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荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1） 扩增曲线 ：
（2） 荧光阈值：
（3） Ct值： （4） 标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。计算好所有引物和SYBgreen的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物 0.25μL
下游引物 0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。上机。
pcr检测实验报告
PCR检测实验报告
引言：
PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，通过扩增目标DNA片段，使其数量增加到可以被检测的水平。本实验旨在利用PCR技术对特定基因进行检测，并分析其在不同样本中的表达情况。
实验方法：
1. 样本收集：从不同来源的细胞或组织中提取DNA。本实验选择了人体血液样本，采用血液抽取器获取血液样本。
2. DNA提取：使用商业DNA提取试剂盒，按照说明书的步骤进行DNA提取。通过离心和洗涤等步骤，获得高质量的DNA样本。
3. PCR反应体系准备：根据实验需要，制备PCR反应液。反应液中包含DNA模板、引物、酶和缓冲液等成分。确保反应体系中各组分的浓度和比例正确。
4. PCR扩增：将PCR反应体系加入PCR仪器中，按照设定的温度和时间程序进行扩增。PCR反应过程包括变性、退火和延伸等阶段，使目标DNA片段得到扩增。
5. PCR产物检测：将PCR产物进行凝胶电泳分析。将PCR产物与DNA分子量标准品一同加载到琼脂糖凝胶上，通过电泳分离，观察PCR产物的大小和带电性。使用紫外线照射，观察凝胶上的DNA条带。
实验结果：
通过PCR反应和凝胶电泳分析，我们成功扩增了目标基因的DNA片段，并观察到了相应的DNA条带。根据凝胶上的条带大小，我们可以初步判断目标基因在不同样本中的表达情况。
讨论：
PCR技术在分子生物学研究中具有广泛的应用前景。通过PCR扩增，可以快速、高效地获取目标基因的大量DNA片段，为后续的测序、克隆和表达研究提供了基础。本实验中，我们选择了血液样本作为PCR反应的起始材料，这是因为血液中含有丰富的DNA，且采集较为方便。然而，不同样本的DNA提取过程会存在一定的差异，可能会对PCR反应的结果产生影响。因此，在实际应用中，需要根据具体样本的特点和实验目的，进行合适的DNA提取方法选择和优化。
此外，在PCR反应中，引物的选择也是至关重要的。引物的设计应考虑目标基因的特异性，避免与其他非目标基因发生扩增。同时，引物的浓度和比例也需要进行优化，以确保PCR反应的特异性和效率。在本实验中，我们使用了商业引物，其特异性和效果已经经过验证。然而，在实际研究中，对于特定基因的检测，可能需要自行设计和合成引物，以满足实验需求。
pcr技术在病原生物鉴定中的应用实验报告
PCR技术，在分子生物学研究和临床医学中有着广泛的应用。PCR通过利用酶在体外合成一条特定DNA序列，从而扩增目标DNA。PCR技术在病原生物鉴定中特别有用，因为许多病原体的数量太少，不易被传统培养方法检测出来。本实验报告将描述PCR技术在病原生物鉴定中的应用。
材料和方法
材料：
1.病原菌：分别收集大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体和结核分枝杆菌的菌株。
2. PCR试剂盒：包括PCR模板DNA（菌落），PCR反应缓冲液，聚合酶，dNTPs（脱氧核酸三磷酸），MgCl2，PCR引物，溶剂等。
3. 电泳仪：含有10％（w/v）聚丙烯酰胺和TBE缓冲液的平板，以及Agarose凝胶，乙溴化物（EB）等。
方法：
1.从培养基上挑出适当的菌落，用管涂器转移到已添加生理盐水的96孔板中。标记菌株。抖动并在37℃下催化24小时。
2.收集菌株，将其离心，将细胞沉淀加入200μl 的 Tris-EDTA （TE）缓冲液，用超声波压碎。使菌株的DNA完全释放，可用乙醇沉淀法纯化DNA。
3.设置PCR反应环境：将PCR反应管中加入20μl PCR反应缓冲液，2μl PCR模板DNA，1μl MgCl2溶液，0.5μl聚合酶（Taq酶），0.5μl PCR 引物，4μl dNTPs，72μl 的水。混合物在PCR热循环器中按照以下条件扩增目标DNA：先以95℃处理2分钟进行热变性，其次以94℃56秒脱氧，然后以50℃45秒回收，之后以72℃1.5分钟延长扩增。
4.扩增完成后，取出反应体积2μl用于电泳分析，将其与DNA分子量标准品一起电泳于聚丙烯酰胺凝胶上，之后通过紫外线扫描进行可视化。
结果
PCR为常用的病原体鉴定方法，以下是病原菌的PCRF结果。
荧光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996
年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
原理
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
荧光定量PCR 实验步骤：
样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
