HPLC测定白兰地中的氨基甲酸乙酯

选定方法 １ 所设置的流动相梯度为最优方法。应用方 法 １ 通过加标法，可知氨基甲酸乙酯的保留时间为 １９．９２ｍｉｎ，
见图 １Ｂ。 ２．１．２ 荧光反应时间的选择
不同荧 光 反 应 时 间 的 图 谱 见图 ２，其中 Ａ 为荧光 反应时间 ３ｍｉｎ 时的色谱图。反应时间为 ５ｍｉｎ、７ｍｉｎ、 １０ｍｉｎ 的 谱图无显著差别，见图 ２Ｂ。因此，荧光反应时 间选定为５ｍｉｎ。
早在 ２０ 世纪 ４０ 年代，ＮＥＴＴＬＥＳＨＩＰ 实验证明了氨 基甲酸乙酯（ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ，ｅｔｈｙｌ ｕｒｅｔｈａｎｅ，ｃａｒｂａｍｉｃ ａｃｉｄ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ，简称 ＥＣ）具有致癌作用，如可以引起肺肿瘤、 淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。氨基甲酸乙酯不仅是烟草叶及 香烟的天然成分，也是发酵食品（如面包，酸牛奶，乳酪、酱 油等）和酒精饮料（如葡萄酒、苹果酒、中国黄酒和日本清 酒等）的副产物之一。人体摄取氨基甲酸乙酯主要是通过 饮用酒精饮料，酒中的氨基甲酸乙酯是一种外因性内分泌 紊乱物质［１］。调查显示，如果饮用氨基甲酸乙酯含量＞ ３０× １０－６ｇ／Ｌ 的酒，人饮用后患癌的机率大大增加。根据加利福 尼亚环保机构的一项统计数据得知，假设每个人患癌症 的几率为 １×１０－５，可推断这个人氨基甲酸乙酯的摄入量大 约为 ０．７μｇ／ｄ［２－３］。可见氨基甲酸乙酯又是危害人类健康的 一个不可忽视的因素。
Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＨＰＬＣ－ＦＬＤ ｉｓ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ ｉｎ ｂｒａｎｄ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ： ｔｈｅ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｌｉｇｈｔ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ２３４ ｎｍ， ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ６００ ｎｍ； ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｏｆ ｆｌｏｗ ０．８ ｍＬ／ｍｉｎ； ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｇｒａｄｓ （０￣１０ ｍｉｎ， Ａ ｐｈａｓｅ ５５％， Ｂ ｐｈａｓｅ ４５％； １０￣３５ ｍｉｎ， Ａ ｐｈａｓｅ ５０％， Ｂ ｐｈａｓｅ ５０％； ３５￣４０ ｍｉｎ， Ａ ｐｈａｓｅ ０％， Ｂ ｐｈａｓｅ １００％）； ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｉｓ ５ ｍｉｎ． Ｍｏｒｅｏｖｅｒ， ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＨＰＬＣ－ＦＬＤ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＧＣ／ＭＳ ｍｅｔｈｏｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ； ＨＰＬＣ； ９－ｘａｎｔｈｙｄｒｏｌ； ＧＣ／ＭＳ
