微生物限度及无菌检查

中国药典2020微生物限度检查
中国药典2020中对微生物限度的检查要求如下：
1.总菌落数限度：需满足以下要求：
- 不应含有大肠埃希菌或粪链球菌。

- 对无菌制品，其总菌落数规定不应超过制定的标准。

- 必须符合产品特性和验证的任何特定需求。

2.酵母和霉菌限度规定：
- 对无菌制品，每克中不应含有可繁殖的酵母和霉菌。

- 对非无菌制品，每克中不应含有可繁殖的酵母和霉菌。

建议
进行采样和检测多数生物制品样品。

3.大肠菌群限度规定：
- 每克中不应含有大肠菌群。

对某些产品（如消毒剂指定的测定），可以采用其他方法或者规定了合适分析方法的产品例外。

4.针对特定微生物的检查：
- 对某些产品，药典可能要求进行特定微生物的检查，以确保
产品的安全性和质量。

需要注意的是，这只是中国药典2020中关于微生物限度检查
的一般要求，具体的规定可能因产品类型和特性而有所不同。

因此，在进行微生物检查时，需根据产品的特定需求和合适的分析方法进行操作。

在实际生产和质量控制过程中，还需严格按照相关法规和标准进行操作，确保产品质量和安全性。

无菌室、阳性对照室、微生物限度室区别无菌检查、微生物限度检查的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，操作环境的无菌保证程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可靠性，对洁净室（区）的环境质量采取合理的控制措施和评价方法是必要的。

无菌检查、微生物限度检查应在环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。

面积一般不超过10平方米，不小于5平方米；高度不超过2.4m。

由1~2 个缓冲间、操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间与缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。

在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物；无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。

墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。

操作间内不应安装下水道。

无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制18~26℃，相对湿度45%~65%。

缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的静压差大于10Pa。

无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300lx。

缓冲间和操作间所设置的紫外线杀菌灯（2~2.5W/平方米），应定期检查辐射强度，要求在操作面上达40/μW/平方厘米，不符合要求的紫外杀菌灯应及时更换。

无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭或2%甲酚液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，开启无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。

无菌检测和微生物限度常见问题1、问:做无菌验证时阳性对照菌是怎么加入的？可以在加完培养基后用无菌的注射器把菌液注入吗？答:严格的说是要在最后一遍冲洗液中加入阳性对照菌的,这主要是考量滤膜对于阳性菌的截留性～但是滤器如果可以提供滤膜对于阳性菌的充分截留的话在最后的培养体系中加入阳性菌也是未尝不可的.如果供试品没有抑菌作用,可以在加完培养基后用无菌的注射器把菌液注入,摇匀如果供试品有抑菌作用,正如安哥洛卡所讲,在最后一次冲洗液中加入阳性对照菌,摇匀,抽虑,加培养基.无菌检查，加入阳性的方法可以有许多种，可以根据个人的习惯。

只是注意：1、避免人为污染。

2、阳性菌加入数量2、问:离心沉淀法的原理、操作和注意事项是什么?答:原理:利用沉降系数的差异将供试品和微生物进行分离;操作:取规定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量.注意事项:真菌由于沉降系数比较小,500r/min离心5min，黑曲霉、白色念珠菌回收率为20%,因此其检查不适宜用低速离心沉淀法.3、问:稳定性实验的微生物及无菌检查,是否每次都要做?答:是;原因:一实验期内可能会染菌;二灭菌后微生物并不是就彻底"死亡",有些成为碎片,这些碎片在一定的条件和时间下,可以自我修复而复活.三稳定性的考察，也应包括药品有效期的考察，在此期间所有的项目都应是合格的，无菌也是其中之一，如果在有效期内无菌不合格，也可以说明该药品存在一定的缺陷，至少，有效期有问题。

