Fortebio-分子相互作用仪

Small Molecule Kinetics Assay:概述：Octet可检测分子量为150 Da~1000 Da的小分子与蛋白间相互作用。

该SOP的目的在于为小分子动力学检测提供通用标准化流程，针对具体分子及特殊情况，可能需要进一步考虑更多细节及优化。

此外，该SOP假定所有使用者已经过ForteBio应用科学家上机培训，如若不然，请在培训完成后参考该SOP。

考量及建议：1.检测小分子时，应当使用SSA sensor（Cat# 18-0008 and 18-0009），该sensor是ForteBio公司目前唯一具备检测小分子灵敏度的传感器。

2.用于与小分子结合的蛋白或抗体必须先进行生物素化。

请参阅ForteBio技术说明书。

3.建议assay buffer为PBS+0.1%BSA+0.02%TW20+5%DMSO（如果为水溶性小分子，则无需加DMSO等有机溶剂）；4.设置protocol时，须设置两组SSA sensor，运行中第1组为实际检测用sensor，第2组为生物胞素（biocytin）封闭后、用作阴性对照的sensor。

5.检测sensor与对照sensor间运行步骤数以及各步运行时间必须一致——任何偏差将导致数据无法分析。

6.用于loding的生物素化蛋白浓度建议采用50ug/ml。

如蛋白很小或容易产生空间位阻，可能需要进行定量。

如蛋白较宝贵，其用量可以更低，但随后的结合效率可能会有所折扣（17kDa的蛋白在推荐浓度下3min后可产生2nm的shift）。

蛋白生物素化7.如果需要有机溶剂溶解小分子，稀释样品时DMSO最终浓度建议保持在5%以内（例如：溶于100%DMSO中20mM的样品，按照1:20溶于PBS后其浓度为1mM，DMSO为5%）。

8.建议对样品进行两轮筛选。

例如，第1轮宽泛筛选，浓度为100,10,1,0.1uM，确定样品大概Kd范围；第2轮更精细筛选：30,10,3.3,1.1uM（或者2被剃度稀释）获取高度可信的Kd。

Fortebio技术概览引言Fortebio是一家生物科技公司，致力于提供先进的生物分析和生物传感技术解决方案。

该公司的核心技术包括光学生物传感技术，用于监测生物分子的相互作用。

本文将对Fortebio 公司的技术进行概览，并介绍其应用领域和优势。

技术原理Fortebio的核心技术基于表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）现象，这是一种用于研究生物分子相互作用的光学技术。

SPR技术通过检测生物分子的表面等离子体共振现象，可以实时监测和分析生物分子之间的相互作用。

Fortebio的SPR技术基于Biolayer Interferometry（BLI）原理，该原理通过改变表面反射的光信号，实现对生物分子相互作用的监测。

BLI技术具有高灵敏度、快速响应和实时监测等优点，已广泛用于生物学研究、药物开发和临床诊断等领域。

应用领域Fortebio的技术广泛应用于生物领域的各个方面，包括但不限于以下应用领域：蛋白质相互作用研究Fortebio的技术可以实时监测和分析蛋白质之间的相互作用。

通过测量蛋白质的结合动力学和亲和力，研究人员可以深入了解蛋白质的功能和作用机制。

这对于药物开发、蛋白质工程和生物学研究都具有重要意义。

药物研发Fortebio的技术可以帮助加速药物研发过程。

通过实时监测药物与靶标蛋白的相互作用，研究人员可以评估药物的亲和力和效力，优化药物设计和筛选潜在药物候选物。

这有助于加快药物研发的速度和降低研发成本。

病原体检测与诊断Fortebio的技术还可以应用于病原体的检测和诊断。

通过与病原体相关的抗原或抗体的相互作用，可以提高病原体的检测灵敏度和特异性。

这对于传染病的快速诊断和筛选病原体也具有重要意义。

基因组学研究Fortebio的技术可以用于研究基因组学。

通过检测DNA的结合与修饰，研究人员可以了解基因的表达调控机制和细胞过程。

这对于基因组学研究和疾病诊断有重要意义。

q-exactive 质谱仪原理Q-Exactive是一种高分辨率质谱仪，常用于生物分析、药物研发和其他化学分析领域。

以下是Q-Exactive质谱仪的基本原理：1.质谱部分：Q-Exactive使用了一种称为Orbitrap的质谱技术。

Orbitrap技术是一种高分辨率和高灵敏度的质谱技术。

它基于一个稳定的静电场，通过在两个电极之间加电荷使离子绕轴心轨道运动。

质谱仪能够测量离子的频率和幅度，从而确定其质荷比。

2.Ionization（离子化）：样品中的分子首先被离子化，通常使用电喷雾离子源（ElectrosprayIonization，ESI）或者大气压化学电离（Atmospheric Pressure Chemical Ionization，APCI）等技术。

