细胞复苏的步骤
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细胞复苏
细胞复苏实验操作流程
主要器材：酒精灯、镊子、记号笔、废液缸、封口膜。
主要试剂：PBS、干细胞基础培养基、75%酒精、双抗、胎牛血清。
培养基配制：干细胞基础培养基，添加10%胎牛血清和1%双抗。
细胞复苏操作步骤：
1.佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出冻存管。
2.迅速放入37℃水浴中，用镊子夹住冻存管，并不时摇动，在1分钟内使其90%融化，然后在无菌下吸取出细胞到9ml的干细胞完全培养基中重悬，用干细胞完全培养基冲洗冻存管2-3次。
3.在1200r/min速度下离心3分钟，弃去上层液，加入适量培养液后进行计数，全量接种于T75培养瓶中，置37℃温箱静置培养，次日全量更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。
细胞复苏的注意事项：
1.细胞复苏时要注意融化冻存细胞的应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。
2.冻存液对细胞有毒性，解冻后必须用洗掉冻存液才能移入培养瓶中培养。
3.从液氮拿出来，以最快速度丢入37度水浴，等细胞液刚刚化完取出，加培养液稀释。
4.刚复苏的细胞还是少折腾它好，细胞37°快速解冻后直接放入预热的培养基。
5.复苏必须尽快除去DMSO。
要记得速溶！
6.取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。
细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
细胞复苏的操作方法有
细胞复苏的操作方法有
细胞复苏是一种实验室技术，用于使脱水、冷冻或干燥的生物样本重新恢复到活动状态。
以下是常用的细胞复苏操作方法：
1. 退火复苏法：将冷冻或干燥的细胞样本迅速放入含有保护性溶液或培养基的温暖环境中，使样本迅速恢复到正常温度。
这样可以防止细胞膜的破裂和细胞器的失活。
2. 液相复苏法：将冷冻样本悬浮在适当的培养基中，并在适当的温度和营养条件下培养恢复。
这种方法适用于以液体形式保存的细胞样本。
3. 干燥复苏法：将干燥的样本暴露在湿润的环境中，使其重新吸湿，并注入适当的培养基中进行培养。
这种方法适用于以干燥形式保存的细胞样本。
4. 渐进复苏法：渐进地增加冷冻样本的温度或湿度，以避免温度和压力的突变对细胞造成伤害。
这种方法适用于非常敏感的细胞。
5. 化学复苏法：使用化学物质或添加剂来促进细胞复苏，如聚乙二醇（PEG）或DMSO等。
这些化学物质可以提供保护性的作用，促进细胞膜的再生和细胞器的活性恢复。
需要注意的是，细胞复苏的操作方法可能因细胞类型、保存条件和实验目的等因
素而有所不同。
在进行细胞复苏实验前，建议查阅相关文献，了解适合您实验条件的最佳方法。
否则，可以咨询专业的实验室人员或领域专家，以获得更准确的指导和建议。
细胞复苏的步骤
细胞复苏的步骤细胞复苏是指将处于休眠或低代谢状态的细胞恢复为正常的生长状态，通常是通过给细胞提供合适的营养和环境条件来实现的。
下面介绍细胞复苏的基本步骤：第一步：选择适当的培养基和条件在进行细胞复苏之前，需要选择适当的培养基和条件。
常用的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，具体选择根据细胞种类而定。
在培养基中加入合适的血清、生长因子和抗生素等可以提高细胞复苏的成功率。
在培养条件方面，温度、湿度、CO2浓度等都需要根据不同的细胞进行调整。
一般情况下，细胞需要在37℃、5% CO2、95%湿度的环境下培养。
第二步：解冻和种植细胞将冻存的细胞取出后，迅速将管子放入37℃的水浴中，使细胞迅速解冻。
解冻后将细胞转移到预先准备好的培养基中，轻轻摇动管子使细胞均匀分散在培养基中。
第三步：细胞的适应期细胞解冻后需要一个适应期来逐渐适应培养条件。
在这个阶段，应该尽可能地减少不必要的干扰，避免频繁移动细胞和更换培养基等操作。
适应期的时间根据细胞的不同而有所不同，一般为1-3天。
第四步：细胞的培养和传代适应期结束后，可以开始正式地进行细胞培养和传代。
细胞在培养基中生长分裂，达到一定程度后可以进行传代。
传代过程中需要观察细胞的生长情况，及时更换新的培养基，以保持细胞的生长状态。
第五步：检测细胞是否恢复正常经过一段时间的培养，需要检验细胞是否已经恢复正常的生长状态。
常用的方法包括细胞计数、免疫荧光检测、PCR 等。
如果细胞已经恢复正常，则可以进一步进行细胞实验或研究。
总结细胞复苏是细胞培养中的一项基本技术，需要选择合适的培养基和条件来实现。
在实际操作中，需要注意解冻的速度和方法、适应期的时间、细胞的培养和传代等细节问题。
熟练掌握细胞复苏技术，对于细胞培养和相关研究具有重要的意义。
细胞复苏的原理和方法
细胞复苏的原理和方法细胞复苏的原理是将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，使细胞恢复生长的过程。
