA的前提下，完成对cDNA片段的克隆
实用量的飞跃，而 且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解 决PCR污染问题、自动化程度高等特点。 在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光 化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产 物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经 过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们 就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从 而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如下图) 。
实用文档
荧光定量PCR化学原理
1、SYBR Green （荧光染料掺入法） 在PCR反应体系中， 加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料 分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。
2、TaqMan （探针法） PCR扩增时在加入一对引物的同时 加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端 分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完 整时，报告基 团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩 增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报 告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可 接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光 分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同 步。

实时荧光定量PCR技术详解及总结实时荧光定量PCR技术的原理是基于PCR扩增过程中的荧光信号变化。

在PCR过程中，当荧光标记的探针与待扩增模板的特定序列结合时，荧光信号增加。

通过实时监测PCR反应体系中荧光信号的强度变化，可以定量计算起始模板数量。

与传统PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术具有更高的灵敏度和准确性。

实时荧光定量PCR技术在现代生物学研究中有广泛的应用。

首先，它被广泛应用于基因表达分析。

通过检测特定基因的mRNA水平，可以揭示基因在生物体内的表达情况及其调控机制。

其次，实时荧光定量PCR技术在病原微生物的检测和分析中也发挥了重要作用。

例如，可以利用实时荧光定量PCR技术检测病毒、细菌等病原微生物的存在，并确定其数量，这对于疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。

此外，该技术还常用于遗传多态性的分析、基因突变的检测、DNA甲基化的检测等。

相对于传统PCR技术，实时荧光定量PCR技术具有多项优势。

首先，实时荧光定量PCR技术具有更高的灵敏度。

实时荧光定量PCR技术可以实时监测扩增反应的进程，不仅可以提供扩增过程中的荧光信号变化曲线，还可以精确计算起始模板数量，从而实现对少量模板的高灵敏度检测。

其次，实时荧光定量PCR技术具有更高的准确性。

实时荧光定量PCR技术通过测量荧光信号，可以排除PCR反应中的假阳性结果，并准确计算起始模板的数量，从而提高了实验结果的准确性。

此外，实时荧光定量PCR技术的操作流程简单、快速，并以其高通量特点被广泛应用于高通量筛查和生物信息学研究中。

总结而言，实时荧光定量PCR技术是一种重要的分子生物学技术，它通过结合PCR扩增和荧光探针技术，实时监测和定量DNA扩增过程中的荧光信号变化，以实现对目标DNA序列的高灵敏度、高准确性的定量分析。

该技术在基因表达分析、病原微生物检测、遗传多态性分析等领域具有广泛应用。

实时荧光定量PCR技术的发展和应用，为生物学研究和临床诊断提供了重要的工具和方法。

实验四定量PCR扩增姓名：李宗翰专业：环境工程学号：1432999 同组人姓名：刘雪飞一、实验目的复习定量PCR原理，熟悉绝对定量的操作流程二、实验原理实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析三、实验仪器及材料real time PCR仪(ABI7500, RotorGene 3000)，微量移液器，Tip头，0.2ml光学薄壁管，8联PCR管，1.5ml离心管，SYBR Mix，引物及108 copy/ul 标准品四、实验步骤1、标准样品稀释：取4个1.5ml的离心管，写上标记107，106, 105, 104，向每管加入90μl ddH2O，取10μl 108copy/ul 的标样加入到107管中，充分混匀后，从管中取10μl 107copy/ul的液体到106管中。

按上述操作依次稀释，得到5个倍数的标准样品。

注意，每次稀释都要换Tip头。

2、配制预混液：取119μl ddH2O、7μl引物4204f、7μl引物4448r和7μl Rox 到装有175μl SYBR Mix液的1.5ml离心管中，混匀。

3、分装预混液：取7个小离心管，分别标记108、107、106、105、104、UNK （未知样）、NTC（阴性对照）。

向其中分别加入42μl预混液和4.7μl模板（1-5号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O），混匀。