3.质谱分离：离子通过一系列的离子光学设备，如四极杆和激发的离子单色仪，被分离和筛选。

这有助于选择性地将特定离子引入Orbitrap。

4.Orbitrap分析：离子进入Orbitrap，其轨道上形成一个高频率的、稳定的静电场。

当离子在这个静电场中运动时，它们会产生一个与离子数成正比的电流。

这个电流信号被测量并转换为质谱图。

5.数据处理：质谱图的数据可以通过计算机进行处理，以提取有关分析物的信息。

这包括质量-电荷比，相对丰度等。

优点：1.高分辨率：Q-Exactive提供非常高的分辨率，有助于更准确地确定化合物的质量。

2.高灵敏度：对低浓度的化合物也具有较高的检测灵敏度。

3.广泛适用性：可用于蛋白质鉴定、代谢组学、药物研发等多个领域。

注意：实际的仪器配置和工作原理可能因不同型号的Q-Exactive和使用的具体实验条件而有所不同。

详细的操作手册和仪器文献可提供更具体的信息。

Small Molecule Kinetics Assay:概述：Octet RED系列可检测分子量为150 Da~1000 Da的小分子与蛋白间相互作用。

该SOP的目的在于为小分子动力学检测提供通用标准化流程，针对具体分子及特殊情况，可能需要进一步考虑更多细节及优化。

此外，该SOP假定所有使用者已经过ForteBio应用科学家上机培训，如若不然，请在培训完成后参考该SOP。

考量及建议：1.采用RED系列检测小分子时，应当使用SSA sensor（Cat# 18-0008 and 18-0009），该sensor是ForteBio公司目前唯一具备检测小分子灵敏度的传感器。

2.用于与小分子结合的蛋白或抗体必须生物素化。

请参阅ForteBio技术说明书。

3.建议assay buffer为PBS+5%DMSO；4.设置protocol时，须设置两组SSA sensor，运行中第1组为实际检测用sensor，第2组为生物胞素（biocytin）封闭后、用作阴性对照的sensor。