4、问:眼部给药制剂如何做卫生学检验?答:液体制剂:无菌检查;半固体及固体制剂:微生物限度检查5、问:滴眼液的微生物限度为何进行无菌检查?答:一滴眼剂产品系按照无菌工艺生产且终产品为灭菌产品,故其成品的微生物质量应要求统一为无菌;所以,滴眼剂产品的临床合理用药应与其卫生标准要求一致,即将其微生物质量要求统一为无菌,显然更为合理;二滴眼剂的微生物质量要求为无菌,是与各国药典在滴眼剂要求上的统一,及对《中国药典》此项规定合理性的补充及完善等方面看,滴眼剂成品的微生物质量要求统一为无菌具有必要性。

微生物限度-无菌-内毒素区别与联系微生物检测基本就这3项了。

微生物限度：用营养琼脂、玫瑰红钠培养。

洁净度中等操作台内进行（B级)无菌：硫乙醇酸盐、改良马丁在无菌套筒里操作并培养。

洁净度要求较高(A级）内毒素：鲎试剂稀释不同浓度来判定。

洁净度要求不高，D级情况下即可。

我的理解微生物泛指细菌和霉菌酵母菌等等、应该是包罗万象，各种杂菌都有无菌则也是各种杂菌与微生物限度检测的微生物有什么区别？内毒素是一种热源，服用没什么关系，在注射后容易导致人体发热。

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。

脂多糖对宿主是有毒性的。

内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。

耐高温比如说注射液产品用气接触产品，他应该用滤器过滤其他吧。

用膜直径改用0.45（过滤）的好还是0.22（除菌）的好？滤膜泡点肯定要做的，高风险产品应该要最少2层滤膜吧。

用了这滤膜可以不用检这3项还是要检其中项目？而且有的企业只是一年验证一下，不对气体日常可行吗？求大神详解3者的联系与区别，各什么时候需要检这3项及为什么。

答：微生物限度针对非无菌产品无菌和内毒素针对无菌产品。

微生物限度，无菌检验，内毒素检验均为供试品安全性检测。

主要区别是微生物限度，无菌检验是检验活的微生物方法，内毒素检验可以检验死去的微生物中内毒素含量。

什么时候选用不同的检验方法，主要参见药典要求，例如口服制剂选择微生物限度，注射剂和眼用制剂选择无菌检验，注射剂也需要做内毒素检验。

选择不同实验方法主要依据是供试品生物风险级别和供试品用途。

例如纯化水检验中不需做内毒素实验，注射用水检验中不需做无菌实验。

依据是纯化水主要用途为清洗，注射用水用途是配液，所以注射用水的微生物风险更高，需要做内毒素实验，控制风险。

微生物限度和无菌实验用具要求无菌，内毒素实验用具要求去除内毒素。

检验环境要求现行药典微生物限度和无菌实验均是C级下局部A级，微生物限度在超净工作台，无菌实验在生物安全柜内操作。

微生物限度检测：（1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）一般有三种方法：平皿法、薄膜法、MPN法。

样品计数方法的验证：1 培养基适用性的检查TSA :培养的是需氧菌总数，包括真菌。

需要用的金黄色葡萄球菌，（革兰氏阳性菌）铜绿假单胞菌，（革兰氏阴性菌）枯草芽孢杆菌，（细菌中芽孢的代表）白色念珠菌，（酵母菌的代表）黑曲霉。

（霉菌的代表）SDA 霉菌和酵母的总数白色念珠菌，(酵母的代表)黑曲霉。

（霉菌的代表）怎么做呢？在TSA 验证时，每一株菌有4个平皿，试验组2个，对照组2个。

对照组用的是中检院的TSA对照组培养基。

每个皿中接不大于100CFU/ml 的菌。

然后：1摇匀 2 凝固 3 倒置（细菌是单细胞的生物正置会有水滴下来，菌落会蔓延）细菌培养 30-35度培养3d 需要做5种菌（金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌，黑曲霉）真菌培养20-25度培养5d （培养的温度是由培养基的种类决定的，培养的时间是由微生物的种类决定的。