4、戴上手套取两个8联管，并排放置管架上。

分别取上述样品20μl至第1-7管中（第8管空出），每个样品两个重复，共14个样品。

将加好样的8联管振荡。

5、设置分析仪参数如下：95℃3min；95℃15s+60℃40s为一个循环，循环次数40，融解曲线温度范围60~95℃。

实时荧光定量PCR技术的实验研究研究目的：本实验旨在通过实时荧光定量PCR技术，快速、准确地测量特定基因在不同组织样本中的表达水平，并探究其与疾病发生的相关性。

实验设计：1.提取样本：分别从正常组织和疾病组织中提取总RNA，并使用逆转录酶反应合成cDNA。

2. primer设计：根据目标基因序列设计引物，确保引物的特异性和合适的退火温度。

3. qPCR反应：设置qPCR反应体系，包括引物、模板cDNA、TaqMan探针、Master Mix等，进行PCR扩增反应。

4.扩增曲线分析：采集PCR反应过程中实时荧光数据，绘制扩增曲线，分析扩增效率和PCR产物的数量。

5. 目标基因表达分析：使用cycle threshold（Ct）值表示基因的表达量，计算相对表达量或绝对表达量。

实验步骤：1.提取样本：根据不同实验要求，选择合适的方法提取样本的总RNA，并检测RNA浓度和纯度。

2.逆转录反应：将相同量的RNA经过逆转录反应，合成对应的cDNA，用于后续的qPCR反应。

3. 引物设计：根据基因序列信息，使用PCR primer设计软件设计引物，确保引物的特异性和合适的退火温度，合成引物。

4. qPCR反应体系设置：根据厂家说明书或实验室常规操作，根据引物设计结果设置反应体系，包括引物、模板cDNA、探针和Master Mix。

5.qPCR反应：将反应体系装入PCR管或微孔板中，并进行qPCR反应。

设置实验组和对照组，确保实验结果的可靠性。

6.实时荧光数据采集：在PCR反应过程中，使用荧光分析仪实时记录PCR过程中的荧光信号。

7.扩增曲线分析：将荧光信号与PCR周期数进行关联分析，绘制扩增曲线，计算扩增效率和PCR产物数量。

8.目标基因表达分析：根据生成的扩增曲线，计算每个样品的Ct值，并通过对照组进行定量计算，得到相对或绝对的基因表达量。

9.数据统计与分析：使用统计学软件对实验结果进行统计学分析，确定基因表达水平的差异性。

pcr技术实验报告结果分析PCR 技术实验报告结果分析PCR 技术，即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在分子生物学领域广泛应用的强大工具。

通过这一技术，我们能够在短时间内大量扩增特定的 DNA 片段，从而为各种研究和应用提供了极大的便利。

在本次实验中，我们运用 PCR 技术对特定的基因片段进行了扩增，并对实验结果进行了详细的分析。

一、实验目的本次PCR 实验的主要目的是检测样本中是否存在特定的基因序列，并对其进行定量分析。

二、实验材料与方法（一）实验材料1、样本 DNA：从_____中提取的基因组 DNA。

2、引物：根据目标基因序列设计的特异性引物。

3、 PCR 试剂：包括 DNA 聚合酶、dNTPs、缓冲液等。

（二）实验方法1、 PCR 反应体系的配制：按照试剂说明书，将样本 DNA、引物、PCR 试剂等加入到反应管中，配制成总体积为_____μL 的反应体系。

2、 PCR 反应条件的设置：经过多次预实验优化，确定了以下反应条件：95°C 预变性_____分钟；95°C 变性_____秒，＿____°C 退火_____秒，72°C 延伸_____秒，共进行_____个循环；72°C 终延伸_____分钟。

三、实验结果（一）琼脂糖凝胶电泳结果将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察到了明显的条带。

