《医学分子生物学》课件：常用分子生物学技术的原理及其应用

第20章常用分子生物学技术的原理及其应用分子生物学技术是研究生物分子结构、功能、调控及其相互关系的重要手段，具有识别、分离、纯化、检测和重组生物分子的功能。

在生命科学研究和生物技术应用中，常用的分子生物学技术主要包括核酸提取、聚合酶链式反应（PCR）、限制酶切片段长度多态性分析（RFLP）、DNA测序、原位杂交、Northern和Southern blot杂交等。

下面将介绍这些常用分子生物学技术的原理及其应用。

1.核酸提取：核酸提取是从细胞或组织中获得目的核酸的方法。

其原理是通过细胞破碎及蛋白酶消化等步骤，将细胞内的核酸释放出来，并进行纯化。

核酸提取技术广泛应用于基因克隆、基因组学研究、医学诊断以及法医学中的DNA分析等领域。

2.聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种体外合成DNA的技术，通过多轮的循环温度反应，可以快速扩增一段特定的DNA序列。

其原理是利用DNA聚合酶酶活与特定引物的作用，在一系列温度循环中，使DNA序列通过链分离、引物结合、DNA合成循环进行扩增。

PCR技术被广泛应用于基因分型、基因克隆、突变检测、DNA测序等领域。

3.限制酶切片段长度多态性分析（RFLP）：RFLP是一种检测DNA序列多态性的方法，通过限制酶切割目的DNA，在凝胶电泳中观察DNA片段的长度差异。

其原理是利用限制酶对特定序列的识别和切割，形成不同长度的DNA片段，经凝胶电泳分离，通过核酸探针杂交或染料染色等方法来观察差异。

RFLP技术广泛应用于基因分型、基因组学研究、变异检测等领域。

4. DNA测序：DNA测序是一种确定DNA序列的方法，通过测定DNA的碱基顺序，揭示基因组结构和功能。

常用的DNA测序技术包括Sanger测序和高通量测序。

Sanger测序原理是利用DNA聚合酶、引物和一种特殊的停止链终止剂，在DNA合成过程中随机终止，形成不同长度的DNA片段，通过电泳分离后，通过染料或探针检测碱基顺序。

高通量测序技术基于快速测序平台和大规模并行测序，提高了测序效率和准确性，广泛应用于基因组学、转录组学等领域。

常用分子生物学技术的原理及其应用常用分子生物学技术是一系列用于分析和操作分子生物学层面的实验技术。

这些技术基于对核酸（DNA和RNA）和蛋白质的结构和功能的研究，以及对基因表达和调控机制的理解。

在本文中，我将介绍常用分子生物学技术的原理和应用。

1.聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种能够从极少量的DNA样本中扩增特定DNA序列的技术。

它基于DNA的两条链之间的互补配对，使用DNA聚合酶酶和引物来在离子和温度周期变化的条件下进行。

PCR技术广泛应用于分子生物学和生物医学研究中，包括基因克隆、基因突变分析、DNA指纹鉴定以及病原体的检测等。

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA，RNA和蛋白质的常用技术。

其中，聚丙烯酰胺（或琼脂糖）是一种高分子量聚合物，能够形成孔隙凝胶。

在电场的作用下，DNA，RNA或蛋白质在凝胶中迁移，根据大小和电荷的差异进行分离。

凝胶电泳广泛用于DNA和RNA的分离和纯化，以及蛋白质的分析和鉴定。

3.DNA测序：DNA测序是确定DNA序列的技术。

它通过测量DNA片段中的碱基顺序来分析DNA的序列信息。

目前有多种DNA测序技术，包括链终止测序（Sanger测序）和高通量测序（如Illumina测序和Ion Torrent测序）。

DNA测序在基因组学、遗传学和基因诊断中起着重要的作用。

4.基因克隆技术：基因克隆是指将目标基因从其源DNA中扩增，并将其插入到载体DNA 中，然后转化到宿主细胞中。

利用基因工程技术，克隆的基因可以在宿主细胞中被表达。

这种技术被广泛应用于重组蛋白质的定制表达、转基因生物的制备以及基因治疗的研究中。

5. 蛋白质电泳和Western blot：蛋白质电泳是一种分离和分析蛋白质的技术。

与DNA电泳类似，蛋白质电泳通过在聚丙烯酰胺凝胶中迁移蛋白质来分离不同大小和电荷的蛋白质。

Western blot是一种检测目标蛋白质的特异性抗体的技术，通过将蛋白质转移到膜上，然后使用特异性抗体与目标蛋白质结合来检测和定量蛋白质。

常用分子生物学技术的原理及应用1.聚合酶链反应（PCR）：PCR是一种在体外快速合成特定DNA片段的技术。

它的原理是基于DNA的逐步复制。

PCR需要DNA模板、DNA聚合酶、引物和dNTPs等反应物。

通过多个循环的高温退火、DNA扩增和DNA合成过程，可以在短时间内扩增指定的DNA片段。

应用：PCR在许多领域得到广泛应用。

它可用于基因组学、遗传学、医学诊断、病毒学等领域。

例如，PCR可以用于检测基因突变、诊断遗传疾病、鉴定病原体等。

2.DNA测序：DNA测序是一种确定DNA序列的技术。

目前主要有Sanger测序和高通量测序两种方法。

（1）Sanger测序原理：Sanger测序是一种经典的测序方法，基于DNA的DDN反应。

它利用碱基的链终止效应，使DNA合成过程在产生溶胶碱基的情况下中断，从而得到不同长度的DNA片段。

通过电泳分离并测定不同长度的DNA片段，可以确定DNA序列。

（2）高通量测序原理：高通量测序技术，如Illumina测序、Ion Torrent测序和Pacific Biosciences测序等，通过以平行方式同时测序多个DNA片段，大大提高了测序效率和数据产量。

应用：DNA测序技术在基因组学、癌症研究、生物进化等方面具有广泛应用。

它可以用于发现新基因、研究遗传变异、揭示物种演化等。

3.基因克隆：基因克隆是将DNA片段插入载体（如质粒）中并转化到细胞中，从而实现特定基因的复制和表达。

基因克隆包括DNA片段的剪接、连接、转化和筛选等步骤。

应用：基因克隆技术是分子生物学研究的基础。

它可以用于制备重组蛋白、构建转基因植物和动物、研究基因功能等。

4.蛋白质表达：蛋白质表达是将基因转录为mRNA，再通过翻译作用合成蛋白质的过程。

蛋白质表达技术包括原核和真核表达系统。

（1）原核表达系统：原核表达系统常用的有大肠杆菌表达系统和酵母表达系统。

这些系统可以用于高效表达蛋白质，并且易于操作。

（2）真核表达系统：真核表达系统是利用真核细胞如CHO、HEK293等表达蛋白质。