需要做2种菌。

结果：结论被检培养基上菌落的平均数与对照培养基上菌落的平均数的比值在0.5-2范围内合格。

2计数方法的适用性(有抑菌性，导致微生物数减少)微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

Ppc 原理A组供试液（试验组）（供试液加菌液100CFU）2种方法：供试液+（每ml不超过100CFU的菌）平皿法+（每张膜中加入100CFU的菌）薄膜法B 组供试液组对照组供试液（以稀释液代替菌液组操作）C组菌液组菌液每ml 不超过100CFU的菌取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌进行微生物的回收。

(A-B)/C的比值在0.5-2之间。

日常检测检验量：一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）一般为10g或10ml (随机抽取不少于2个最新包装，从两个包装中取)回收率；（修正系数）（用于医疗器械上的微生物的测量，或者是固体需要做的，因为洗脱不完全）第一种：薄膜过滤法（微生物较多的情况，产品直接洗脱法）无菌一、培养基适用性检查 (无菌性和灵敏度)目的:确认培养基的有效性。

2024年版《中国药典》附录对无菌检查和微生物限度检查方法进行了修订和增加。

以下是关于这一主题的详细内容：
无菌检查方法增修定内容：
1.增加了无菌药剂的质量标准，包括药品无菌指标、瓶口、塞口、包装的无菌性检查项等。

2.添加了无菌药物瓶内环境的无菌性检查，包括对封口口径、管壶内外的无菌环境进行验证等。

3.对无菌药剂进行质量控制的方法进行了详细说明，包括无菌药剂质量控制中的负压系统及其验证、不同类型的无菌药剂的质量控制措施等。

4.新增了一些无菌技术和设备的要求，如微生物孵育器使用要求、灭菌器使用要求等，以保证无菌检查的准确性和可靠性。

5.对于不同类型的无菌药剂，如注射剂、眼用药、口服药剂等，增加了不同的无菌检查方法，以确保药品的无菌性。

微生物限度检查方法增修定内容：
1.添加了微生物限度试验中的菌落计数法、薄膜法、糖蜜膏孵化法等方法详细操作步骤和评价标准。

2.对于微生物限度试验中的微生物生长培养基、培养条件等进行了规定，确保在适当的环境中进行试验。

3.说明了微生物限度试验中的不同尺寸、不同生物指标等的不同试验方法，以适应不同药物的检验需求。

4.对于微生物限度试验中存在的一些可能出现的问题和异常结果进行了评价和处理措施的说明，以保证试验结果的准确性和可靠性。

5.增加了微生物限度试验的资料归档和报告的要求，确保试验结果的准确可靠性和追溯性。

通过对无菌检查和微生物限度检查方法进行修订和增加，2024年版《中国药典》附录进一步提高了无菌药剂和微生物限度的质量控制水平，确保了药品的安全和有效性。

这些修订和增加内容使无菌检查和微生物限度检查方法更加完善和规范化，为药品生产和质量控制提供了更科学、更可靠的依据。

无菌检查和微生物限度检查操作规范（中国药品生物制品检定所）一、无菌室的要求：无菌室是无菌检查、微生物限度检查的重要设备，面积不小于6平米，高度2.4-2.8m为宜。

建筑材料要光洁，不吸潮，无凸起，耐腐蚀，易清洗。

无菌室内部应六面光滑，无缝隙，里面连接处应呈凹凸形，不留死角。

操作间和缓冲间的门不应直对，缓冲间两个。

无菌室内采光面积要大，照明灯应镶嵌在天花板内，光照应分布均匀，光照度不低于300lux，电源开关应设在室外。

无菌室、缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯，每立方米2-2.5瓦，距实验台高度不超过1米，并应定期检查辐射强度，距1米处应不低于70微瓦/平方厘米，无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及调温装置，控制温度18-26℃，相对湿度40%-60%，操作间或净化工作台的洁净空气应保持与相临环境形成正压，不低于4.9帕。