初步选定 ３ 种方法进行对比实验，各方法间的区别在于 流动相的配比不同，具体方法见表 １。
表 １ ３ 种高效液相色谱流动相梯度的方案
Ｔａ ｂｌｅ １． Ｔｈｒｅ ｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｍｅ ｔｈｏｄ ｏｆ ＨＰ ＬＣ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａ ｓ ｅ ｇｒａ ｄｓ
项目
时间／ｍｉｎ

流速／ （ｍＬ·ｍｉｎ－１）
行对比实验。 １．３．４ ＥＣ 的定性、定量方法
氨基甲酸乙酯的定性应用加标的方法，定量应用外标法。 １．４ 用于 ＧＣ／ＭＳ 方法的样品前处理
参照进出口商品检验行业标准 ＳＮ ０２８５－９３－ 出口酒 类中氨基甲酸乙酯残留量的标准方法并进行了改进。取 １０ｍＬ 白兰地，放入分液漏斗中，加入蒸馏水调整乙醇含 量至 ２５％（ｖｏｌ）。加入氯化钠摇动 ２ｍｉｎ￣３ｍｉｎ，使其饱和。加 入等量二氯甲烷振摇 ３ｍｉｎ，静置分层，取有机相。水相再 分别用等量的二氯甲烷萃取 ２ 次，合并有机相。再用装有 １０ｇ 无水硫酸钠的玻璃柱脱水。然后加入 ２ｍＬ 乙酸乙酯， 旋转蒸发器在 ３０℃水浴上浓缩为 １．５ｍＬ￣２ｍＬ，再用乙酸乙 酯定容至 ３ｍＬ，即可进色质联用仪分析，进样量为 １μＬ。 １．５ ＧＣ／ＭＳ 中 ＥＣ 的定性方法和色谱条件
白兰地原酒（１９９６ 年、１９９７ 年、１９９８ 年、１９９９ 年、２０００ 年、２００２ 年、２００３ 年、２００４ 年、２００５ 年原酒）：均采集于王 朝葡萄酒厂，将其按顺序编为 １ 号 ￣９ 号。 １．２ 试剂与仪器
乙腈、甲醇为色谱纯；氨基甲酸乙酯（纯度 ９９．９％）：美 国 Ｓｉｇｍａ 公 司 ；９－ 羟 基 吨（色谱纯纯度≥９９．０％）：Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ；醋酸钠、盐酸、无水乙醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸 乙酯、氯化钠、无水硫酸钠均为分析纯；实验用水为娃哈哈 纯净水。
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ（ＥＣ） ｉｎ ｂｒａｎｄｙ ｂｙ ＨＰＬＣ
ＧＡＯ Ｎｉａｎｆａ， ＢＡＯ Ｊｕｈｕａ， ＳＵＮ Ｘｉａｏｗｅｎ， ＺＨＡＮＧ Ｊｉａｎ， ＧＵＯ Ｙｕｔｉｎｇ （Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５７， Ｃｈｉｎａ ）
收稿日期：２００７－１０－１２ 作者简介：高年发（１９４５－）男，江苏吴江人，教授，主要从事有机酸发酵和葡萄酒酿造工艺的研究工作。
分析与检测
中国酿造
２００８ 年 第 １３ 期
总第 １９０ 期 ·８５·
１．３ 高效液相色谱中参数的研究 １．３．１ 液相色谱的检测条件
色 谱 柱 ：４．６ｍｍ（内 径）×２５０ｍｍ，ｉ．ｄ，５μｍ；流 动 相 Ａ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ 醋酸钠溶液（ｐＨ７．２）；流动相 Ｂ：乙腈；荧光 检测中入射光波长为 ２３４ｎｍ，发射光波长为 ６００ｎｍ，进样 量为 １０μＬ。 １．３．２ 流动相梯度的优化
图 １ ３ 种方法流动相梯度的液相色谱图 Ｆｉｇｕｒｅ １． Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａ ｔｏｇｒａ ｍ ｏｆ ｔｈｒｅ ｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａ ｓ ｅ ｇｒａ ｄｓ