细胞复苏的原理是当细胞从冷冻状态恢复到常温状态时，细胞的形态结构保持正常，生化反应即可恢复。
与细胞冻存不同，细胞复苏过程升温要快，原则是慢冻快融，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。
细胞复苏的方法如下：1. 将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化。
在融化的过程中，要注意用镊子夹住冷冻管并在水浴中不时晃动，使细胞受热均匀且速度越快越好，这样可以最大限度的保存细胞活力，并防止水浴锅的水进入细胞冻存管造成细胞污染。
细胞融化后要尽快（约1min）移出37℃水浴。
如果37℃水浴时间延长，会提高细胞死亡率。
2. 完全融化后，用75%酒精擦拭冷冻管外杀菌后，打开盖子，取出冻存管的细胞悬液，缓慢加入到有培养液的T25或者是T75的培养瓶中，37℃、5%CO2培养。
如果细胞需要去除冷冻保护剂，用移液枪将细胞悬液注入15mL无菌离心管中，再加5ml完全培养基，根据细胞类型选择合适的离心速度，低速离心5min，弃去上清，加入2-3mL预热的完全培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全重悬。
3. 用培养液适当稀释后，将重悬的细胞接种到培养皿或者T25或者是T75的培养瓶中，37℃、5%CO2培养。
24h后，更换新鲜培养基，去除死细胞。
三天可进行一次换液。
当细胞长到有80-90%汇合时进行传代。
此外，还有一些注意事项：1. 取冻存细胞时应做好防护措施，戴好防冻手套、护目镜。
如果冻存管密封不严，液氮可被吸入。
由于解冻时冻存管中的气温急剧上升，将可能发生爆炸。
2. 打开细胞冻存管之前要用酒精棉球将冻存管消毒并晾干。
注意无菌操作，细胞复苏后的操作在4℃冰盒中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。
3. 解冻时间在2min以内完成，且整个过程尽量避免吹打细胞产生气泡，导致细胞复苏后的生长状态不佳。
4. 复苏细胞的时候尽量避免冻存管接缝处沾水，防止支原体污染。
简述细胞复苏流程与注意事项
简述细胞复苏流程与注意事项
细胞复苏流程：
1、将冻存的细胞从液氮罐中取出，立即放入37°C的水浴中进行融化，轻柔晃动，加速融化，直到小瓶中只剩下一小块冰，时长应控制在1min 中；
2、用70%乙醇擦拭瓶外后转移无菌操作台中，打开瓶盖前，用酒精灯火焰对瓶口进行消毒；
3、将预加热的新鲜完全培养基滴入小瓶中。
缓慢用移液枪吸取瓶中液体至15ml离心管中，加入适量浓度和体积的完全培养基，轻柔混合均匀；
4、200 ×g左右细胞悬浮液离心5-10分钟。
实际的离心速度和持续时间因细胞类型而异。
弃掉上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞，并将其转移到适当的培养容器和推荐的培养环境中。
注意事项：
1、液氮温度低，小心低温对人造成的伤害，在液相中储存的冷冻瓶在解冻时存在爆炸的风险，因此，取出冻存管的时候，要做好个人防护。
2、通常细胞集中储藏在液氮中，取出时应迅速，避免温差对其他冻存
细胞造成影响。
3、复苏细胞的核心技术，简而言之就是快融，将在37°C水浴中快速解冻冷冻细胞(< 1分钟。
4、解冻时，冻存管先放入无菌一次性PE手套中，再放入水中融化，避免污染也方便操作。
5、用预热过的培养基慢慢稀释解冻的细胞。
6、解冻细胞后，在培养皿中培养时，应尽量维持高密度，以提高细胞存活率。
7、注意无菌操作，避免细胞发生污染。
细胞复苏
细胞复苏步骤（以215为例）
1、从液氮罐中取出一支215细胞冻存管，放到37℃迅速溶解；
2、取一支50ml离心管，往其中加入适量的215细胞培养基（约30ml），将溶解的细胞加
到培养基中混匀；
3、离心800rmp，5min；
4、弃上清，打散细胞，再加入215培养基重悬细胞（约12ml），轻轻混匀后转移到培养瓶
中培养（注意不要产生气泡）；
5、镜下观察细胞状态，放入孵箱中培养，第二天换液。
（以后以1:3的比例传代）
PBMC的复苏
实验前准备的东西：水浴锅调到37℃，冰水、离心管架置入超净台紫外线照射半小时；R20、R10。
1、从液氮罐中取出一支215细胞冻存管，放到37℃迅速溶解；
2、取一支50ml离心管，将复苏细胞转移到50ml离心管中，边加入R20边摇，由慢到快，
开始一滴一滴地加，加到大约3ml可加快速度至每次0.5ml，R20加到7.5ml后开始加R10 7.5ml；
3、离心1800rmp，5min；
4、弃上清，打散细胞，加入1640培养基重悬。
细胞冻存
1、培养好的细胞用胰酶消化，再用培养基终止消化并重悬细胞，将细胞转移至15mL离心
管中离心，1000rpm，5min；
2、弃上清，加冻存液，用吸管轻轻吹打均匀，在分装到冻存管中，每管1mL，做好标记。
冻存液的配制：FBS（胎牛血清）：DMSO=9:1，一般75c㎡培养瓶长满有12×10^6个细胞，25 c㎡培养瓶长满有4×10^6个细胞，冻存最适细胞密度为5-8×10^6个/mL；