其中，阳性对照样本显示出了预期大小的条带，而阴性对照样本则没有条带出现。

实验样本中，部分样本出现了与阳性对照相同大小的条带，表明这些样本中存在目标基因序列；而另一些样本则未出现条带，说明其不含目标基因或含量极低。

（二）定量 PCR 结果对于进行定量 PCR 的样本，通过仪器分析得到了每个样本中目标基因的拷贝数。

结果显示，不同样本中目标基因的含量存在显著差异，这可能与样本的来源、处理方式等因素有关。

四、结果分析（一）琼脂糖凝胶电泳结果分析1、阳性对照出现预期条带，说明 PCR 反应体系和反应条件设置正确，实验操作有效。

医学实验pcr检验实验报告标题：PCR检验实验报告引言：PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学实验技术，用于扩增DNA片段，并能够在非常小的样本中检测RNA或DNA的存在。

本报告旨在介绍PCR 检验实验的原理、步骤和结果分析。

一、实验原理：PCR是通过不断重复三个步骤来扩增DNA片段的方法。

这三个步骤是变性、退火和延伸。

首先将待扩增的DNA样本变性，使其双链DNA分离为两个单链DNA。

然后，通过引物（primer）与DNA单链的互补序列结合，使引物与DNA序列配对。

最后，使用DNA聚合酶在引物的指导下合成新的DNA链。

通过不断重复这三个步骤，可以在很短的时间内扩增出大量的特定DNA片段。

二、实验步骤：1. DNA提取：从待检测的样本中提取DNA，常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、热沉淀法等。

2. 反应体系配置：根据实验需求，在试管中配置PCR反应体系，包括DNA模板、引物、酶、缓冲液等。

3. PCR反应：使用热循环仪进行PCR反应，设置好反应的温度和时间，常见的PCR程序一般包括初始变性、循环变性、退火和延伸等步骤。

4. 凝胶电泳：将PCR反应体系中的产物进行凝胶电泳分析，以确定扩增的DNA 片段大小和纯度。

三、实验结果分析：1. 扩增曲线分析：观察PCR反应的扩增曲线，根据曲线形状和峰值大小判断PCR反应的效果。

2. 凝胶电泳结果分析：通过凝胶电泳分析PCR产物，可以确定扩增的DNA片段的大小和数量。

3. 阳性对照和阴性对照：设置阳性对照和阴性对照可以判断PCR反应体系的可靠性和准确性。

结论：PCR是一种常用的分子生物学技术，可以迅速高效地扩增DNA片段。

通过实验原理的介绍和实验步骤的详细说明，我们可以掌握PCR实验的基本操作方法。

实验结果的分析和结论部分，可以根据实际实验情况进行详细的阐述，包括扩增曲线、凝胶电泳结果等。

实验报告的撰写应该科学准确、简明扼要，以便他人能够理解和重复实验。

荧光定量pcr实习报告英文回答：Fluorescent quantitative PCR, also known as real-time PCR, is a powerful technique used to measure the amount of DNA or RNA in a sample. It is widely used in various fields such as molecular biology, genetics, and medical diagnostics. The key advantage of fluorescent quantitative PCR is its ability to provide real-time monitoring of the amplification process, allowing for accurate quantification of the target nucleic acid.The principle of fluorescent quantitative PCR involves the use of fluorescent probes or dyes that emit fluorescence when bound to the amplified DNA or RNA. There are several types of fluorescent probes commonly used in real-time PCR, including TaqMan probes, SYBR Green, and molecular beacons. These probes or dyes are designed to specifically bind to the target sequence, and their fluorescence intensity is directly proportional to theamount of target nucleic acid present in the sample.To perform a fluorescent quantitative PCR, a thermal cycler machine is used, which can rapidly change the temperature of the reaction mixture. The PCR reaction mixture contains the target DNA or RNA, primers that specifically bind to the target sequence, fluorescent probes or dyes, and the enzyme Taq DNA polymerase. The reaction mixture is subjected to a series of temperature cycles, including denaturation, annealing, and extension. The denaturation step separates the DNA strands, while the annealing step allows the primers to bind to the target sequence. The extension step involves the synthesis of new DNA strands by the Taq DNA polymerase enzyme.During the amplification process, the fluorescence emitted by the probes or dyes is detected by a fluorescence detector in the thermal cycler machine. The fluorescence intensity is recorded at each temperature cycle, allowing for the real-time monitoring of the amplification process. The amount of target nucleic acid in the sample can be determined by comparing the fluorescence intensity with astandard curve generated using known concentrations of the target nucleic acid.Fluorescent quantitative PCR has numerous applicationsin research and diagnostics. It can be used to quantifygene expression levels, detect genetic mutations, identify pathogens, and measure viral load in clinical samples. The technique is highly sensitive, specific, and reproducible, making it a valuable tool in molecular biology.中文回答：荧光定量PCR，也称为实时PCR，是一种用于测量样品中DNA或RNA数量的强大技术。

