细胞计数与测量 郭森
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微生物大小的测量与微生物计数
郭森 09级生命基地 200900140029
周二下午第五排
摘要：本实验的目的是学习掌握显微测微尺测定微生物大小和用血细胞计数板测定微生物细胞数量的方法。
本次实验是使用显微测微尺测量枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的大小，使用血细胞计数板对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的发酵液中的菌体进行计数。
实验中分别对两种菌种的大小进行了测量，对酿酒酵母发酵液中的菌体进行了计数，并得到了多组测量数据。
关键词：微生物大小的测量；显微测微尺；显微镜直接计数法；血细胞计数板
前言：微生物菌体的大小和微生物菌体的数量是微生物的重要特征，可以通过测量微生物菌体的大小和微生物菌体的数量来判断微生物的生长状况。
微生物大小的测定需借助特殊的目镜测微尺和镜台测微尺互相配合作为测量工具。
其中在进行测量前要先使用镜台测微尺对目镜测微尺进行校正。
【1】微生物计数常用的直接计数法是利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积内的微生物的数量，而后利用菌液稀释倍数和体积关系求得每升菌液内微生物的数量。
【2】
1 材料和方法
1.1材料
1.1.1菌种
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
1.1.2溶液与试剂
0.1%吕氏碱性美蓝染液，蒸馏水。
1.1.3仪器及其他用品
目镜测微尺，镜台测微尺，普通光学显微镜，擦镜纸；血细胞计数板，移液管，小玻璃珠，烧杯，锥形瓶等。
1.2方法【1】
1.2.1显微测微尺测量微生物大小
1.2.1.1目镜测微尺的安装
取出目镜，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后将目镜插回镜筒内。
1.2.1.2校正目镜测微尺
将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜在物台上。
先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清楚地看到镜台测微尺的刻度后，旋转目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。
利用推进器移动镜台测微尺，使两尺的某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重和线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。
用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正。
分别测出在高倍镜下和油镜下两重合线之间两尺分别所占的格数。
目镜测微尺每格长度（um）=两重合线镜台测微尺格数x10/两重合线间目镜测微尺格数1.2.1.3菌体大小测定
目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上美蓝染色的枯草芽孢杆菌制片。
先用
低倍镜找到菌体后，使用高倍镜测定枯草芽孢杆菌的宽度和长度。
用测得的格数乘以算得的每格长度即得枯草杆菌的具体长宽。
用同样的方法测量酿酒酵母的直径。
1.2.1.4测定完毕
测定完毕后，取出目镜测微尺，将目镜测微尺与镜台测微尺分别用擦镜纸擦净，放回盒内保存。
1.2.2直接计数法测量微生物数量
1.2.2.1酵母菌悬液制备
将酿酒酵母的发酵液摇匀，用1ml移液管移取1ml，将其注入装有玻璃珠的锥形瓶中，用10ml移液管移取19ml蒸馏水注入相同锥形瓶中，摇晃20min。
1.2.2.2检查血细胞计数板
在加样前，先对血细胞计数板的计数室进行镜检。
若有污物，可用自来水冲洗，再用95%乙醇棉球轻轻擦洗，然后用吸水纸吸干或电吹风吹干。
1.2.2.3加样品
将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母悬液由盖玻片的边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。
静置5min，使细胞自然沉降。
1.2.2.4显微镜计数
将加有样品的血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。
每个计数室选五个中格中的菌体进行计数。
位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。
若酵母出芽，芽体大小达到母细胞一半时，即作为两个菌体计数。
1.2.2.5清洗
使用完毕后，将血细胞计数板及盖玻片清洗干燥，放回盒中，以备下次使用。
2 实验结果与分析
2.1实验结果
2.1.1测定微生物大小（见表1，2，3,4）
（1）目镜测微尺校正结果（表1）
表1 目镜测微尺校正结果
物镜物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格数目镜测微尺代表的长度/um
低倍镜10 58 30 5.172
高倍镜40 79 10 1.266
油镜100 20 1 0.500
目镜放大倍数：10
(2)微生物大小测定结果（见表2、3、4）
表2 枯草芽孢杆菌大小测定记录（单位:目镜测微尺格数）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均
宽度 2 2 2 2 2 1.8 1.8 2 2 2 1.96
长度17 21 18 20 19 19 20 19 21 22 17.7
目镜放大倍数：10 物镜放大倍数：100
表3 酿酒酵母大小测定记录（单位:目镜测微尺格数）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均
直径 4 5 4 3 4 4 5 5 6 3 4.3
目镜放大倍数：10 物镜放大倍数：40
注：酿酒酵母用直径（宽度）表示细胞大小，枯草芽孢柑橘用宽度×长度表示细胞大小
2.1.2 显微计数法测量酿酒酵母菌体数量（见表5）
注：A表示5个中方格中总菌数，B表示菌液稀释倍数
1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B
2.2结果分析
本实验使用的是等分有100小格的精确等分刻度尺，因此10倍、40倍和100倍的目镜测微尺每格所代表的长度分别为5.172、1.266和0.500微米，其长度大约为50个小格的刻度尺长度的一半。
由表4中各菌测定结果可知，枯草芽孢杆菌的长宽比大约为9:1，与显微镜下观察结果较相符，显微镜下枯草芽孢杆菌明显呈细长状，且有些枯草芽孢杆菌连在一起会阻碍观察和测定；酿酒酵母在显微镜下大多呈圆形和椭圆形，因此为了测量方便便记录圆形酵母菌的大小，其大小接近5.5um，比枯草芽孢杆菌稍小。
在测量中，因为活菌的游动、以及测微尺的准确度等等给测量带来了一些困难也造成了一定误差。
在血细胞计数板测量微生物数量的实验中，酵母菌发酵液浓度的稀释显得非常重要。
如果稀释后浓度过大，则会导致计数室中菌体太过稠密，每一格中菌体数量过多造成无法测量。
因此酵母菌发酵液要稀释大约二十倍左右才能保证菌液分布的平均，并且要保证摇晃的时间够长，才能保证计数的方便和准确。
因此本实验中我们将酵母菌发酵液稀释到十七倍，在每一中格中约能找到9~13个酿酒酵母菌。
3小结
本次实验中，我们学习了如何使用显微测微尺测量细胞大小和使用血细胞平板计数法测量微生物的数量，基本上掌握了其原理与操作，对微生物形态特征的测定有了一定的了解和
掌握，对细菌和真菌形态与大小的对比有了一定的认识，使我们收获很多。
在进行微生物形态和数量的测量时要看清实验要求和具体情况，使用正确的方法和选择。
比如，酵母菌大小测量时菌体的选取以及计数时中室的选取。
进行计数时，可能要用镊子稍微压一下盖玻片以赶出气包，减小误差。
参考文献
[1] 沈萍，陈向东《微生物学实验》（第4版）高等教育出版社 2007年11月第4版
[2] 沈萍，陈向东《微生物学》（第2版）高等教育出版社 2006年5月第2版。