3、将冻存管置入4℃30min—﹣20℃40min—﹣80℃过夜—最后移到液氮罐长期保存。
细胞复苏及培养实验方法
细胞复苏及培养实验方法
一、准备细胞复苏所需物品
1.离心管
2.细胞计数板
3.移液管
4.细胞培养瓶
5.细胞冻存管
6.液氮
7.37℃水浴
8.培养基
9.血清
10.抗生素
二、细胞复苏步骤
1.从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中快速复苏。
2.待细胞冻存管外表面融化后，打开管盖，用移液管吸出细胞悬液，放入离心管中。
3.将离心管中的细胞悬液以适当的转速和时间离心，去除上清液。
4.离心后，用含有一定比例血清和抗生素的培养基重悬细胞，制成细胞悬液。
5.将细胞悬液均匀分装到细胞培养瓶中，放入培养箱中进行培养。
三、细胞培养步骤
1.将细胞培养瓶放入培养箱中进行培养，保持适宜的温度和湿度。
2.根据需要更换培养基，保持细胞生长所需的营养和生长因子。
3.根据细胞的生长情况，适时进行传代培养，保持细胞的生长活力和数量。
4.在培养过程中进行必要的细胞鉴定和表型检测，确保细胞质量和实验结果
的可靠性。
5.记录细胞的生长情况、传代次数和鉴定结果等信息，建立完整的细胞系档案。
注意事项：
1.在操作过程中要保持无菌操作，避免污染。
2.根据不同的细胞类型和实验需求，选择适宜的培养基、血清和生长因子。
3.定期检查细胞的形态、生长情况和传代情况，及时发现异常并进行处理。
细胞复苏及冻存的实验步骤及注意事项
细胞复苏及冻存的实验步骤及注意事项《细胞复苏及冻存：一场细胞的“冰与火之歌”》在生物实验室这个奇妙的小世界里，细胞的复苏和冻存就像是操纵细胞命运的魔法步骤。
今天呀，我就来给大家唠唠这细胞复苏及冻存的那些事儿，这里面的门道可多着呢，就像走钢丝，容不得半点马虎。
一、细胞复苏的实验步骤和趣事儿步骤一：前期准备像打仗前的粮草筹备在细胞复苏之前，得把“战场”布置好。
先把超净台用酒精仔仔细细地擦个遍，就像给它做个全面的SPA，确保里面一尘不染。
接着，打开水浴锅，把水温调到37℃，这温度可不能出差错，多一度细胞可能就像洗热水澡被烫着了，少一度就像是在冷水里打哆嗦，都不利于细胞恢复生机。
准备好相应的培养液，这就像是细胞的“营养套餐”，没它细胞可活不下去。
步骤二：复苏过程像是拯救冻僵的小生命从液氮罐里拿出冻存管的时候，感觉就像是从冰天雪地的极寒之地营救小生命。
那冻存管冻得直冰手，得迅速放到37℃的水浴锅里快速解冻，要不停地轻轻晃动，就像是在鼓励细胞：“小宝贝们，快快醒来啊！”这时候心里默默祈祷着，可别出啥岔子。
在小细胞们还迷糊着的时候，把它们转移到含有培养液的离心管里，离心的过程又像一场小小的筛选，把那些还没适应过来的杂质去除，留下顽强的细胞。
最后把细胞接种到培养瓶里，就像给它们安家落户啦，盼着它们在新家里茁壮成长。
二、细胞冻存的实验步骤和其中的小纠结步骤一：选择冻存液就像挑选合适的保护铠甲冻存液的配置可是个技术活。
一般是包括培养液、血清和保护剂（像是二甲基亚砜这类的神奇物质）。
血清就像保护层里的柔软衬里，给细胞温暖的呵护，而保护剂则像坚韧的外壳，防止细胞在冷冻过程中被冰晶刺破。
这三者的比例得拿捏得死死的，就像厨师做菜时放盐的量，多一点少一点都不行。
步骤二：缓缓降温像是送细胞进入冬眠把细胞放到冻存管里，标记好细胞类型、日期等信息，这就好比给细胞上户口，省得以后找不到“人”。
然后要进行程序降温。
想象细胞此时就像个准备冬眠的小动物，得一步步慢慢适应越来越冷的环境。
细胞复苏的步骤
主要器材：一次性滴管、打火机、酒精灯、大镊子、中镊子、记
号笔、废液缸、封口膜、剪子。
主要试剂： PBS、培养液、消化酶（胰酶）、75%酒精、双抗。
PBS配制：NaCL :4g KCL:0.1g Na2HPO4 :1.745g KH2PO4 :0.1g 三蒸水：500mL，
溶解后高压灭菌。
培养基配制：5mL双抗、50mL血清，加入培养基
中。
细胞复苏步骤：
1、水浴锅打开，调到35.8°C～37°C。
2、打开超净台，放入主要用具，开紫外灭菌30min。
（主
要器具包含：镊子、离心管、酒精灯、封口膜、一次性滴管、培
养瓶、废液缸。
）
3、将培养液带入细胞间，瓶上喷酒精，放入超净台，过火，
撕封口膜，过火灭菌。
4、用滴管取3ml培养液放入离心管中。
5、从液氮中取出螺口瓶，放入之前开好的水浴锅中迅速融
化。
6、快速去细胞间，喷洒酒精灭菌，开盖，将细胞吸出放入
离心管中，1000转离心5min。
7、培养瓶中加入5ml培养液，过火灭菌。
8、取出离心管，倒掉培养液，用滴管取1ml培养液冲洗离
心好的细胞，移到培养瓶中，轻轻摇匀，显微镜下观察。
喷酒精灭菌，放入孵育箱中。
整理超净台。
细胞复苏的基本过程
细胞复苏的基本过程细胞复苏是指细胞从一种受损或休眠状态恢复到正常活动状态的过程。
它是生物体内细胞维持正常生理功能的重要环节，也是一种自我修复的机制。
细胞复苏的基本过程主要包括活化、增殖和再生三个阶段。
一、活化阶段活化是指细胞从休眠状态被唤醒并开始恢复活动的阶段。
