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Chip-Seq项目结题报告

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3 / 231 生物实验流程染色体免疫共沉淀（ChIP, chromatin immunoprecipitation）是一种用于研究蛋白质与DNA的体内相互作用的经典实验技术。

采用特异性抗体将目的蛋白进行免疫沉淀，由此可以把目的蛋白所结合的基因组DNA片段也富集下来。

通过与高通量测序技术的结合，对ChIP后的DNA产物进行测序分析，从全基因组范围内寻找目的蛋白的DNA结合位点，以高效率的测序手段得到高通量的数据结果。

1.1 ChIP免疫沉淀实验流程目前主要有两种不同的ChIP实验方法，大致流程如下（均以细胞样品的处理过程为例）：Cross-liking Chromatin Immunoprecitation (X-ChIP)1.甲醛处理细胞，使 DNA-protein 的相互结合作用被交联固定。

2.裂解细胞，得到全细胞裂解液。

3.超声处理，将基因组 DNA 打断至 100-500bp。

4.抗体免疫沉淀：在细胞裂解液中加入一抗和 beads，并进行孵育。

5.采用合适的实验条件进行洗脱，并解交联。

6.通过 qPCR 对 ChIP 结果进行验证。

7.准备好的 ChIP 后的 DNA 样品可以用于 ChIP Sequencing 建库。

Native Chromatin Immunoprecipitation (N-ChIP)1.通过非变性的方式得到核裂解液。

2.微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease）消化染色质，得到单核小体或核小体寡聚体。

3.抗体免疫沉淀：在细胞裂解液中前后加入一抗和 beads，并进行孵育。

4.DNA 分离。

5.通过 qPCR 对 ChIP 结果进行验证。

6.准备好的 ChIP 后的 DNA 样品可以用于 ChIP Sequencing 建库。

1.2 ChIP文库构建流程文库构建流程主要有以下步骤：1.DNA片段末端修复、3’端加A碱基，连接测序接头（详细步骤请参考Illumina公司Paired-End DNA SamplePrep kit）。

2.PCR扩增及DNA产物的片段大小选择（一般为100-300bp，包括接头序列在内）。

3.合格的文库用于上机测序。

流程如下：4 / 232 信息分析流程由Illumina测序产生的数据通过质量控制以及过滤，借助比对工具与参考基因组比对。

提取比对上唯一位置的序列，结果以bed文件存放，用bed文件做后续信息分析，包括read的分析和peak扫描。

在全基因组范围对peak进行扫描，对于扫描到的peak，对其相关联的基因进行分析，包括GO以及Pathway富集分析。

另外对于多样品，还可以做样品间差异Peak的鉴定。

信息分析流程如下：5 / 23二、分析结果2.1 数据过滤质控测序完成后，对原始数据进行去接头、去除低质量数据等处理,得到可用数据并统计产量。

一条序列如符合以下任一条件则会被作为不合格序列去除：1.序列含有adapter接头；2.N碱基含量超过10%序列长度；3.质量值低于20的碱基含量超过50%序列长度。

数据产出统计样品名序列长度序列总数碱基总数%GC Q20Q30 Sample1------Sample2------6 / 232.2 与参考序列比对2.2.1 比对结果统计将可用数据与所选参考基因组序列进行比对，设定允许不超过2个碱基的错配，其中比对到基因组上唯一位置的序列(唯一比对序列)将用于后续的信息分析。

比对结果统计样品名总序列数比对序列数比对率(%)唯一比对序列数唯一比对率(%) Sample1-----Sample2-----结果文件列表比对结果2.2.2 基因组测序深度累积分布以比对后得到的唯一比对序列为分析对象，分析其在参考基因组上的覆盖分布，统计基因组位点的深度信息，得到基因组上测序深度统计结果。

Sample1Sample1Sample1基因组测序深度累积分布图Sample27 / 23Sample2Sample2基因组测序深度累积分布图2.2.3 基因测序深度分布以比对后得到的唯一比对序列为分析对象，分析其在基因本体区间及上下游2k区间内的深度分布，得到基因及上下游区间深度分布结果。