对比图 １Ａ、Ｂ 可知，方法 １ 中 Ｂ 在约 ２０ｍｉｎ 处有一明 显的色谱峰（图中箭头所示）与 Ａ 不同，方法 ２、３ 中 Ｃ、Ｄ、 Ｅ 、Ｆ 图没有 明 显 的 差 别 ，无 法 判 断 氨 基 甲 酸 乙 酯 的 色 谱 峰位置。
１ 材料与方法 ９－ 羟基吨和 ＥＣ 在酸性条件下生成可产生荧光的
Ｘａｎｔｈｙｌｕｒｅｔｈａｎｅ 物质。
９－ 羟基吨
氨基甲酸乙酯
Ｘａｎｔｈｙｌｕｒｅｔｈａｎ
取 ５００μＬ 样 品 和 １００μＬ ９－ 羟 基 吨 溶 液 ，加 入 ５０μＬ１．５ｍｏｌ／Ｌ 浓度为的 ＨＣｌ 在黑暗中反应。反应后的溶 液为待测样。 １．１ 材料
按 ３ 种方法所做出的液相色谱图见图 １。Ａ、Ｂ 为方法 １，Ｃ、Ｄ 为方法 ２，Ｅ、Ｆ 为方法 ３；Ａ、Ｃ、Ｅ 为空白，Ｂ、Ｄ、Ｆ 为 ５０μｇ／Ｌ 氨基甲酸乙酯。
２００８ Ｎｏ．１３
·８６· Ｓ ｅｒｉａｌ Ｎｏ．１９０
Ｃｈｉｎａ Ｂｒｅ ｗｉｎｇ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ
Ａ 醋酸钠／％
Ｂ 乙腈／％
０
０．８０
５５
４５
１０
０．８０
５０
５０
方法１
３５
０．８０
０
１００
４０
０．８０
０
１００
０
０．８０
５５
４５
１０
０．８０
５０
５０
方法２
２５
０．８０
３０
７０
３５
０．８０
０
１００
４０
０．８０
０
１００
０
０．８０
５０
５０
方法３
３０
０．８０
０
１００
３５
０．８０
０
１００
１．３．３ 荧光反应时间的选择 将荧光反应时间选定为 ３ｍｉｎ、５ｍｉｎ、７ｍｉｎ、１０ｍｉｎ，进
用甲醇溶解的标准品的特征碎片离子质谱图和 ＥＣ 的保留时间，对 ＥＣ 定性。
色谱柱：３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）×０．２５μｍ（膜厚）。载气： 氦气，１０．２ｍＬ／ｍｉｎ；色谱温度：从 ８０℃开始升温，以 ３℃／ｍｉｎ 升温至 １５０℃维持 ２ｍｉｎ，再以 １０℃／ｍｉｎ 升温至 ２５０℃维持 ２ｍｉｎ；进样口温度 ２８０℃；检测器温度 ２００℃；进样方式：分 流进样，分流比为 ５；质谱采集方式：选择离子监视；选择 离子：Ｍ／Ｚ ，６２。 ２ 结果与讨论 ２．１ ＨＰＬＣ 方法的优化 ２．１．１ 高效液相色谱中流动相梯度的选择
ＲＳＤ／％
０．７１
０．３３
０．２２
０．２３
由表 ２ 可知，日内的相对标准偏差 ＲＳＤ 为 ０．７１％、
０．３３％、０．２２％、０．２３％，日间相对标准偏差 ＲＳＤ 为 ３．０６％。 将标准品溶解于 ９ 号白兰地样品中，使样品中含有的
标准品浓度分别为 １０μｇ／Ｌ、２０μｇ／Ｌ、５０μｇ／Ｌ、８０μｇ／Ｌ，编号 为 １＃、２＃、３＃、４＃。再对白兰地样品进行检测得到的结果见表 ３。由表 ３ 可知样品中添加氨基甲酸乙酯标准溶液回收率 为 ９３．０％￣１０７．０％。
近年来有很多学者在氨基甲酸乙酯的测定方面做了 大量的研究工作。测定方法也多种多样，包括：ＧＣ／ＦＩＤ，气 象色谱 ／ 热离子检测器法［４］、二氯甲烷萃取与 ＧＣ／ＭＳ［５］、固 相微萃取与 ＧＣ／ＭＳ［６］、用二维或多维色谱 － 稳定同位素稀 释质谱联用技术［７－８］、ＨＰＬＣ－ＦＬＤ［９－１０］等。其中，利用二氯甲烷 对样品进行萃取，结合气相色谱与质谱检测器的方法是我 国进出口商品检验行业标准 ＳＮ ０２８５－９３— ——出口酒类中 氨基甲酸乙酯残留量的标准方法。ＨＰＬＣ 结合荧光检测的 方法（ＨＰＬＣ－ＦＬＤ）解决了样品处理过程复杂、效率低下等 弊端。本文旨在研究 ＨＰＬＣ－ＦＬＤ 与 ＧＣ／ＭＳ 相比的优劣， 以确定 ＨＰＬＣ－ＦＬＤ 方法在国内实际应用的可能。