在细胞受到刺激或损伤后，一系列的信号转导和分子调节会引发细胞内外的反应，从而激活休眠的细胞。
这些反应包括：1. 信号传导：刺激物质通过受体与细胞膜结合，触发细胞内信号传导途径，如蛋白激酶级联反应、细胞内钙离子浓度增加等，从而传递活化信号。
2. 基因表达：活化信号会调控细胞内的基因表达，启动休眠状态下被抑制的基因，促进相关蛋白的合成，为细胞的复苏提供必要的物质基础。
3. 细胞内修复：细胞会启动自我修复机制，包括细胞内蛋白降解系统的激活、损伤DNA的修复、细胞骨架的重组等，以恢复受损的细胞结构和功能。
二、增殖阶段增殖是指细胞在活化后开始进行分裂和增殖的阶段。
在这个阶段，细胞会通过细胞周期调控、DNA复制和有丝分裂等过程，逐渐增加细胞数量，以补充受损细胞的丧失。
增殖阶段的关键步骤包括：1. 细胞周期：细胞周期是指细胞从一个分裂开始到下一个分裂开始的整个过程。
在增殖阶段，细胞会经历G1期、S期、G2期和M 期等不同的周期阶段，以完成DNA复制和有丝分裂。
2. DNA复制：在S期，细胞会复制其所有的DNA分子，以便在细胞分裂时每个新生细胞都能获得完整的基因组。
3. 有丝分裂：在M期，细胞会进行有丝分裂，将复制好的DNA等分给两个新生细胞。
有丝分裂包括纺锤体形成、染色体分离和细胞质分裂等步骤。
三、再生阶段再生是指细胞在增殖后，进一步恢复和重建受损的组织或器官的过程。
在再生阶段，增殖的细胞会定向分化并组织起来，以形成新的细胞结构和功能。
再生阶段的关键步骤包括：1. 细胞定向分化：增殖的细胞会根据其位置和周围环境的信号，定向分化为特定类型的细胞，如肌肉细胞、神经细胞等，从而组织起来形成新的组织结构。
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细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。
细胞的原代培养和传代培养以及细胞冻存和复苏后都需要细胞计数。
一、细胞冷冻保存
1、材料：
生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO (Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)
2、冷冻保存方法：
(1)传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。
-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。
适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
3、步骤：
(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。
(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜 (DMSO)至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。
(3)离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
(4)取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5～10%)，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～
2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。
然后进行冻存。
4、注意事项：
(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90%致密度。
冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。
(3)注意冷冻保护剂之品质。
DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。
Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。
在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。
缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。
DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。
(4)冷冻保存之细胞浓度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
③adherent tumor lines:5～7×106，依细胞种类而异。
Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa
只需1～3×106cells/ml
④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。
(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
(6)冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时)，复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。
二、冷冻细胞活化
1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3、材料
37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器
4、步骤：
(1)操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
(3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
(4)取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
(5)取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。
取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。
(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。
惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。
(7)若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。
三、细胞计数与存活测试
1、原理：
(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。
(2)血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。
当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×
0.1mm=1.0x10-4ml。
使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。
(3)存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。
一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。
计算细胞活率：活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。
计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。
2、材料：
0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin
bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于
100mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍
倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。
白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。
3、步骤：
(1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。
(3)计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。
若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml;每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。
高浓度细胞悬液，可取出部分
作稀释或连续稀释后计数。
5、范例：
T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格：55，62，49，59;死细胞数/方格：5，3，4，6;细胞总数=243
平均细胞数/方格=60.75;稀释倍数=2;
细胞数/ml：60.75×104×2(稀释倍数)=1.22×106;
细胞数/flask(10ml)：1.22×106×10ml=12.2×106
存活率：225/243﹦92.6%
在细胞复苏过程中经历多次复苏失败，最终在查阅了相关技术积累了足够的复苏技能后复苏成功，上述是个人总结的细胞冻存复苏及细胞计数的操作程序和注意事项，望能为各位同学提供些参考。
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