Sample1Sample18 / 23Sample2Sample2Sample2基因及上下游测序深度分布图2.3 Peak 分析2.3.1 Peak扫描基于一定的分析模型在全基因组范围进行peak（ChIP Sequencing富集区域）扫描，得到peak在基因组上的位置信息，peak区域序列信息等。

peak结果以wiggle文件格式存放，可上传至UCSC查看，详细步骤参见帮助文档“UCSC Genome Browser使用说明”。

Peak信息统计样品名Peak数Peak总长度Peak平均长度Peak总序列深度Peak平均序列深度基因组比例(%) Sample1------Sample2------结果文件列表Peak统计2.3.2 Peak长度分布peak的长度是peak区间的重要信息之一，分析结果根据peak结果绘制得到每一个样品的peak长度分布。

以所有peak为分析对象进行绘图，x轴为peak的长度，y轴为特定长度peak分布数值。

Sample19 / 23Sample1peak 长度分布示意图Sample2Sample2 peak 长度分布示意图2.3.3 Peak 深度分布peak 区域所含序列数也是peak 区间的重要信息之一。

分析结果根据peak 结果绘制得到每一个样品的peak 所含序列10 / 23Sa mple1Sample 2以所有peak为分析对象进行绘图，x轴为peak的区域内序列数，y轴为特定序列数下peak的累积分布比例值。

Sample1Sample1Sample1 peak深度分布示意图Sample2Sample211 / 232.4 Peak 注释2.4.1 peak在基因功能元件上的分布以饼图表示Peak在基因的exon、intron、upstream、downstream、intergenic等功能元件的分布特征。

Sample1Sample1Sample1 peak基因功能元件分布示意图Sample212 / 23Sample2Sample2 peak基因功能元件分布示意图2.4.2 Peak 相关基因分析通过找到与目的蛋白相结合区域(Peak区域)在基因组上的定位及其与那些基因有关，从一定程度上表示了目的蛋白或特定组蛋白修饰可能调控的靶基因区域。

结果文件列表Sample1Sample22.4.3 peak相关基因的GO功能显著性富集分析Gene Ontology（简称GO）是一个国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表（controlled vocabulary）来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。

GO总共有三个ontology（本体），分别描述基因的分子功能（molecular function）、所处的细胞位置（cellular component）、参与的生物过程（biological process）。

GO的基本单位是term（词条、节点），每个term都对应一个属性。

Sample113 / 23Sample1 peak相关基因GO富集示意图Sample2Sample2 peak相关基因GO富集示意图结果文件列表Sample1Sample22.4.4 peak相关基因的Pathway功能显著性富集分析在生物体内，不同基因相互协调行使其生物学，基于 Pathway 的分析有助于更进一步了解基因的生物学功能。

KEGG 是有关 Pathway 的主要公共数据库，Pathway 显著性富集分析以 KEGG Pathway 为单位，应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在 peak相关基因中显著性富集的 Pathway。

结果文件列表Sample1Sample22.5 鉴定样品间差异Peak基于MAnorm工具，对两个样品进行差异分析，确定存在样品间差异修饰的区间。

结果文件列表14 / 232.6 样品间差异Peak注释2.6.1 差异Peak的基因功能元件分布以饼图表示Peak在基因的exon、intron、upstream、downstream、intergenic等功能元件的分布特征。

Sample1-vs-Sample2Sample1-vs-Sample2Sample1-vs-Sample2 peak基因功能元件分布示意图2.6.2 差异Peak相关基因分析结果文件列表Sample1-vs-Sample22.6.3 差异Peak相关基因的GO功能显著性富集分析结果文件列表Sample1-vs-Sample22.6.4 差异Peak相关基因的Pathway功能显著性富集分析结果文件列表Sample1-vs-Sample22.7 Motif分析基因表达起始于多种蛋白因子结合于特异的非编码DNA序列，非编码区域的主要研究方向之一即是Motif研究。