5.至关重要的是，检测sensor与对照sensor间运行步骤数以及各步运行时间必须一致-任何偏差将导致所得数据无法于Octet RED软件上分析。

6.用于loding的生物素化蛋白浓度建议采用50ug/ml。

如蛋白很小或容易产生空间位阻，可能需要进行定量。

如蛋白较宝贵，其用量可以更低，但随后的结合效率可能会有所折扣（17kDa的蛋白在推荐浓度下3min后可产生2nm的shift）。

7.稀释样品，DMSO最终浓度为5%（例如：溶于100%DMSO中20mM的样品，按照1:20溶于PBS后其浓度为1mM，DMSO为5%）。

8.建议对样品进行两轮筛选。

例如，第1轮宽泛筛选，浓度为100,10,1,0.1uM，确定样品大概Kd范围；第2轮更精细筛选：30,10,3.3,1.1uM，获取高度可信的Kd。

（注意：所用浓度仅用于发挥导向性作用，实际浓度取决于初筛所获得Kd）。

生物膜干涉技术(BLI) 常见问题解答（第二版）目录缩写说明 (2)动力学相关术语 (2)传感器和仪器相关术语 (2)生化相关术语 (3)1 实验基本常识 (3)1.1如何自学 (3)1.2关于动力学 (3)1.3关于耗材与样品要求 (5)1.4关于生物膜干涉技术 (7)1.5软件与硬件性能参数 (8)1.6关于应用 (11)1.7关于基本操作 (11)2 动力学实验设计与操作 (15)2.1 关于固化和传感器的选择 (15)2.2 关于结合和解离 (19)2.3 关于传感器再生 (20)2.4 小分子检测 (21)2.5 动力学实验操作 (23)2.6 动力学实验数据处理 (29)2.7实验常见问题（动力学部分） (39)3 定量实验设计与操作 (44)3.1定量实验设计 (44)3.2 定量实验操作 (46)3.3定量实验数据处理 (48)3.4实验常见问题（定量部分） (51)4 仪器维护与硬件问题 (51)5 联系我们 (55)缩写说明动力学相关术语k on或k a：结合速率常数，单位M-1s-1k off或者k d：解离速率常数，单位s-1K D：亲和力常数（解离平衡常数），单位Mk obs：表观结合常数[C]：分析物浓度Ligand：配体，即固化在传感器上的物质Analyte：分析物，即与固化物质结合的物质R max：理论上分析物结合信号的最大值，即所有ligand均被analyte结合后所获得的信号Req：分析物结合达到平衡时的信号值Initial slope：起始斜率BLI：生物膜干涉技术Baseline：平衡步骤Association：结合步骤Dissociation：解离步骤Loading：固化步骤传感器和仪器相关术语SA：链霉亲和素传感器SSA：超级链霉亲和素传感器APS：氨基丙基硅烷传感器AR2G：氨基偶联传感器AHC：抗人免疫球蛋白Fc段传感器AHQ：人免疫球蛋白定量传感器AMQ：鼠免疫球蛋白定量传感器AMC：抗鼠免疫球蛋白Fc段传感器NTA：镍离子传感器anti-His：抗组氨酸标签传感器anti-GST：抗GST标签传感器Capture类传感器：除去SA，SAX，SSA，AR2G，APS外的传感器Octet：Octet家族仪器，包含Octet RED，RED96，QK，QKe，QK384，RED384，HTX，K2RED系列仪器：RED，RED96，RED384，K2QK系列仪器：QK，QKe，QK384生化相关术语EDC：1-(3-二甲基氨丙基) -3-乙基-碳化二亚胺NHS：N-羟基琥珀酰亚胺HRP：辣根过氧化物酶DAB：二氨基联苯胺，一种HRP的底物，在HRP催化后可以生成金属沉淀EMSA：电泳迁移率实验，用来研究DNA和蛋白的结合Epitope binning：表位分析His-tag：组氨酸标签Co-IP：免疫共沉淀PBS：磷酸盐缓冲液BSA：牛血清白蛋白hIgG：人免疫球蛋白mIgG：鼠免疫球蛋白1:1反应：一份的ligand与一份的analyte形成一份的产物，即两者只有一个结合位点2:1反应：Ligand上有2个可以和analyte的结合位点，并且两者独立1:2反应：Analyte上有2个可以和ligand结合的位点，并且两者独立1 实验基本常识1.2关于动力学1.2.1 k on, k off, K D值各代表什么意义？生物分子间的相互作用一般视为可逆反应。

The being detected thing is small molecular, and the sensor is immobilized with macromolecular. The detected way is by column. For example , the bio-protein A with IgG.1.双击数据分析软件图标，打开数据分析软件，在软件Data Selection界面左下侧子窗口路径下选中待分析kinetics数据：2.双击后载入左上侧子窗口Loaded Data Kinetics文件夹下3.左键单击所载入待分析数据，右侧窗口显示Sensor Tray按钮下界面，即该检测中sensor所在sensor tray上位置，在此可选择分析哪些sensor采集的数据，本例分析所有sensor的数据等。

5.选择所需分析sensor后，点击Processing进行数据处理：6.数据处理界面如下，该窗口左侧依次包括Step1:Data Selection，Step2:Subtraction，Step3:Align Y Axis，Step4:Inter-step Correction，Step5:Process，Step6:View Results，Step7: Save Results；右侧窗口默认为Raw Data View下界面，即原始数据预览。