实时荧光定量PCR技术的操作实践实时荧光定量PCR技术是一种在生物医学领域应用广泛的分子生物学技术，主要用于基因表达水平的研究、疾病诊断和生物制品定量等。

本文将介绍实时荧光定量PCR技术的实验原理、操作实践、结果分析和总结。

实时荧光定量PCR技术的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累与PCR产物形成正比的关系，从而实现对目标基因的定量分析。

实验过程中，荧光信号被实时检测并记录，通过荧光阈值设定，将荧光信号转换为数量，最终实现对目标基因的定量分析。

准备实验材料和设备：包括RNA提取试剂、逆转录试剂、实时荧光定量PCR仪、PCR引物、荧光染料等。

提取RNA：将组织或细胞中的总RNA提取出来，根据需要逆转录成cDNA。

实时荧光定量PCR：将cDNA、荧光染料和特异性引物混合，在实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增。

数据收集和分析：收集荧光信号数据，根据标准曲线计算目标基因的相对表达量。

RNA提取时需选择合适的试剂，根据组织或细胞类型进行优化。

实时荧光定量PCR反应条件需根据目标基因和仪器型号进行调整，以确保最佳扩增效果。

荧光染料的加入要适量，以避免对PCR产物产生影响。

标准曲线的制作要采用已知浓度的样品，以便计算未知样品的相对表达量。

实验数据分析和解读是实时荧光定量PCR技术的关键环节之一。

通过对荧光信号数据的收集和分析，可以获得目标基因的表达量。

在标准曲线上，可以根据已知样品的浓度计算未知样品的相对表达量。

通过比较不同样品中目标基因的表达量，可以研究基因表达水平的差异。

还可以利用相对定量和绝对定量两种方法对目标基因进行定量分析。

在本次实时荧光定量PCR实验中，我们成功地检测了目标基因的表达量，并对其进行了相对定量和绝对定量的分析。

通过比较已知样品和未知样品的数据，我们发现目标基因的表达量在未知样品中明显高于已知样品。

这一结果表明，目标基因在未知样品中的表达水平较高，可能与某种特定条件或因素相关。

与终点法相较利用Ct值的优势
由于Ct值是反映实际PCR反映进程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的阻碍，因此利用Ct值判定的起始模板拷贝数加倍精准，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判定扩增产物的多少，从而间接的判定起始拷贝量，这种方式的精准度不高、重复性也不行。 以下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反映体系、相同的反映protocol、相同的样品起始浓度），能够看到Ct值具有专门好的重复性，而终点的荧光信号强度不同达到300个单位。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下1XXrpm 离心10分钟。现在离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2）变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
为了使实验最终取得的Ct值之间具有可比性，必需进行归一化的处置：1，对各样品进行
细胞计数，使各样品的起始细胞数一致（可操作性不强，尤其是针对组织、肿瘤等样品）；2，对纯化后取得的总RNA进行定量，使各样品进行RT-PCR时加入的RNA用量一致。 相对定量