操作区洁净度100级，操作间洁净度10000级，洁净度定期检查。

无菌室及缓冲间不得存放其他杂物，如培养箱。

用消毒液清洁无菌室操作台面，开启无菌室紫外灯和层流空气过滤30分钟以上。

无菌室的无菌程度，常用的沉降菌测定方法为：取营养肉汤琼脂平板3个，置无菌室的操作区台面左、中、右位置上，开盖暴露30分钟，在30-35℃培养2天后，计算菌落数。

用于无菌检查的无菌室或微生物限度检查的无菌室，细菌总数应小于3个，浮游菌每立方米应小于5个，否则，不能用于无菌检查和微生物限度检查。

二、培养基的准备1、培养基的制备：配制培养基的蒸馏水或去离子水应符合规定。

再称取需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基的干燥培养基，加水溶化后，调节PH值，使灭菌后需气菌、厌气菌培养基的PH值为7.0-7.3，真菌培养基的PH值为6.2-6.6，分装、盖塞、灭菌，待用。

2、培养基灵敏度试验：培养基是无菌试验的基准物质，关系到无菌试验结果的科学、准确、可信度，因此，培养基灵敏度试验是无菌试验的重要组成部分。

只有使用灵敏度试验合格的培养基，才能保证无菌试验结果准确、可靠。

无菌检查和微生物限度检查阳性菌种的管理一、实验室要求：1.实验室环境应清洁、卫生、安静，实验室内严禁吸烟和饮食。

2.实验人员必须穿戴工作衣帽，工作服经常洗涤、消毒、保持清洁。

3.操作前后或离开实验室必须用肥皂或消毒液洗手。

4.发生菌液污染台面或地面，应立即用3%甲醛或5%碳酸等消毒液由外向内倾覆其上，1小时后再擦拭，如为破伤风梭菌，则应隔夜后再擦洗。

5.工作衣、帽、口罩受到菌液污染时，应立即脱下使污染部位包裹在内部，高压灭菌后再清洗。

6.如有传染性培养物污染手部，应先用75%乙醇棉球擦拭，再浸入01新洁尔灭消毒液内泡手，然后再用肥皂及清水彻底洗干净。

7.接种环(针)，每次使用前后，必须通过火焰灭菌，冷却后方可接种培养物，接种带有蜡质、油质的培养物或菌苔残留多时，不应立即在火焰上灼烧，应先在内焰里将油质培养物烘干后再移至火焰上灭菌，以免活菌外溅污染环境及感染操作者。

8.带菌的吸管应浸泡在5%甲酚消毒液内24h后取出清洗，带菌的试管或培养物应在121℃高压灭菌后再取出清洗。

9.在接种霉菌、放线菌时应在铺有浸过消毒液的纱布上操作，防止孢子散落传播。

10.凡带活菌的物品，必须消毒后才能清洗，严禁污染下水道。

二、无菌操作要求:无菌操作是指在无菌的环境条件下，使用无菌器材，防止微生物污染的操作技术。

即保持待检样品在操作时不被污染，又要防止被检的微生物及阳性对照菌在操作中污染环境或感染操作人员。

从事无菌及微生物操作的工作人员必须经过无菌技术及基础微生物学专业知识的学习及培训才具备上岗操作的资格，微生物专业检验人员也不应该频繁地变换工作岗位。

1.无菌室应每次使用前后用0.1%新洁尔灭消毒液或2%甲醛液擦拭工作台面及可能污染的死角，湿拖地面，打开无菌空气过滤器及超净工作台的开关30分钟，紫外线杀菌灯照射1小时。

2.操作人员用肥皂洗手后进入缓冲间换拖鞋，用75%乙醇棉球擦手，穿戴工作衣帽、口罩。

将所需物品剥去牛皮纸及外包装，从传递窗移入操作间，再用01新洁尔灭泡手后进入操作间，在乙醇(或煤气灯)火焰区(火焰高度3-5cm)操作。