7.点击Step 1下Sensor Selection按钮，界面如下：8.对于非经典小分子实验，在实验设计上包括sensor对照和孔对照（间经典小分子实验设计SOP），与经典小分子实验相比其差别在于浓度梯度按列排列，1个浓度1根sensor（经典小分子实验浓度梯度安行排列，所有浓度采用同一根sensor从低到高顺序检测）；数据处理时需分别扣除对照孔及对照sensor引入的干扰；选中对照孔，右键下选择Change Well Type…下的Refference Well：设置Refference Well后界面如下：9.在Sensor Tray下选中对照Sensor，右键选择Change Sensor Type…下的Refference Sensor：设置Refference Sensor后的界面如下：10.在Step 2下选中Double Subtraction，即扣除对照空及对照sensor可能引入的干扰：。

Biacore 生物大分子相互作用分析仪BIA是英语"Biomolecular Interaction Analysis"的缩写，Biacore提供了实时观察生物分子间相互作用的技术。

通过它您能观察两种分子结合的特异性，能知道两种分子的结合有多强，还能了解生物分子的结合过程共有多少个协同者和参与者。

Biacore可以让您得到用其他技术方法难以得到的结果，因为它可以实时反映分子结合过程中每一秒变化的情况。

无需借助标记物进行分析使Biacore广泛应用于各类生物体系的测定，从各类小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸和寡聚糖直至类脂、噬菌体、病毒和细胞。

Biacore 是一个通用的仪器，因为您可以任意偶连如上所述任一种生物分子到传感片表面。

因此要将Biacore应用在哪个领域，由您决定!Biacore 拥有20余年表面等离子共振（SPR）生物传感器的研发经验，是生物分子相互作用领域的技术引领者和标准制定者。

Biacore系统提供独到的洞察力来揭示蛋白质以及其他生物分子之间的相互作用，能够帮助科学家们更深入的理解生物分子的功能、更好的作出决策和提高生产力。

Biacore是基于表面等离子共振(SPR)技术来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标记物。

实验时先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。

检测器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化。

Biacore系统可以为很多领域提供有价值的信息包括：动力学、亲和力、特异性、热力学和浓度等，同时它所能够研究的分子范围也十分广泛-大至细胞与病毒，小至100道尔顿以下的有机化合物。

Biacore系统性能强大的硬件、种类丰富的耗材和操控智能的软件适合各个领域对于各种高质量数据的需求：无论是基础研究，还是药物开发，甚至是生产过程中的质量控制。

您可以从Biacore官方网站（）上查询到更多的信息。

sartorius octet-r8原理概述及解释说明1. 引言1.1 概述本文旨在对Sartorius Octet-R8原理进行概述和解释说明。

该仪器是一种高精度生物分析设备，广泛应用于生物制药领域和蛋白质研究领域等。

通过深入了解Octet-R8的技术背景、原理概述、功能和特点，以及其在不同领域中的应用，读者将更全面地了解这一先进仪器。

1.2 文章结构本文将按以下结构进行组织：引言部分首先对文章进行概述，介绍Octet-R8的背景信息，并阐明文章目的；随后，“Sartorius Octet-R8原理”部分将详细探讨其技术背景、原理概述以及功能和特点；接下来，“Octet-R8的应用领域”部分将列举生物制药领域、蛋白质研究领域和其他应用领域中该仪器的具体应用；而“Octet-R8的操作和实验步骤”部分则将重点介绍仪器设置与准备工作、样品处理与靶标免疫分析设置以及数据分析与结果解释等内容；最后，在“结论”部分，本文将对研究进行总结，并对进一步展望进行讨论。

1.3 目的本文的目的是系统介绍和解释Sartorius Octet-R8仪器的原理。

通过对该仪器的技术背景和原理进行概述，在描述其功能和特点后，将进一步探讨其在生物制药领域、蛋白质研究领域以及其他应用领域中的具体应用。

同时，文章还将提供详细的操作和实验步骤，以帮助读者更好地了解如何正确操作Octet-R8，并进行数据分析与结果解释。

最终，通过对研究结果进行总结并展望未来发展趋势，旨在为读者提供全面深入的Octet-R8相关知识。

2. Sartorius Octet-R8原理：2.1 技术背景：Sartorius Octet-R8是一种生物分析仪器，专门用于实时监测和分析生物分子间相互作用的强度和亲和性。

它基于光学技术和磁珠传感器，能够进行高通量的生物相互作用实验。

2.2 原理概述：Sartorius Octet-R8使用一种称为光学全息身份验证（ForteBio）的技术来检测生物分子间的相互作用。

FortebioOctetBLI蛋⽩⽣物素标记应⽤指南蛋⽩的⽣物素标记操作指南（Octet分⼦互作仪器测定专⽤）概述链霉亲和素与⽣物素之间的相互作⽤是⽬前已知强度最⾼的⾮共价作⽤，并且⼆者的结合稳定性好，专⼀性强，不受试剂浓度，pH环境，抑或蛋⽩变性剂等有机溶剂影响。