基因表达调控机制研究是生物学研究的重点内容，鉴定DNA调控元件尤其是DNA Motif，对于基因表达调控机制研究具有重要意义。

15 / 23Sample1_Motif_mastSample2_Motif_scanSample2_Motif_mast三、帮助文档3.1 生物信息分析3.1.1 原始序列数据(Raw data)测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，我们称之为raw data或raw reads，结果以FASTQ文件格式存储，包含reads的序列以及reads的测序质量。

在FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下：@A80GVTABXX:4:1:2587:1979#ACAGTGAT/1NTTTGATATGTGTGAGGACGTCTGCAGCGTCACCTTTATCGGCCATGGT+BTTMKZXUUUdddddddddddddddddddddddddddadddddd^WYYU每个序列共有4行，第1行和第3行是序列名称（有的fq文件为了节省存储空间会省略第三行“＋”后面的序列名称），由测序仪产生；第2行是序列；第4行是序列的测序质量，每个字符对应第2行每个碱基，第四行每个字符对应的ASCII值减去64，即为该碱基的测序质量值，比如c对应的ASCII值为99，那么其对应的碱基质量值是35。

从Illumina GA Pipeline v1.5开始，碱基质量值范围为2到41。

表1 为Illumina HiSeq TM 2000测序错误率与测序质量值简明对应关系。

如果测序错误率用E表示，碱基质量值用sQ表示，则有下列关系：Table 1. Illumina HiSeq TM 2000测序错误率与测序质量值简明对应关系Sequencing error rate Sequencing quality value Character 5%13M1%20T0.1%30^3.1.2 数据质控和过滤为了保证数据质量，要在信息分析前对原始数据进行质控和过滤。

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利用ChIPseq双荧光素酶报告基因技术验证PPAR2的靶向基因MYH7

利用ChIPseq双荧光素酶报告基因技术验证PPAR2的靶向基因MYH7

利用ChIPseq双荧光素酶报告基因技术验证PPAR2的靶向基因MYH7一、本文概述本文旨在利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和双荧光素酶报告基因技术（Dual-Luciferase Reporter Assay）来验证过氧化物酶体增殖物激活受体2（PPAR2）是否直接靶向调控肌球蛋白重链7（MYH7）基因。

PPAR2作为一种核受体，在多种生物学过程中发挥着关键作用，包括脂肪代谢、炎症反应和细胞分化等。

MYH7，作为肌球蛋白家族的一员，主要参与肌肉收缩和细胞骨架组成，其表达调控对于肌肉发育和功能至关重要。

因此，探究PPAR2是否通过直接结合MYH7基因启动子区域来调控其表达，对于理解PPAR2在肌肉生物学中的作用具有重要意义。

本文首先利用ChIP-seq技术，通过高通量的方法寻找PPAR2在体内结合的DNA序列，从而确定MYH7基因是否为其潜在的靶向基因。

在此基础上，通过构建包含MYH7基因启动子区域的双荧光素酶报告基因质粒，利用荧光素酶活性的变化来反映PPAR2对MYH7启动子的转录激活作用。

这种方法结合了染色质免疫沉淀的高特异性和荧光素酶报告基因技术的高灵敏度，为验证PPAR2对MYH7的靶向调控提供了强有力的实验手段。

通过本文的研究，我们期望能够明确PPAR2是否直接调控MYH7基因的表达，揭示这一调控过程的具体分子机制，并为进一步理解PPAR2在肌肉生物学中的功能提供新的线索。

二、材料与方法1 细胞系：使用人源细胞系，例如HEK293T细胞，用于后续的ChIP-seq和双荧光素酶报告基因实验。

2 ChIP-seq试剂：染色质免疫沉淀（ChIP）试剂盒、蛋白酶抑制剂、DNA纯化试剂盒、DNA片段化酶、测序引物等。

3 双荧光素酶报告基因系统：包含PPAR2反应元件（PPRE）的荧光素酶报告质粒，以及用于转染细胞的荧光素酶底物。

4 PPAR2特异性抗体：用于ChIP实验的PPAR2转录因子特异性抗体。

染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结

染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结

染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结第一篇：染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南及技术总结染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。