基本概念
内源性内标（Endogenous control） 为一个出现在每 一个实验样本中的特定RNA或DNA，通过使用内源性 内标这种主动性参比，对于加入到每一个反应中的总 RNA量的差异，其可以校正靶mRNA的定量。
外源性内标（Exogenous control） 为一个以已知浓 度加入至每个样本中的特性确定的RNA或DNA，外源 性主动性参比通常为体外构建的，可作为内阳性质控 以鉴别由PCR抑制所致的假阴性。外源性参比也可用 来校正样本提取或cDNA逆转录合成的效率。
YCt = X ( 1+E )Ct (2) YCt 为荧光信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设 定以后，它就是一个常数。（2）式两边同时取对数，得：
Log YCt = LogX ( 1+E )Ct (3) 亦即：Log YCt = LogX +Ct×Log ( 1+E ) （4）
基本计算公式的推导
实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
在实时荧光PCR 中，每个模板的 Ct值与该模板的 起始拷贝数的对 数存在线性关系， 起始拷贝数越多， Ct值越小。
实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
利用已知起始拷贝 数的外部标准品可 做出标准曲线，在 现有实时荧光PCR 中，大部分以纵坐 标为Ct值，横坐标 为起始拷贝数，少 部分以纵坐标为起 始拷贝数，横坐标 为Ct值。
实时荧光定量PCR检测 的数据处理及结果报告
卫生部临床检验中心 李金明
基本概念
线性基线期 (Linear base-line phase) 为PCR扩增的四个主 要阶段之一（图）。线性基 线期为扩增最初的10~15个循 环，此时，PCR反应处于起 始阶段，扩增产物很少，所 产生的荧光信号很低，因此， 基线荧光信号可根据此阶段 产生的荧光信号来计算。

定量pcr实验报告定量PCR实验报告引言：PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，通过扩增目标DNA片段，可以在短时间内生成大量的DNA。

定量PCR是PCR的一种应用，可以精确测量目标DNA的数量。

本实验旨在使用定量PCR技术，对一种特定基因的DNA进行定量分析。

材料与方法：1. DNA样本：从人体组织中提取的DNA。

2. 基因特异性引物：设计用于扩增目标基因的引物。

3. TaqMan探针：与目标基因序列互补，携带荧光染料和荧光素。

4. 定量PCR试剂盒：包括PCR反应缓冲液、聚合酶、dNTPs等。

5. 实时荧光定量PCR仪：用于检测PCR反应过程中的荧光信号。

实验步骤：1. 样本制备：将DNA样本提取并纯化。

2. 引物设计：根据目标基因序列设计特异性引物。

3. PCR反应体系制备：将PCR反应缓冲液、引物、探针、聚合酶、dNTPs和DNA样本混合。

4. PCR扩增：在热循环仪中进行PCR扩增，包括一系列的变温步骤。

5. 荧光信号检测：实时荧光定量PCR仪会在每个循环结束后检测PCR反应体系中的荧光信号。

6. 数据分析：根据荧光信号的变化，计算目标基因的相对表达量。

结果与讨论：通过实时荧光定量PCR仪检测，我们获得了PCR反应体系中的荧光信号数据。

根据这些数据，我们计算出了目标基因的相对表达量。

通过对多个样本进行定量PCR实验，我们可以比较不同样本中目标基因的表达水平。

本实验的结果表明，在不同样本中目标基因的表达水平存在差异。

这些差异可能与个体的遗传背景、环境因素以及疾病状态等有关。

通过定量PCR技术，我们可以更加准确地研究基因表达的变化，从而深入了解相关生物学过程。

定量PCR技术的优点在于其高灵敏度和高特异性。

相比于传统的PCR技术，定量PCR可以提供更加准确的结果。

此外，定量PCR还可以同时检测多个基因的表达水平，从而为生物学研究提供更多的信息。

然而，定量PCR也存在一些局限性。

首先，PCR反应的成功与否取决于引物和探针的设计。