因此，链霉亲和素与⽣物素快速，稳定和不可逆⾮共价的结合被⼴泛应⽤于研究⽣物分⼦间的相互作⽤。

Octet平台的链霉亲和素（SA/SAX/SSA）⽣物传感器已被开发⽤于蛋⽩定量和动⼒学，结合在SA//SAX/SSA传感器上的第⼀个蛋⽩质必须进⾏⽣物素化标记。

为⽅便利⽤Octet平台上的SA/SAX/SSA传感器进⾏动⼒学和定量分析，特制订本指南为利⽤⽣物素化试剂标记⽬标蛋⽩提供指导。

⽣物素试剂的选择Biotin为例。

⽣物素化试剂建议购买⼩包装，使⽤DMSO溶解配制成10 mM母液保存于-20℃备⽤。

产品货号：21312的NHS-PEG12-Biotin为例：10 mM母液的配制案例=（⽣物素化试剂质量1mg）÷（⽣物素分⼦量941Da）×100=0.106 mL，1 mg⽣物素化试剂溶于0.106 mL DMSO中即为10 mM母液。

氨基偶联⽣物素化试剂反应⽰意图实验试剂和耗材1)缓冲液：DMSO，1×PBS，PBST（PBS+0.02% tween20）2)掌上离⼼机，⼀台3)⽣物素标记试剂EZ-Link NHS-PEG12-Biotin (Thermo，货号：21312) 1 mg，加⼊0.106 mL的DMSO配置成10 mM母液4)PD Min iTrap? G-25 Desalting Column⽤于脱盐，蛋⽩样品体积0.1-0.5 mL，(GE, 货号：28-9180-07 )。

5)Zeba desalting spin columns脱盐柱：a)蛋⽩样品体积30-130 uL,使⽤0.5 mL脱盐柱(Thermo, 货号：89882)b)蛋⽩样品体积200-700 uL,使⽤2 mL脱盐柱(Thermo, 货号：89889)c)蛋⽩样品体积600-2000 uL,使⽤5 mL脱盐柱(Thermo, 货号：89891)6)透析装置：Slide-A-Lyzer? Dialysis Cassettes（Thermo，具体型号根据⽬标蛋⽩样品体积以及⽬标蛋⽩的分⼦量进⾏选择。

H T R F技术原理和应用介绍本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.MarchCisbio-HTRF®技术原理和应用简介HTRF®（均相时间分辨荧光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是一种用来检测纯液相体系中待测物的技术。

该技术基于荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence)）两大技术，开通的一款高通量药物筛选利器。

荧光共振能量转移（FRET）利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体（Donor）和能量受体（Acceptor）。

Donor被外来光源激发（例如氙灯或激光），如果它与Acceptor比较接近，可以将能量共振转移到在Acceptor上，使其受到激发，发出特定波长的发射光。

将Donor和Acceptor分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将Donor和Acceptor拉到足够近的距离，产生能量转移，由于Acceptor的发射光来自能量转移，所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。

时间分辨荧光（TRF）TRF利用稀土元素中镧系元素的独特性质，它们与普通荧光的主要区别是荧光的持续时间不同。

普通荧光的半衰期为纳秒级。

镧系元素的半衰期为毫秒级，有6个数量级的差别。

所以，在检测室，TRF有一个时间延迟---50us，经过这个时间延迟，普通荧光的信号几乎为零，所以，TRF的背景非常低，反映样品实际情况。

HTRF®的能量受体（技术创新点）HTRF®的能量供体是铕(Eu)和钛(Tb)的穴状化合物。

在这个穴状化合物里，Eu和Tb被永久地嵌合在一个笼子里，结构非常稳定，这个结构由J.M.Lehn’s教授发明的，并由此在1987年获得了诺贝尔奖。