由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。

这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。

当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。

细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。

在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。

但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。

此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。

例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。

第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。

chip-seq实验质控步骤 -回复

chip-seq实验质控步骤 -回复

chip-seq实验质控步骤-回复Chip-seq（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing）是一种用于研究染色质上蛋白质与DNA相互作用的技术。

在进行Chip-seq实验之前，需要进行一系列的质控步骤，以确保实验结果的准确性和可靠性。

下面将详细介绍chipseq实验质控的步骤。

1. 样本制备和处理：在进行chipseq实验之前，首先需要准备和处理样本。

这包括细胞培养、组织切片或从体内收集样本等。

样本处理的关键是要保证DNA和蛋白质的一致性，避免样本中的污染和降解。

2. 交联和固定：细胞或组织中的染色质和蛋白质需要通过交连（cross-linking）来固定。

通常使用甲醛交联，以使蛋白质与DNA的相互作用被稳定下来。

这样可以防止在后续的实验过程中蛋白质和DNA的分离。

3. 组织裂解和核提取：交联后，需要对细胞或组织进行裂解以释放染色质。

这需要使用特定的裂解缓冲液，并且应该充分裂解细胞或组织。

裂解结束后，需要用溶解裂解液中的核酸结合蛋白质（例如鞘氨醇）来固定DNA。

4. DNA切碎：为了进行chipseq实验，需要将DNA切碎成适当的片段。

通常使用超声波或酶来切割DNA。

切割后的DNA片段应该具有合适的长度，以便与后续步骤中的抗体结合。

5. 免疫沉淀（immunoprecipitation）：在免疫沉淀步骤中，需要使用适当的抗体来沉淀与之结合的蛋白质-DNA 复合物。

这需要在适当的温度和时间下进行，以确保抗原和抗体的结合。

6. 沉淀后的DNA回收：在沉淀后，通过去除非特异性结合的DNA和蛋白质，可以有效地从免疫沉淀复合物中回收纯化的DNA。

这通常通过使用蛋白酶K对复合物进行消化，并使用盐溶液、马尿酸和异丙醇等来沉淀DNA。

7. DNA测序：回收的DNA需要进行测序以确定DNA片段的序列。

目前，高通量测序技术（如Illumina测序）被广泛应用于chipseq实验。

ChIP-Seq分析常见问题集锦

ChIP-Seq分析常见问题集锦

ChIP-Seq分析常见问题集锦染色质免疫共沉淀测序（ChIP-Seq）是指对染色质免疫共沉淀（ChIP）获得的DNA片段进行大规模测序，并能把所研究蛋白的DNA结合位点精确定位到基因组上。

Roche GS FLX Titanium 、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4 这3种测序技术均可以用于ChIP-seq，其中采用Illumina Solexa GA IIx进行ChIP-Seq已有较多文献报道。

ChIP-Seq技术高质量、高通量、低成本的数据产出，为表观遗传组学研究奠定了技术基础。

研究者可以在以下几方面展开研究：（1）判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；（2）检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；（3）研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；（4）CTCF转录因子研究。

ChIP-Seq有什么样品要求？答：（1）请提供浓度≥10 ng/ul、总量≥200 ng、OD260/280为1.8~2.2的DNA样品；若单次ChIP后DNA量不够，建议将2~3次ChIP的DNA合并在一起。

（2）请提供DNA打断时检测胶图，要求打断后DNA电泳主带在200-500bp范围内；请对于ChIP 获得DNA设计引物进行QPCR验证和定量，能够提供检测位点的检测报告。

附阳性和阴性对照。

（3）样品请置于1.5 ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm封口。

在运输前将所有样品管固定于50ml带盖离心管中，再将50ml管放在封口袋中。

ChIP-Seq相比ChIP-chip有哪些优势？答：第一，ChIP-Seq 能实现真正的全基因组分析。

目前所能获得的芯片上固定的探针只能代表全基因组部分序列，所获得的杂交信息具有偏向性；第二，对于结合位点分析，ChIP-Seq 通过寻找“峰”，结合分辨率可精确到10~30 bp，而芯片上探针由于长度所限，无法精确定位，即使目前最高水平的商业芯片都无法提供可与ChIP-Seq 媲美的分辨率；第三是所需样本数量。